马尔尼菲青霉菌鉴定要点及该菌酵母相体外药敏分析

目的了解马尔尼菲青霉菌(PM)鉴定要点及该菌酵母相体外药敏结果,以指导临床合理用药。方法收集某院2009—2016年23例PM感染患者血或骨髓的分离株,观察其菌落形态,采用E-test法分析酵母相PM对伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑的药物敏感性。结果 PM形态:组织标本瑞氏染色直接镜检,可见典型卵圆形或圆形有明显横隔的孢子,常位于巨噬细胞内;血培养标本革兰染色镜检,可见菌体两端钝圆略弯曲呈腊肠样,偶有分枝状,可见有横隔。PM为双相型真菌,28°C为菌丝相,产生红色色素扩散入培养基中;35°C为酵母相,并有各自典型的菌落形态特征。伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑对酵母相(35°C)PM的最低抑菌浓度(MIC)范围分别为0.002~0.016、0.012~0.125、0.002~0.500、0.500~16.000μg/m L。结论 PM的特征性菌落形态,以及骨髓和外周血发现的真菌孢子对该菌有诊断价值。该菌对伊曲康唑敏感性最强,其次是伏立康唑、两性霉素B,而氟康唑敏感性相对较弱。     

逆转录荧光PCR鉴定活性铜绿假单胞菌方法的建立

目的:建立快速检测和甄别铜绿假单胞菌死活状态的定量方法。方法:根据铜绿假单胞菌gyrB基因序列设计引物和探针;提取铜绿假单胞菌菌体总RNA,采用一步法逆转录实时荧光定量PCR反应液对其进行检测。评价逆转录实时荧光定量PCR方法的特异性和敏感性,对收集的临床病人样本和模拟样本进行检测。结果:本试验建立的逆转录实时荧光定量PCR方法能特异、准确、快速的鉴定铜绿假单胞菌菌体死活状态,敏感度达102cfu/m l。临床标本检测结果与细菌培养结果具有较高一致性。10份模拟样本鉴定结果也完全一致。结论:一步法逆转录实时荧光PCR方法能够有效快速检测铜绿假单胞菌,并能甄别死活状态。     

艾滋病合并马尔尼菲青霉菌感染的实验室检测

目的 明确从AIDS患者血液、骨髓中检出的病原体为马尔尼菲青霉菌.方法 取患者血液、骨髓于血培养瓶中置Bacter/Alert 3D血培养仪中培养,待血培养仪报阳性即作革兰染色,并转种至马铃薯斜面培养基于27℃和37℃孵育,观察真菌生长情况及菌落形态,并作乳酸棉兰染色于显微镜下观察菌体特征.结果 该菌为一双相真菌,27℃见菌丝相,呈淡黄色绒毛样,并产生酒红色色素,镜下可见典型的帚状枝及孢子链;37℃见酵母相,不产生特征性色素,镜下见酵母样细胞.结论 从体内分离出马尔尼菲青霉菌,即可诊断为马尔青霉菌病,也可排除组织胞浆菌感染.     

实时荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定及筛选中的应用

目的在沙门菌鉴定中运用taqman技术建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法,并考评该方法的特异性、灵敏度、抗干扰性及重复性。方法根据沙门菌GenBank Accession NO DQ644631基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。建立实时荧光定量PCR反应体系,用沙门菌各种型别对该方法进行考评。结果实时荧光定量PCR技术在沙门菌鉴定中有良好的特异性、极高的灵敏度、较强的抗干扰性及重复性。结论在沙门菌的鉴定和筛选中实时荧光定量PCR方法准确、快速、简便,有很好的应用前景和研究价值。     

艾滋病并发马尔尼菲青霉病的真菌培养与鉴定

目的：明确并检出继发于艾滋病的马尔尼菲青霉病的病原体马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei,PM）。方法：取患者骨髓、血液、皮损分泌物等接种于沙保弱培养基上，分别于25℃和37℃孵育，观察PM生长情况及菌落形态，并涂片、固定、染色，显微镜下观察菌体特征。结果：PM为双相性真菌，于25℃为青霉相，产生具有特征性的红色可溶性色素弥散于基质中，镜下可见典型的帚状枝；37℃为酵母相，无色素产生，镜下可见酵母样孢子，形似腊肠。本菌株与国际标准株ATCC24100扩增片段相同。结论：马尔尼菲青霉病诊断的金标准是从患者体内分离出PM，关注艾滋病与马尔尼菲青霉病的相关性，对及时确诊艾滋病具有重要意义。     

实时荧光定量PCR检测沙门菌方法的实验研究

目的:建立沙门菌实时荧光定量PCR快速检测方法,探讨沙门菌在食源性感染快速诊断中的应用价值。方法:采用沙门菌fimY基因序列设计特异引物和探针,建立实时荧光实时定量PCR技术检测沙门菌的检测方法。通过特异性、敏感性、稳定性和重复性,以验证方法的可行性。结果:成功构建了沙门菌重组质粒标准品,为方法学建立奠定基础;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性,最低检测限为103拷贝/ml,相当于100 cfu/ml的菌细胞,并有良好的稳定性和重复性。结论:沙门菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本检测。     

