胶原生物衍生骨材料植入桡骨临界骨缺损的成骨能力

背景:各种基质材料单独应用时成骨能力有限,为增强材料的成骨能力,应用复合材料修复骨缺损是组织工程的发展方向.目的:探讨胶原生物衍生骨复合材料植入动物体内的成骨能力.设计、时间及地点:随机分组动物对照实验,于2004-01/04在四川大学华西医学中心组织工程实验室完成.材料:新西兰大白兔16只,制备兔桡骨中段1.5cm骨缺损模型.患者自愿捐献手术截除人体骨,I型胶原为美国Sigma公司产品.方法:按随机数字表法将模型兔分为2组,实验组和对照组,每组8只.手术截除人体骨经脱脂、脱细胞和脱蛋白后制备为单纯生物衍生骨支架.胶原真空吸附在单纯生物衍生骨支架内外制备胶原生物衍生骨材料.实验组兔桡骨缺损部位植入胶原生物衍生骨,对照组植入单纯生物衍生骨.主要观察指标:术后6,12周X射线观察和组织学检测缺损部位的成骨情况.结果:模型兔16只均进入结果分析.①X射线结果显示,术后12周实验组整个缺损区均可见到骨痂生成,成骨现象较术后6周更加明显,已明显形成骨缺损区的桥接.对照组仍仅在缺损两端有骨痂生成,缺损区中央部分无明显骨生成影像.②组织学结果表明,术后6周实验组在材料内部孔隙区可见到新生的类骨质形成,对照组缺损区没有骨组织形成,在支架材料的孔隙内有大量的纤维结缔组织充填;术后12周实验组可见大量的编织骨样组织,形成小梁样结构,对照组缺损区可见有骨样组织形成.结论:单纯生物衍生骨与胶原生物衍生骨材料均可促进骨再生,但胶原生物衍生骨材料成骨效果更好.     

构建自体骨碎末移植材料修复骨缺损的实验模型

学术背景:自体骨移植取材常需要开辟第二术区或在种植体周围取骨,额外增加创伤和感染机会,所以对局部小范围的骨质欠缺,可以考虑回收和利用预备种植体切除的自体骨末.目的:建立恢复种植体周围骨缺损的自体骨碎末骨移植材料的实验模型,观察材料与宿主的生物相容性反应.设计:单一样本观察.单位:大连医科大学口腔医学院.材料:实验于2005-08/2006-04在大连医科大学动物实验基地完成.实验动物为5只健康杂交家犬;种植体钛钉和Bio-Oss骨移植材料均由西安中邦钛生物材料有限公司设计制造并提供.方法:拔除家犬下颌第1,2,3前臼齿,3个月后行种植术.预备种植体窝,每只犬左右两侧各预备4个,共40个.在每个种植窝内,各植入种植体钛钉1枚,共40枚.用种植转孔时收集的自体骨碎末、Bio-Oss骨移植材料及两者1:1混合骨碎末恢复种植体颊侧单壁人为骨缺损,以未植骨作空白对照.主要观察指标: ①种植术后第9周时观察各组骨量的恢复情况、X射线片观察牙槽骨高度、骨小梁致密度及骨整合情况. ②应用亚甲基蓝-碱性品红法观察组织学变化.结果:5只家犬钛钉无脱落,均纳入结果分析. ①一般情况及骨缺损量:种植术后9周,创口愈合均良好,钛钉稳定,总存留率为100%.植入自体骨碎末的骨缺损量小于空白对照组(P＜0.01);植入混合骨碎末的平均骨缺损量最小,说明恢复最佳. ②骨量的恢复情况:X射线片显示40颗钛钉外周均与骨组织紧密接触,愈合良好. ③材料与宿主的组织相容性:低倍镜下见所有钛钉均被周围淡红色的致密骨组织紧密包绕,种植体与骨组织间无蓝色的软组织,产生了直接骨结合界面.结论:家犬建立自体骨碎末移植材料恢复种植体周围骨缺损的实验模型效果理想,材料与宿主间生物相容性好.     

