腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

双基因共表达腺相关病毒穿梭质粒的构建与鉴定

目的 合成和筛选nogc66-siRNA干扰片段,克隆神经生长因子-β(NGF-β),构建含nogu66-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒.方法 设计针对nogo66的siRNA,插入载体pGenesil-1.1,转染大鼠胶质瘤C6细胞,通过RT-PCR和Western-blot检测筛选有效的干扰质粒;培养人MI-Apaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人NGF-β基因,插入T-easy载体;将pGenesil-1.1与pAAV-MCS进行重组,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;将nogo66-siRNA和NGF-β分别插入pAAV-U6/CMV-EGFP中,构建含nogo66-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒.结果 干扰质粒pGenesil-nogo66-siRNA测序显示干扰序列正确;RT-PCR结果显示转染后各条带相对亮度有差异,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1和pGenesil-nogo66-siRNA-2使nogo基因表达降低;Western-blot结果显示转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使NOGO蛋白表达下降73%,转染pGenesil-nogo66-siRNA-2使NOGO蛋白表达下降78%,与未转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05);质粒T-easy-NGF-β酶切可见3000 bp、736 bp条带,测序显示基因序列正确;酶切pAAV-U6/CMV-EGFP、pAAV-U6-nogo66-siRNA/CMV-EGFP可见4300 bp、800 bp条带,转染细胞后均可见绿色荧光蛋白表达;酶切pAAV-U6/CMV-NGF-β、pAAV-U6-nogo66-siRNA/CMV-NGF-β可见4300 bp、736 bp条带;质粒pAAV-U6βnogo66-siRNA/CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列止确.结论 成功构建了含有nogo66-siRNA与NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒,为深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础.     

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

凋亡素重组腺相关病毒的构建及体外抑制膀胱癌效应

目的 探讨携带凋亡素基因的重组腺相关病毒构建方法,观察其体外抑制膀胱癌的效应.方法 构建重组质粒pAAV-VP3,经EcoRI/Sal Ⅰ双酶切鉴定和基因测序无误后,采用三质粒共转染法包装重组腺相关病毒rAAV-VP3.收获病毒后聚合酶链反应(PCR)扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒,对其进行纯化后透射电镜观察病毒颗粒,并检测病毒滴度.按每个细胞5×105个载体基因组的剂量感染EJ细胞后,逆转录(RT) -PCR检测VP3基因在EJ细胞中的转录,Western blot法检测凋亡素蛋白的表达.透射电镜扫描观察感染重组病毒后肿瘤细胞的超微结构变化,流式细胞术(FCM)检测重组病毒对EJ细胞的影响.结果 转染72 h后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功,滴度为5.1×1011个载体基因组/ml,电镜下可见病毒颗粒.感染EJ细胞后,可检测到VP3基因的转录和凋亡素蛋白表达,电镜观察到凋亡形态学改变,FCM检测S期细胞比例降低和G2/M期细胞比例增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 重组腺相关病毒rAAV-VP3在体外能够发挥生物学活性,其介导的凋亡素表达抑制膀胱癌的体外效应为体内实验奠定了基础.     

重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人骨形成蛋白4（human bone morphogenetie protein4，hBMP-4）基因腺相关病毒载体。方法 根据hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入Sal Ⅰ位点，以EX-A0242M01hBMP4为模板扩增目的基因。将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中，获得重组质粒pUCl8hBMP-4。然后用EcoRⅠ与Sal Ⅰ酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV，回收酶切片段，T4DNA连接酶16C过夜，转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ双酶切鉴定，并行全基因测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HsV1-rc／△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4。行DNA点杂交法测定病毒滴度，SDS-PAGE分析判断病毒纯度。结果 PCR电泳及酶切鉴定表明，pSNAV-hBMP-4重组成功，基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1．5×10^12μg／ml，分泌蛋白浓度为0．124mg／ml，病毒载体纯度在95％以上。结论 实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，可以满足骨组织工程的需要。     

