混合细胞共微囊化对肝细胞功能的支持作用

目的观察大鼠肝细胞、转基因肝星状细胞株HGF／CFSC和／或大鼠骨髓来源Thy-1^＋β2M^-细胞（BDTC）共微囊化对肝细胞生物学活性的支持,及腹腔移植混合细胞微囊对急性肝衰竭大鼠肝功能的改善作用。方法利用微囊发生器制备含肝细胞或混合细胞的微囊,依微囊内包裹细胞种类不同,分为微囊化肝细胞组、微囊化肝细胞＋CFSC／HGF组）和微囊化肝细胞＋CFSC／HGF＋BDTC组,通过观察囊内细胞形态和体外培养测定培养液中白蛋白和尿素的分泌,判断各组囊内肝细胞活性和功能的维持;将90％肝大部切除所致的急性肝衰竭大鼠按照移植微囊种类不同分为空囊对照组和上述3个实验组（每组10只）,观察腹腔植入后不同时间大鼠的一般状况、存活时间、血生化改变、肝组织再生及微囊化移植物的组织学特征。结果与单独肝细胞微囊者相比,混合细胞微囊内肝细胞存活时间超过1倍,培养液中白蛋白分泌和尿素合成量明显增加（均P〈0．01）;与对照组相比,微囊化肝细胞或微囊化混合肝细胞移植后,急性肝衰竭大鼠的肝功能显著改善、存活率明显提高（10／10 vs 1／10）,其肝组织再生完全;移植21—42d时,部分微囊附着于肝脏表面并出现血管化,微囊表面存在不同程度的纤维化,微囊内仍有存活的细胞,以微囊化混合肝细胞组优于微囊化肝细胞组。结论混合细胞共微囊化能明显改善囊内肝细胞的存活寿命、形态和功能的维持,微囊化混合肝细胞腹腔移植对促进急性肝衰竭大鼠的肝功能恢复具有显著作用。     

微囊化肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的研究

[目的 ]探讨微胶囊包裹肝细胞 (microencapsulatedhepatocyte)腹腔移植治疗急性肝功能衰竭的机制与可行性 ,评价生物膜功能。 [方法 ]D -氨基半乳糖 (D - gal)诱发急性肝功能衰竭大鼠模型 ,分成 4组 :Ⅰ组生理盐水组 ;Ⅱ组空微胶囊对照组 ;Ⅲ组促肝细胞生长素 (hepatocytegrowthfac tor ,HGF)组 ;Ⅳ组微囊化肝细胞组 ,观察 2周存活率、肝功生化指标的变化 ,2周后收集腹腔内微胶囊 ,观察其形态与功能。 [结果 ]Ⅳ组存活率较Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ组有明显改善 (分别为 6 6 .7%、2 0 .0 %、1 3.3%、2 0 .0 % ,P <0 .0 5 ) ,其他组间存活率无显著性差异 ;Ⅳ组自移植后 2 4h起白蛋白 (ALB)、总胆红素 (TBIL)、凝血酶原时间 (PT)较其他组有明显改善 (P <0 .0 5 )。 2周后收集的空微胶囊形态完整 ,微囊内肝细胞部分保持存活。 [结论 ]微囊化肝细胞移植可以明显改善肝功能衰竭大鼠的存活率 ,显著改善肝脏生化功能。生物微胶囊可以有效阻断免疫排斥作用 ,保护移植肝细胞 ,有利于其发挥生物功能。     

海藻酸钠纯度对大鼠微囊纤维化和囊内肝细胞功能的影响

目的 研究海藻酸钠纯度对微囊纤维化及囊内肝细胞组织形态、功能的影响。方法 采用逐步过滤和氯仿和丁醇萃取蛋白的方法纯化海藻酸钠,用纯化和未纯化的海藻酸钠制作两种微囊化肝细胞,分别作同种异体腹腔移植并观察移植后不同时间（２周、１、２、和６个月）微囊和囊内肝细胞的组织结构、功能表达及对急性肝衰大鼠存活率的影响。结果 纯化组的微囊回收率较未纯化组明显增高（Ｐ〈０．００１）。纯化组移植１个月时大部分肝细胞组     