聚乳酸/聚己内酯生物可降解人工骨复合骨形态发生蛋白2基因转染骨髓基质干细胞修复骨缺损的血管化过程

学术背景:组织工程骨植入体内后,再血管化是关系其能否充分发挥成骨作用,有效修复骨缺损的关键环节.目的:评价经骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞复合聚乳酸/聚己内酯人工骨修复兔桡骨缺损的血管化过程,观察骨形成蛋白2基因对促进移植骨血管化的影响.设计:随机对照动物实验.单位:实验于2005-01/12在中国医科大学中心实验室完成.材料:聚乳酸/聚己内酯生物可降解材料块由中国科学院长春应用化学研究所提供,孔隙直径150～250 μm,孔隙率90%以上;实验动物为3月龄新西兰大耳白兔60只.方法:60只新西兰大耳白兔双侧桡骨中段制成1.5cm骨缺损模型,随机分为4组,每组15只(30侧),植入经不同处理的人工骨.①AD-BMP-2组:转染骨形成蛋白2基因的细胞 聚乳酸/聚己内酯.②对照基因组:转染β-半乳糖酐酶基因的细胞 聚乳酸/聚己内酯.③未转染组:未转染细胞 聚乳酸/聚己内酯.④单纯聚乳酸/聚己内酯组:植入单纯聚乳酸/聚己内酯支架.主要观察指标:于术后4,8和12周行X射线片观察新骨形成情况,立体显微镜观察微血管分布,苏木精-伊红染色观察微血管与骨形成关系,透射电镜观察成骨细胞和血管内皮细胞间的联系,并行血管内皮生长因子表达检测及微血管计数.结果:①AD-BMP-2组术后4周时见移植骨内片状成骨影,有较多新生血管长入,支架孔隙内充满软骨痂,功能活跃的成骨细胞围绕微血管生长,血管内皮生长因子表达及微血管数均明显高于其他各组;术后8周时移植骨内成骨逐渐增多,微血管迂曲扩张并相互连接,软骨痂转变为小梁骨;术后12周时皮质骨连续,髓腔再通,微血管呈规则地纵向排列.②对照基因组和未转染组成骨能力较弱,血管再生缓慢,12周时骨缺损得到初步修复,微血管沿新生骨小梁孔隙分布.③单纯聚乳酸/聚己内酯组各时间点新生血管少见,术后12周时骨端硬化,缺损区被纤维组织填充.结论:骨形成蛋白2基因转染可通过上调血管内皮生长因子表达,间接诱导移植骨血管化,促进种子细胞的成活,加速新骨形成.     

纳米双相磷酸钙陶瓷组织工程支架复合大鼠自体骨髓基质干细胞修复极量颅骨缺损

背景:传统生物陶瓷材料作为组织工程支架材料的脆性大,不易加工成形且在体内降解困难,影响新骨的长入和后期的改建,故其应用受到一定限制.目的:观察纳米双相磷酸钙陶瓷(Biphasic calcium phosphate nanocomposite,NanoBCP)用于组织工程支架修复颅骨缺损的成骨性能.设计、时间及地点:随机分组、动物对照实验,于2004-09/2005-05在四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室完成.材料:选择2月龄雄性体健SD大鼠48只,体质量180～200 g,在颅骨上制成直径为8mm的颅骨全层缺损区为极量骨缺损模型,实验用孔径100～400 μ m,含孔率为60%～80%的NanoBCP陶瓷及SD大鼠自体骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供.方法:按随机数字表法将模型人鼠分为3组,NanoBCP/BMSCs组16只,BMSCs经含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导液培养后与NanoBCP复合植入SD大鼠颅骨缺损区;单纯NanoBCP组16只,仅在相同部位单纯植入NanoBCP支架材料:空白对照组16只不植入任何材料.主要观察指标:植入后4,16,24周取材,通过X射线片分析、大体和组织学观察评价其成骨性能.结果:SD大鼠48只均进入结果分析.①植入后4,16周,NanoBCP/BMSCs组新生骨组织逐渐增多,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性.植入后24周,NanoBCP,BMSCs组SD大鼠颅骨缺损完全修复,单纯NanoBCP组部分修复,空白对照组未修复.②植入后4,24周,NanoBCP/BMscs组骨缺损区X射线阻射影像密度逐渐增加,新骨充填,接近于正常骨;单纯NanoBCP组骨缺损区亦见X射线阻射影像,与颅骨邻接区的环形透光影密度逐渐增加,骨缺损中央部密度不均匀.结论:NanoBCP与BMSCs复合物能够有效地修复颅骨缺损.     