重组腺相关病毒介导的血红素加氧酶1基因和绿色荧光蛋白基因在肝移植大鼠肝脏中的表达

目的 构建提纯重组腺相关病毒介导的血红素加氧酶1基因(HO-1)和绿色荧光蛋白基因(GFP),并探讨其在肝移植大鼠肝脏中的表达情况.方法 克隆大鼠HO-1,构建重组腺相关病毒-HO-1(rAAV-HO-1)载体,酶切鉴定并进行测序,氯化钙共沉淀法与辅助质粒Virus helper、AAV-cap-rep转染包装细胞,应用肝素层析柱法纯化浓缩病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度.应用二套管法建立Wistar→Wistar大鼠原位肝移植模型.将提纯的重组腺相关病毒-GFP(rAAV-GFP)在供肝冷保存阶段经门静脉靶向转染并孵育2 h后行大鼠原位肝移植,分别于术后1、3个月处死大鼠取材,冰冻切片荧光显微镜下观察不同组织GFP的表达情况及转染效率.结果 rAAV-HO-1重组子经酶切电泳检测表明插入片段大小正确,测序结果与Genbank一致.rAAV-GFP靶向转染供肝1、3个月冰冻切片荧光显微镜下观察,移植肝GFP表达效率均＞80%,且在心、肺、脾、肾、肠等组织中未见报告基因的表达.结论 成功构建并提纯了携带HO-1、GFP基因的高滴度的腺相关病毒,验证了腺相关病毒介导的GFP在肝移植大鼠肝脏中稳定高效的表达.     

携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带小鼠白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体,研究肝脏Hepa l石细胞的IDO基因mRNA及蛋白表达情况.方法 酶切含有小鼠全长IDO cDNA的IDO质粒,亚克隆至穿梭载体pAdTrack.ALB上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,生成并筛选阳性克隆,测序、鉴定正确后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,检测病毒滴度,RT-PCR和荧光显微镜鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达.重组腺病毒进一步感染Hepa 1-6细胞,RT-PCR和WesternBlot法分别检测IDO基因在细胞内表达情况.结果 经酶切及测序证实携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,病毒感染滴度为2.9×10~6pfu/ml.感染Hepa 1-6细胞后,RT-PCR和Western Blot可以检测到IDO mRNA水平和蛋白水平表达.结论 构建了携带白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体.     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

AAV-TGFβ1的构建及其与AV-TGFβ1对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较

目的探讨转化生长因子β1腺相关病毒表达系统(AAV-TGFβ1)的构建及其与转化生长因子β1腺病毒表达系统(AV-TGFβ1)对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较。方法采用PCR技术扩增转化生长因子β1(TGFβ1)基因,并于其两端分别连接EcoRI和SalI酶切位点。将TGFβ1基因亚克隆于腺相关病毒(AAV)载体中,并经酶切和测序分析进行鉴定。AAV-TGFβ1病毒被包装并转染H293细胞,通过免疫荧光检测AAV介导的目的基因表达。利用AAV-EGFP病毒检测AAV对髓核细胞的转染效率。AAV-TGFβ1和AV-TGFβ1分别转染髓核细胞后,通过Antonopulos法检测蛋白多糖的合成。结果测序分析证明TGFβ1序列与NCBI Gene Bank所报道的一致。经酶切鉴定证实AAV-TGFβ1重组质粒被成功构建。AAV可介导TGFβ1高效表达并高效转染髓核细胞。AV-TGFβ1可快速一过性地促进髓核细胞蛋白多糖合成,而AAV-TGFβ1可稳定促进蛋白多糖合成。结论AAV-TGFβ1病毒被成功构建并可稳定地促进髓核细胞蛋白多糖的合成。     

白细胞介素-10腺病毒载体制备及其在血管平滑肌细胞的表达

目的构建人白细胞介素(human interleukin,hIL)-10和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)双表达腺病毒载体,观察目的基因在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的表达。方法以T载体(pUCm-T/hIL-10cDNA)为模板,PCR扩增hIL-10cDNA,连入穿梭质粒,卡那霉素抗性筛选,NotⅠ、XholⅠ酶切鉴定,测序,局部序列搜索工具(BLAST)分析序列正确,PmeⅠ酶切,电穿孔单独转化BJ5183-AD-1,转化XL10-Gold扩增,PacⅠ酶切,AD-293细胞包装,PCR鉴定,测定病毒滴度,脂质体介导转染VSMCs,荧光显微镜下观察GFP的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中hIL-10的含量。结果重组穿梭质粒构建正确,同源重组后PacⅠ酶切获得30kb和3kb片段,重组病毒滴度为3×1010efu/ml,PCR检测含目的基因,转染的VSMCs可见绿色荧光,hIL-10含量为25ng/106个细胞。结论构建的双表达载体于VSMCs成功表达,为血管内膜增生的基因治疗打下基础。     