实时荧光定量PCR快速检测人鼻病毒

目的应用实时荧光定量PCR方法快速检测HRV,为HRV实验室早期诊断、HRV流行病监测和应急处理提供快速诊断手段。方法以HRV的5'UTR为检测靶基因,设计引物和探针,评价方法的特异性、灵敏性和重复性,并用该方法对384份临床呼吸道感染样本进行检测。结果以HRV、H1N1、Hco V、流感等病毒进行实时荧光定量PCR,只有HRV出现荧光信号,证明该法特异性强;以已知浓度HRV标准品稀释后进行实时荧光定量PCR,灵敏性达10 copies/μl,重复性试验Ct平均值变异系数0.58%~2.41%,384份临床样本中检测HRV阳性为21份,检测耗时比传统方法短。结论 HRV实时荧光定量PCR法有着快速、敏感、特异性强等优点,适用于HRV早期诊断、分子流行病学调查研究。     

脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法建立及评估

目的 建立脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法,为快速、准确检测脑膜炎奈瑟菌提供有效的手段.方法 选用脑膜炎奈瑟菌夹膜转运基因ctrA作为靶基因,设计合成引物和探针,建立脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法.并对该方法的特异性、敏感性、可重复性等进行方法学评价.结果 采用该方法对流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺...     

复合探针荧光定量PCR法检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的建立用复合探针荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。方法研究根据鼠疫耶尔森氏菌pla基因的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,用于鼠疫的筛选和诊断。结果该检测方法的特异性为100%,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×101~1×106拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×102cfu/ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定3次及同一时间5次重复实验结果Cv值均<5%。结论本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法,可对鼠疫耶尔森氏菌进行快速检测、准确辨别和早期诊断,对鼠疫的早期快速诊断具有重要意义。     

实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的：建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法：针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果：应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论：该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.     

汉坦病毒S片段标准品构建及在荧光定量PCR检测中的应用

[目的]构建汉坦病毒S片段标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法检测汉坦病毒核酸.[方法]对76-118株的S片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-TVector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量.在S片段的保守区设计引物和TaqMan探针,对real-time PCR条件进行优化,并提取急性期发病病人总RNA,逆转录为cDNA,与标准品同时检测.[结果]该方法制备的质粒标准品应用于汉坦病毒早期检测,能对检测样品进行质量控制;应用荧光定量PCR检测急性期病人病毒含量,具有高特异性和灵敏度,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右,重复性好,并能对病毒准确定量.[结论]汉坦病毒荧光定量标准品和TaqMan荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适用于汉坦病毒的早期检测;汉坦病毒S片段编码的核衣壳蛋白(NP)是流行性出血热早期诊断的理想抗原.     

基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型基因检测

目的 建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病58型基因检测体系，用于其快速检测和早期诊断。 方法 运用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V5, 针对人乳头瘤病毒58型的L1区域保守基因设计引物，在反应前加入荧光核酸染料SYBR Green Ⅰ，并对该反应体系中的dNTPs、Mg2+和内引物（FIP、BIP）浓度进行优化,优化结果通过“S”型扩增曲线判断，并对优化后的实时荧光环介导等温扩增体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。 结果 针对人乳头瘤病毒58型所建立的实时荧光环介导等温扩增检测体系具有良好的特异性及灵敏度，且与临床实验室检测结果（qPCR方法）的符合率达100%，该检测方法的灵敏度可达10拷贝/μL。 结论 本研究建立了人乳头瘤病毒58型的实时荧光环介导等温扩增检测体系，它是一种耗时少、操作简便、特异性强、灵敏度高的方法，适用于HPV临床样本的快速检测。     

斑点热群立克次体实时荧光定量PCR检测方法的 建立及应用

摘要:目的　探讨实时荧光定量PCR快速检测斑点热群立克次体标本的应用价值。方法　根据斑点热群立克次体外膜蛋白A（OmpA）基因保守序列设计TaqMan特异性探针和引物,进行实时荧光定量PCR方法学评估,并同时运用该法和普通PCR法对对海南省2012年不明原因发热病人157份血标本进行斑点热群立克次体的检测及结果分析。结果　本研究建立的定量标准曲线循环阈值（Ct值）和模板拷贝数呈良好的线性关系（R2值为0.998）。该法能检出斑点热群立克次体阳性标准品—西伯利亚立克次体（R.sibirica）最小浓度为102 copies/μl,灵敏度比普通PCR高100倍。用该法检测斑点热群立克次体DNA,结果为阳性,检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、致泻性大肠埃希菌和副溶血弧菌等其他病原细菌DNA结果均为阴性。采用实时荧光定量PCR法对实验室库存的发热病人血标本DNA进行回顾性检测,结果示阳性2例,检出率为1.2%（2/157）,而普通PCR检测结果均为阴性。结论　实时荧光定量PCR法具有快速、特异和灵敏的优点,在处理突发公共卫生事件中可发挥快速检测的优势,在斑点热诊断中具有重要的临床意义。     