四环素对胶原生物衍生骨材料细胞相容性的影响

目的：观察四环素-胶原生物衍生骨材料与兔成骨细胞的相容性及体外附着规律。方法：实验于2003-02/2005-03在华西医科大学组织工程实验室完成。①实验方法：取新鲜人捐献骨经脱脂、脱蛋白等理化过程,制成单纯生物衍生骨材料为载体,载体表面经I型胶原修饰得到胶原生物衍生骨材料,将四环素吸附于胶原生物衍生骨复合材料,构建出四环素-胶原生物衍生骨材料。体外培养兔骨膜成骨细胞,与胶原生物衍生骨材料、四环素-胶原生物衍生骨材料共培养。②实验评估：分别于1,3,5,7d取材,扫描电镜下观察细胞在材料表面的生长情况,测定两组材料的碱性磷酸酶活性,MTT检测细胞生长和增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期情况。 结果：①扫描电镜观察、碱性磷酸酶活性检测及MTT检测结果表明,成骨细胞在四环素-胶原生物衍生骨材料表面和孔隙内黏附和增殖良好,在胶原生物衍生骨材料较差。②流式细胞仪检测表明,四环素-胶原生物衍生骨材料无细胞毒性。 结论：以胶原生物衍生骨材料作为载体,进一步吸附四环素后构建的复合材料与成骨细胞有良好的细胞相容性。     

生物运行骨材料与骨髓间充质干细胞体外的生物相容性

背景:生物衍生骨材料已在临床应用多年,但其作为组织工程骨支架材料的可行性还需验证.目的:评价异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性.设计、时间及地点:单一样本体外观察性实验,于2007-08/2008-01在中国辐射防护研究院医用组织库组织工程实验室完成.材料:山西省医用组织库生产的人松质骨;体外分离培养;周龄新西兰兔骨髓间充质干细胞.方法:经脱脂、脱钙、去抗原等步骤制各生物衍生骨材料,扫描电镜观察其表面超微结构.直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,MTT法和流式细胞仪检测生物衍生骨材料对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响.PKH26标记骨髓间充质干细胞与生物衍生骨材料复合培养,荧光显微镜动态观察细胞在骨材料上的生长情况;扫描电镜观察细胞在骨材料上的贴附、生长情况.主要观察指标:①生物衍生骨材料的形态结构及骨髓间充质干细胞在其上的生长、增殖情况.②生物衍生骨材料的细胞毒性.结果:所制各的生物衍生骨材料呈白色,扫描电镜观察呈规则的疏松多孔结构,孔隙间有微孔相互连通.其对骨髓间充质干细胞的增殖和凋亡无明显的影响;荧光显微镜下观察,在材料表面及孔隙内可见PKH26标记的细胞,显示红色荧光:扫描电镜观察可见细胞在材料上附着生长,细胞形态呈梭型或多角形,与材料贴附紧密.结论:实验制备的异种生物衍生骨材料细胞毒性低,与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性.     

骨形态发生蛋白与骨缺损的修复

骨缺损发生后,骨的生理连续遭严重破坏,在利用外源性骨形态发生蛋白治疗时,必须有适合的载体,通过该载体将外源性骨形态发生蛋白及其它生长因子释放到骨质缺损部位,诱导新骨形成从而达到治疗目的.骨形态发生蛋白的载体材料很多,主要包括无机材料、高分子聚合材料、生物性材料以及这些材料的复合物,但各有不足之处.许多学者对其加以改进,使其更有利十发挥骨形态发生蛋白的诱骨活性.载体或局部基因释放的骨形态发生蛋白可有效修复骨缺损,为治疗骨缺损提供了新途径.     