转染神经生长因子基因的腹腔移植微囊化细胞对缺氧缺血性脑病新生大鼠脑损伤的保护作用

目的： 探讨腹腔移植微囊化神经生长因子(NGF)基因3T3细胞对缺氧缺血性脑病(HIBD)新生大鼠脑损伤的保护作用,为寻找治疗新生儿HIBD的有效方法提供实验依据。方法:新生Wistar大鼠60只,随机分为假手术组、空囊组和移植组，每组20只。假手术组大鼠腹腔注射生理盐水，空囊组大鼠制备HIBD模型后腹腔注射空微囊，移植组大鼠制备HIBD模型后腹腔注射微囊化3T3细胞。分别观察各组新生鼠脑组织水含量和海马区阳性细胞凋亡率。结果：空囊组和移植组大鼠存在不同程度脑水肿，空囊组大鼠脑组织含水量高于假手术组（P<0.05），移植组大鼠脑组织含水量与假手术组比较差异无统计学意义（P>0.05），但低于空囊组（P<0.05）。TUNLE免疫组织化学，空囊组与假手术组比较细胞凋亡率差异具有统计学意义（P<0.05），移植组阳性细胞凋亡率低于空囊(P<0.05）。结论：腹腔移植微囊化NGF基因3T3细胞可以减轻大鼠HIBD后脑水肿，且对大鼠HIBD后海马神经元有
保护作用。     

ALF大鼠肾脏内移异种植肝细胞后的总溶血补体活性观察

目的 探讨急性肝功能衰竭的大鼠肾脏内移植异种肝细胞后的生化指标变化,观察异种植肝细胞肾脏移植对急性肝功能衰竭大鼠的防治效果.方法 建立大鼠90%肝切除肝功能衰竭模型.切肝术前1d分别植入豚鼠肝细胞和大鼠肝细胞,建立异种移植组、同种移植组及未移植对照组,观察受试大鼠的切肝术后24h血液受体总溶血补体活性(CH50)变化.结果 异种移植组、同种移植组24 h内受体CH50均下降,异种移植组下降尤为显著,以后逐渐回升,至7d时已达正常水平.结论 ALF大鼠肾脏内移异种植肝细胞后总溶血补体与排斥反应关系密切,异种移植组排斥反应更加显著.     

辅助性肝移植门静脉动脉化治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的 探讨门静脉动脉化异位辅助肝移植对大鼠急性肝功能衰竭的治疗作用和肝动脉血供对移植肝早期功能的影响。方法 将切除85％肝脏的急性肝功能衰竭大鼠随机分为三组：A组（n=20)，异位辅助肝移植门静脉动脉化加肝动脉血供建立；B组（n=20)，异位辅助肝移植门静脉动脉化；C组（n=10)，为对照组。观察肝衰组和移植组大鼠生存情况、肝功能变化、残肝和移植肝病理结构改变以及肝动脉血供对移植肝早期功能影响。结果 A组和B组大鼠2周生存率分别是85．7％和64．3％，C组大鼠48h存活率为0。移植肝再灌注后，A组胆汁分泌率比B组明显增高（P＜0．05），术后2周内，A组血清ALT、GGT、Tbil值显著降低（与B组比较，P＜0．05）。移植术后14天，A组和B组残肝细胞都明显增生，肝功能恢复正常，而移植肝开始萎缩，肝细胞变性，汇管区有淋巴细胞浸润。结论 辅助肝移植门静脉动脉化为急性肝功能衰竭提供了有效的支持作用，使原肝再生，肝功能恢复正常，而移植肝逐渐萎缩丧失功能。在大鼠辅助肝移植中，肝动脉血供有助于改善移植肝早期功能，防止术后胆道并发症的发生。     