体外利用慢病毒介导BMP-2基因诱导兔滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化

目的使用慢病毒介导兔BMP-2基因转染兔滑膜间充质于细胞（SMSCs）,检测其安全性,并在体外定向诱导至软骨细胞。方法通过构建包含BMP-2基因的慢病毒载体,转染SMSCs后行安全性分析;各项检测和MicroRNA分析判断转染后的SMSCs是否进入软骨细胞分化谱系。结果贴块法获得的SMSCs在经分离纯化后,表现出间充质干细胞应有的结构和表面标志物,具有多向分化潜能。增殖动力学、核型分析、致瘤型分析等证实被慢病毒转染的SMSCs安全。Westernblot、免疫荧光等证实且能稳定表达BMP-2蛋白。14d后,免疫组化、MicroRNA检测等证实在不需外加外源性BMP-2的体外环境下SMSCs可自发向软骨细胞分化。结论经重组慢病毒载体感染的兔SMSCs足够安全,能稳定表达BMP-2,体外能自发向软骨细胞分化。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2基因重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建人骨形成蛋白2(BMP2)基因重组腺病毒并在293E细胞中扩增制备重组病毒。方法自人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3-hBMP2中酶切出hBMP2基因，插入pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV—hBMP2，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化重组质粒并转染293E细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清感染293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带hBMP2基因的重组腺病毒载体，为进一步研究rBMP2基因治疗奠定了基础。     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因在骨髓基质细胞中的共表达

目的 观察骨形成蛋白(BMP)-2、转化生长因子(TGF)-β1双基因真核表达载体在骨髓基质细胞中的共表达.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1为模板,分别用引入新的酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增出1188 bp长度的BMP-2和1173 bp长度的TGF-β1两个目的 基因片段;依次将其定向克隆入真核双基因表达载体pIRES;酶切、分析及序列测定重组子:然后,用脂质体包裹转染骨髓基质细胞;荧光定量逆转录(RT)-PCR方法 检测BMP-2及TGF-β1基因的共表达情况.结果 双酶切可见1188 bp的BMP-2条带及核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-131构建正确,并在骨髓基质细胞中能同时高效表达BMP-2和TGF-β1 mRNA.结论 BMP-2和TGF-β1双基因真核载体能够在骨髓基质细胞中实现BMP-2和TGF-β1基因共表达.     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的 构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体.方法 按RNA提取试剂(TRIzol Reagent)说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA,克隆TGF-β1基因;经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK293细胞包装.获得高滴度病毒后,取上清检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察目的 基因的表达情况.结果 扩增出与预期大小一致的cDNA片段,其中TGF-β1大小为1173 bp;其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致.重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为1012 PFU/ml;病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示,绿色荧光蛋白随着时间的延长,表达量逐渐增高;与预期结果一致.结论 构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达,为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据.     

人IL-1受体拮抗蛋白重组逆转录病毒载体的构建、鉴定及在骨关节炎软骨细胞中的表达

目的 构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞,研究其相关特性.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定.实验分为3组未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达.结果 酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3 × 104 CFU/mL.原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒.RT-PCR结果显示在C组出现311 bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达.ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达.结论 构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据.     

pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能

目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态;用聚合酶链反应(PCR)扩增,将腺瘤息肉病(APC)基因截短的片段APC1克隆于T载体;同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300 bp截短片段kAPC亚克隆于pCGN-HAM-N1真核表达载体,得重组质粒pCGN-HAM-N1-kAPC;再运用双酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ同时酶切TA克隆、pCGN-HAM-N1-kAPC,将APC1片段插入载体pCGN-HAM-N1-kAPC,获含野生型全长APC基因重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC.用酶切,测序鉴定.脂质体法分别将含全长,截短的重组质粒,空载体与WNT信号系统的β-连环蛋白(β-catenin)、topflash和荧光素酶共同转染293T细胞,利用双荧光报告测试系统,检测转染后荧光素酶活性.结果 重组质粒经酶切其大小与预期一致,经测序比对证实与GeneBank中给出的序列一致.转染pCGN-HAM-N1-wcAPC组的荧光素酶活性明显低于转染空载体组pCGN-HAM-N1(P＜0.05).结论 含野生型全长9000 bp大片段APC基因分段成功插入pCGN-HAM-N1载体,带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC构建成功,pCGN-HAM-N1-wcAPC抑制T细胞因子/淋巴增强因子(Tcf/Lef)启动子的活性.