金黄色葡萄球菌荧光定量PCR计数法的建立

目的建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法,用于对金黄色葡萄球菌计数。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列(GenBank:DQ399678.1),设计并合成引物和荧光标记探针,建立和优化反应体系,用已知浓度的金黄色葡萄球菌DNA模板作为外部参照,建立标准曲线。用加入金黄色葡萄球菌的模拟牛奶样品,把Baird-Parker平板计数结果和PCR定量检测结果进行比较,以评价体系性能。结果平板计数和荧光定量PCR的检测结果做比较,采用配对t检验,t=0.58,v=32,P0.05,其结果差异无统计学意义。结论所建立的金黄色葡萄球菌荧光定量PCR计数法,操作较传统的方法简单直接,能有效地缩短整个检测的时限,并有较好的灵敏度和特异性,与传统方法相比,有较明显的优势。     

2009—2010年秦皇岛市手足口病病原学监测结果

目的了解2009—2010年秦皇岛手足口病病原学和流行特征,为手足口病防治提供科学依据。方法对首诊256例手足口病患者采集标本,分别用肠道通用病毒PE、EV71和CA16进行实时荧光定量PCR病毒核酸检测。结果 256例被检测患儿中187例为PE肠道病毒阳性,阳性率为73.05%,EV71阳性为101例,阳性率为39.45%;CA16阳性为46例,阳性率为17.97%。2009年EV71阳性率为65.35%(82/127),2010年EV71阳性率为14.73%(19/129),2009年EV71阳性率高于2010年(χ2=66.5635,P<0.01),差异有统计学意义。手足口病发病与性别无关。病毒检测阳性的147例患儿中,6岁以下患者132例,占构成比89.80%。结论秦皇岛儿童手足口病病原体以EV71和CA16为主,2009年和2010年相比流行优势型别不同,2009年以EV71型为主,手足口病6岁以下儿童多发。     

呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR的检测

目的 建立多重实时荧光定量PCR检测方法,为实现对呼吸道病原体的快速、灵敏特异性检测.方法 采用经报道的引物和探针对合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道病原体进行多重实时荧光定量PCR检测.结果 多重荧光定量PCR阳性检测率高达57.8%,无假阳性及假阴性,特异性强.结论 多重实时荧光定量PCR具有经济、快速、特异性强等优点,在呼吸道病原体检测方面有巨大应用价值.     

实时荧光PCR快速检测粪便中艰难梭菌方法

目的:建立实时荧光PCR快速检测艰难梭菌的方法。方法:以艰难梭菌磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的保守序列为模板设计和合成特异性引物和荧光标记探针,建立实时荧光PCR检测体系,通过检测含有艰难梭菌标准菌株浓度为106-10 CFU/ml的细菌培养物及加标模拟样本进行敏感性分析,并对其特异性和干扰性进行评价。结果:该方法只对艰难梭菌进行特异性扩增,其他常见的病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要2 h,对艰难梭菌菌悬液可检测至10 CFU/ml细菌,对加标粪便样本可检测至1000 CFU/ml细菌。结论:本研究建立的实时荧光PCR检测艰难梭菌方法具有快速、特异、敏感性高等优点,能实现对艰难梭菌的快速检测。     

实时荧光定量RT-PCR技术在手足口病疫情监测中的应用

[目的]对手足口病患者标本进行病毒核酸检测,探讨实时荧光定量RT-PCR方法在手足口病疫情监测中的意义。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR方法对2010年3～8月连云港市采集的307份手足口病患者标本进行肠道病毒核酸检测,并对肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行分型。[结果]307份手足口病患者标本中有221份肠道病毒核酸阳性,阳性率71.99%,其中EV71型病毒核酸阳性标本123份,阳性率40.07%,CVA16型病毒核酸阳性标本66份,阳性率21.50%。[结论]实时荧光定量RT-PCR方法耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为手足口病疫情监测的诊断方法。     

裂谷热病毒荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,用于裂谷热病毒的检测。方法通过序列对比在裂谷热病毒L基因保守区设计引物及Taqman探针,建立实时荧光定量PCR反应体系。结果经优化的荧光定量PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒标准品的灵敏度可达37拷贝/μl,通过检测同为蚊媒传播的日本脑炎病毒、黄热病毒、登革病毒、基孔肯亚病毒无交叉反应。结论本方法的建立在国境口岸传染病的防控方面有较好的应用前景。