异种肝细胞脾内移植海藻酸钠包裹最佳浓度及免疫隔离机制的初步研究

目的:探讨微囊化异种肝细胞脾内移植对药物性肝衰大鼠的治疗过程中海藻酸钠包裹移植肝细胞的最佳浓度;观察受体存活率,测定肝功能及CD4,CD8的变化。方法:分别以浓度为5.0%、1.5%、0.15%的海藻酸钠悬液体外包裹经胶原酶技术制备的异种(豚鼠)肝细胞为供体,SD大鼠为受体,D-氨基半乳糖(19.5ml/kg)腹腔内一次性注射,制作肝衰模型。48h后将三组微囊化的游离豚鼠肝细胞(1.5×107个)分别移植入大鼠脾脏内。以生理盐水1.2ml脾脏注射为对照。移植后48h、96h观察存活率,肝功能、免疫球蛋白及肝脏病理情况,免疫组化ABC法测定CD4,CD8的变化。结果:微囊化肝细胞移植组存活率分别为50.0%、80.0%、90.0%,明显高于生理盐水组(25.0%)(P<0.01)。移植后96h测定总胆红素和AST显示:在不同浓度的三组微囊化移植肝细胞中,0.15%的海藻酸钠包裹组明显低于其它各组及对照组。移植后48h、96h,分别测定受体脾脏CD4,CD8淋巴细胞,0.15%微囊包裹组96h呈阳性,1.5%、5.0%包裹组48h均呈阳性。结论:大鼠药物性肝衰微囊化肝细胞脾内移植海藻酸钠包裹浓度为0.15%,细胞免疫参与排斥反应,包裹浓度过高影响移植肝细胞功能及免疫隔离效果。     

微囊化猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝功能支持的实验研究

目的:探讨微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的效果。方法:采用原位胶原酶循环肝灌注法分离中国实验用小型猪肝细胞,海藻酸钠-氯化钡法微囊化。应用D-氨基半乳糖(D-gal)1.2g/kg体重腹腔内注射制作SD大鼠急性肝衰竭模型。急性肝衰竭大鼠随机分为3组。注药24h后分别将PRMI1640培养液2ml腹腔注射为对照组(1组)、2ml游离猪肝细胞(2×107个/ml)腹腔内移植组(2组)、2ml微囊化猪肝细胞(2×107个/ml)腹腔内移植组(3组)。观察移植后大鼠14天存活率、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)的改变。结果:肝细胞移植后大鼠14天存活率:1组为20.0%(5/25),2组为66.7%(16/24),3组为76.0%(19/25),3组间差异有显著性(P<0.05)。移植后第1天1组ALT、TB和移植前相比差异无显著性,2、3组ALT、TB下降。第4天3组ALT、TB均继续下降,2、3组低于1组(P<0.05),2、3两组间差异无显著性(P>0.05)。移植后第7天,ALT进一步下降,3组间差异有显著性(P<0.05);TB3组显著低于2组和1组(P<0.05),2组低于1组但差异无显著性(P>0.05)。移植后第14天,肝功能均明显恢复,ALT、TB2、3组均低于1组(P<0.05),2、3两组间差异无显著性(P>0.05)。结论:微囊化猪肝细胞腹腔内移植可以提高药物诱导急性肝衰竭大鼠的存活率,改善ALF大鼠的肝功能。     

ALF大鼠肾脏内移异种植肝细胞后的生化指标观察

目的 探讨急性肝功能衰竭的大鼠肾脏内移植异种肝细胞后的生化指标变化,观察异种植肝细胞肾脏移植对急性肝功能衰竭大鼠的防治效果.方法 建立大鼠90%肝切除肝功能衰竭模型.切肝术前1d分别植入豚鼠肝细胞和大鼠肝细胞,建立异种移植组、同种移植组及未移植对照组,观察受试大鼠的切肝术后24 h血液生化指标改变.结果 异种移植组血糖(BG)和凝血酶原时间(PT)改善较明显(P＜0.05),同种移植组丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)、血糖(BG)、凝血酶原时间PT均有明显改善(P＜0.05).结论 异种肝细胞移植对大鼠急性肝功能衰竭有防治作用.     

对海藻酸-壳聚糖-聚乙烯乙二醇微囊生物相容性的初步研究

目的：　微囊化胰岛移植是治疗糖尿病有前途的方法之一,但微囊生物相容性欠佳和价格昂贵是微囊化胰岛移植面临的主要问题。为解决这些问题,我们研究开发了海藻酸壳聚糖聚乙烯乙二醇微囊（ＡＣＰ微囊）,并对其生物相容性进行了初步研究。方法：１０００只ＡＣＰ空囊被移植到Ｗｉｓｔｅｒ大鼠腹腔内,隔４天和３周后取出,分别统计微囊的取出数和取出微囊的纤维化率,以常用的海藻酸聚赖氨酸海藻酸微囊（ＡＰＡ微囊）为对照。结果：４天时ＡＣＰ微囊的取出数为８４５±４０．４１;ＡＰＡ微囊的取出数为８０７６±４５．７,两者…     