生物衍生骨复合成骨诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨修复兔桡骨-骨膜缺损的血管化进程

背景：移植骨能否血管化是移植成活的关键。目的：验证生物衍生骨复合骨髓间充质干细胞构建组织化工程骨修复兔桡骨-骨膜缺损的血管化进程。设计、时间及地点：随机分组设计的动物对照实验,2007-01/2008-01在南华大学生命科学院实验室完成。材料：健康成年新西兰大白兔25只,双侧桡骨制备成中段1.5cm的桡骨-骨膜缺损。方法：经脱脂、脱蛋白、部分脱钙和冻干等一系列的物理、化学方法处理后制备生物衍生骨支架材料。与自体骨髓间充质干细胞复合制备组织工程骨支架材料。按随机数字表法,20只兔右侧桡骨为实验组植入组织工程骨,左侧为对照组植入单纯生物衍生骨,不做内外固定;另5只兔双侧造成骨缺损后不植入任何材料作为空白组。主要观察指标：植入后2,4,8,12周观察组织工程骨、生物衍生骨与断端的愈合情况;组织学观察骨组织中血管形成情况,并进行血管面积图像分析。结果：25只兔无脱落。大体观察显示实验组植入后8周两断端已融合为一体;植入后12周,已经塑型,外观接近正常。对照组各时间点愈合程度不如实验组。组织学观察显示,实验组和对照组植入后4周均有大量血管生成,植入后8周,实验组修复区的血管网较对照组开始排列规律;植入后12周,实验组血管已达成熟阶段,血管排列方向比对照组均匀、有序,形态结构接近正常皮质骨的血管形态。血管面积图像法测定的血管面积结果表明,植入后2周实验组和对照组血管面积低于正常骨组织,植入后4,8周实验组和对照组血管面积高于正常骨组织,差异均有显著性意义（P〈0.05）。植入后4周实验组血管面积低于对照组,差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：生物衍生骨复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞可加快骨修复后的血管化进程。     

兔骨髓间充质干细胞复合生物衍生骨修复胫骨缺损

目的：探讨骨髓间充质干细胞与生物衍生骨复合修复兔胫骨的长段骨-骨膜缺损，以及修复负重骨缺损的可行性。 方法：实验于2001-10／2002-08在牡丹江市第二人民医院放射科进行。①取成人尸体胫骨4具（来源于哈尔滨医科大学），切取干骺端松质骨及皮质骨2．0cm&;#215;0．5cm&;#215;0．5cm的骨块，经脱细胞、脱脂、脱蛋白及去抗原等处理后冻干，制备成生物衍生骨。②取健康成年新西兰大白兔24只，随机编号后从自体骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，与生物衍生骨于体外复合培养，并将这24只大白兔制备成双侧胫骨中段10mm骨一骨膜缺损模型，行常规钢板螺钉固定。③随机选取其中的20只，对同一只兔将复合物植入右侧胫骨缺损处作为实验组，将单纯生物衍生骨植入左侧胫骨缺损处作为对照组；另4只兔作为空白组，双侧骨缺损不植入任何材料。然后分栏放养，观察各组兔术后一般情况。④在8，12，16．24周各时间点分别取出骨缺损修复标本，进行大体观察和骨密度测试，并进行统计学分析，以比较各组修复骨缺损的能力。 结果：实验大白兔24只均进入结果分析。①各组兔术后一般情况：术后各组动物恢复及进食均正常，伤口无炎性反应，愈合良好。②各组兔骨缺损修复标本大体观察：术后8，12周实验组骨缺损部分修复，16周骨缺损完全修复，8，12，16周时实验组的骨缺损修复和骨痂生长情况明显好于对照组；24周时空白组的各缺损区均未发现有骨组织形成。③各组兔骨缺损区的骨密度测量结果：术后8，12，16周时各缺损区的骨密度实验组明显高于对照组（0．923&;#177;0．045比0．571&;#177;0．021，1．234&;#177;0．023比1．003&;#177;0．037，1．643&;#177;0.071比1．157&;#177;0．029，P〈0．05）。24周时实验组与对照组比较无统计学意义（P〉0．05）。空白组骨缺损未修复。 结论：骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨早期修复骨缺损能力较强，且较单纯生物衍生骨成骨量大、迅速，能够对负重骨缺损进行有效的修复。     

生物衍生骨支架材料制备及在体内的组织相容性

背景：理想的支架材料必须对机体无毒性，无免疫排斥反应，并能适时地降解，具有良好的生物相容性，生物衍生骨支架材料能否长期存留体内并发挥功能值得研究。 目的：观察生物衍生骨支架材料植入鼠体内后机体局部组织生物相容性及对免疫功能的影响。 设计：随机对照动物实验。 单位：吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室。 材料：实验于2006-03／2006-07在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成，选用18只雄性BALB／C小鼠，体质量（202）g，雌雄各半：1只昆明小鼠，体质量20g：1只雌性家兔，体质量2．5kg，以上实验动物均由吉林大学基础医院实验动物部提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。猪松质骨（髂骨）为市售。实验用IMDM培养基为美国Hycolone公司产品，FBS购自美国GIBCO公司，四甲基偶氮唑盐及ConA均为美国Sigma公司产品。 方法：采用猪髂骨制备生物衍生骨支架材料。①采用随机抽签法将BALB，C小鼠分成支架材料植入组、异种骨植入组及对照组，每组6只。支架植入组将支架植入到BALB／C小鼠的下肢肌肉内，异种骨植入组将昆明鼠骨植入到BALB／C小鼠下肢肌肉内，对照组仅将局部肌肉损伤。②术后21d取材料植入部位及周围组织，大体及苏木精-伊红染色法进行观察材料与组织相容性：采用刀豆蛋白A诱导各组脾淋巴细胞转化，酶联免疫检测仪在λ570nm波段检测并记录淋巴细胞刺激指数。以补体依赖性细胞毒实验评估各组小鼠免疫功能，即采用酶联免疫检测仪在λ570nm波段检测并记录各组吸光度值，计算细胞杀伤率。 主要检测指标：①植入物周围组织相容性。②刀豆蛋白A诱导后淋巴细胞刺激指数。③补体依赖性细胞毒实验各组细胞杀伤率。 结果：18只BALB／C小鼠均进入结果分析。①?     

兔骨髓间充质干细胞复合生物衍生骨修复胫骨缺损

目的:探讨骨髓间充质干细胞与生物衍生骨复合修复兔胫骨的长段骨-骨膜缺损,以及修复负重骨缺损的可行性。方法:实验于2001-10/2002-08在牡丹江市第二人民医院放射科进行。①取成人尸体胫骨4具(来源于哈尔滨医科大学),切取干骺端松质骨及皮质骨2.0cm×0.5cm×0.5cm的骨块,经脱细胞、脱脂、脱蛋白及去抗原等处理后冻干,制备成生物衍生骨。②取健康成年新西兰大白兔24只,随机编号后从自体骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,与生物衍生骨于体外复合培养,并将这24只大白兔制备成双侧胫骨中段10mm骨-骨膜缺损模型,行常规钢板螺钉固定。③随机选取其中的20只,对同一只兔将复合物植入右侧胫骨缺损处作为实验组,将单纯生物衍生骨植入左侧胫骨缺损处作为对照组;另4只兔作为空白组,双侧骨缺损不植入任何材料。然后分栏放养,观察各组兔术后一般情况。④在8,12,16,24周各时间点分别取出骨缺损修复标本,进行大体观察和骨密度测试,并进行统计学分析,以比较各组修复骨缺损的能力。结果:实验大白兔24只均进入结果分析。①各组兔术后一般情况:术后各组动物恢复及进食均正常,伤口无炎性反应,愈合良好。②各组兔骨缺损修复标本大体观察:术后8,12周实验组骨缺损部分修复,16周骨缺损完全修复,8,12,16周时实验组的骨缺损修复和骨痂生长情况明显好于对照组;24周时空白组的各缺损区均未发现有骨组织形成。③各组兔骨缺损区的骨密度测量结果:术后8,12,16周时各缺损区的骨密度实验组明显高于对照组(0.923±0.045比0.571±0.021,1.234±0.023比1.003±0.037,1.643±0.071比1.157±0.029,P<0.05)。24周时实验组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。空白组骨缺损未修复。结论:骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨早期修复骨缺损能力较强,且较单纯生物衍生骨成骨量大、迅速,能够对负重骨缺损进行有效的修复。     

生物衍生骨支架材料制备及在体内的组织相容性

背景:理想的支架材料必须对机体无毒性,无免疫排斥反应,并能适时地降解,具有良好的生物相容性,生物衍生骨支架材料能否长期存留体内并发挥功能值得研究.目的:观察生物衍生骨支架材料植入鼠体内后机体局部组织生物相容性及对免疫功能的影响.设计:随机对照动物实验.单位:吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室.材料:实验于2006-03/2006-07在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成,选用18只雄性BALB/C小鼠,体质量(202)g,雌雄各半;1只昆明小鼠,体质量20 g;1只雌性家兔,体质量2.5 kg,以上实验动物均由吉林大学基础医院实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.猪松质骨(髂骨)为市售.实验用IMDM 培养基为美国Hycolone公司产品,FBS购自美国GIBCO公司,四甲基偶氮唑盐及ConA均为美国Sigma公司产品.方法:采用猪髂骨制备生物衍生骨支架材料.①采用随机抽签法将BALB/C小鼠分成支架材料植入组、异种骨植入组及对照组,每组6只.支架植入组将支架植入到BALB/C小鼠的下肢肌肉内,异种骨植入组将昆明鼠骨植入到BALB/C小鼠下肢肌肉内,对照组仅将局部肌肉损伤.②术后21 d取材料植入部位及周围组织,大体及苏木精-伊红染色法进行观察材料与组织相容性;采用刀豆蛋白A诱导各组脾淋巴细胞转化,酶联免疫检测仪在λ570 nm波段检测并记录淋巴细胞刺激指数.以补体依赖性细胞毒实验评估各组小鼠免疫功能,即采用酶联免疫检测仪在λ570 nm波段检测并记录各组吸光度值,计算细胞杀伤率.主要检测指标:①植入物周围组织相容性.②刀豆蛋白A诱导后淋巴细胞刺激指数.③补体依赖性细胞毒实验各组细胞杀伤率.结果:18只BALB/C小鼠均进入结果分析.①植入物周围组织相容性:支架材料植入组植入21 d后,支架材料组肉眼可见,埋植物周围软组织均无明显充血、变性、坏死、化脓及积液等表现,大量纤维结缔组织长入材料的孔隙之中,包裹并形成纤维囊.苏木精-伊红染色结果显示埋植物周围未见大量中性粒细胞及多核巨细胞等炎细胞浸润.材料周围有大量纤维结缔组织增生,材料被纤维囊包裹.同时有部分材料已经开始降解,材料降解后的空间有纤维结缔组织增生.异种骨组肉眼见肌肉剖面有坏死组织,苏木精-伊红染色结果显示埋植物周围有大量的中性粒细胞和巨噬细胞浸润,并可见坏死组织.②淋巴细胞刺激指数:异种骨植入组淋巴细胞刺激指数高于对照组,差异有显著性意义(P ＜ 0.05),支架材料组与对照组之间差异无统计学意义(P ＞ 0.05).③细胞杀伤率: 异种骨植入组的细胞杀伤率明显高于对照组,差异有显著性意义(P ＜ 0.05),支架材料组的细胞杀伤率与对照组差异无统计学意义(P ＞ 0.05).结论:本实验获得的生物衍生骨支架材料引起的免疫反应较弱,无明显细胞毒性,不产生明显的炎症反应,具有良好的生物相容性和生物安全性.