微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

Proliferation of retrorsine-treated SD rat immortalized hepatocytes after intrasplenic transplantation]

OBJECTIVE: To investigate the effect of retrorsine on the proliferation of SD rat immortalized hepatocytes after intrasplenic transplantation. METHODS: Immortalized hepatocytes from SD rats was prepared by transfecting the primary hepatocytes with a retroviral vector SSR69 expressing the genes encoding Simian virus 40 T large antigen. Twenty-four adult SD rats were randomly assigned to 3 equal groups designated respectively as A, B, and C groups. Intraperitoneal retrorsine injections at the dose of 26 mg/kg.b.w. were performed twice in groups A and B at the interval of two weeks before hepatocyte transplantation. After 20% hepatic lobe resection were completed in all the groups, groups A and C received intraplenic transplant with immortalized hepatocytes, while group B received normal hepatocyte transplant. Post-mortem examinations were performed on the spleen samples with HE staining. Albumin expression in the transplanted hepatocytes was examined by immunohistochemical staining, and the ultrastructure of the transplanted cells was observed under transmission electron microscope. RESULTS: Histological examination demonstrated that the rat spleens in all the 3 groups contained cluster of transplanted hepatocytes from 1 week to 3 weeks after the transplantation, and the proliferation of the transplanted cells were comparable between groups A and B, but both of which showed significant difference from group C. Albumin excretion by the immortalized hepatocyte was identified in all the groups, and the transplanted immortalized cells preserved normal cell ultrastructure. CONCLUSION: Immortalized hepatocytes of SD rat have the normal cell ultrastructure and albumin-excretion function, and retrorsine can promote the proliferation of the transplanted hepatocytes.     

以胶原凝胶为支架构建可植入工程化肝组织的实验研究

目的探讨肝细胞与液态Ⅰ型胶原复合构建可植入的工程化肝组织的可行性。方法SD大鼠肝细胞与液态Ⅰ型胶原及DMEM复合,形成肝细胞／胶原凝胶复合物。该复合物被接种在培养板中培养,采用相差显微镜和HE染色方法对培养肝细胞形态特征进行观察,并采用MTT法和免疫组化染色方法分别对肝细胞的活性和功能进行检测。肝细胞／胶原复合物同时被植入皮下腔中观察肝细胞的分化及工程化肝组织的形成情况,采用HE染色和免疫组织化学染色方法对植入的工程化肝组织进行评价。结果肝细胞与液态Ⅰ型胶原复合后形成凝胶状复合物,可见肝细胞均匀分布在整个复合物中,呈三维立体生长。在整个体外培养过程中,肝细胞始终保持圆形的形态;肝细胞在培养初期活性稍有下降,直至第7天时仍然保持活性的87％,之后随培养时间延长而活性逐渐降低。经过2周培养,肝细胞仍具有白蛋白的合成功能。皮下植入后1周,肝细胞／胶原复合物形成工程化灶性肝组织,免疫组化染色证实这种工程化的肝组织具有白蛋白的合成功能。结论采用胶原凝胶作为肝细胞生长和分化的支架可在体内构建类肝样的工程化肝组织。这种可植入的工程化肝组织提供了一种基于肝细胞治疗的新途径,并有望用于损伤肝组织修复和重建。     

经大鼠脾动脉行肝细胞移植建立动物模型

 目的 建立经SD大鼠颈动脉途径脾动脉插管行肝细胞移植的动物模型,并探讨其临床意义。方法 采用D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-gal)诱导大鼠急性肝损伤(acute liver injury,ALI),24 h后40只SD大鼠分为两组:A组(n=20)经左侧颈动脉插管,进入腹腔干,通过脾动脉移植1×107个肝细胞;B组(n=20)通过同样的方法经脾动脉注射0.5 mL Hank′s液作为对照,观察不同时间点（1、3、6、10、15天）大鼠肝功能的变化情况以及脾内白蛋白合成作用,HE染色观察脾内肝细胞分布情况。结果 经颈动脉途径脾动脉插管成功率约90%,荧光示踪剂CFDA SE标记的肝细胞脾内移植1天后,受体大鼠脾脏可以看到散在绿色荧光分布。A组移植10天后,HE染色可以看到肝细胞在脾脏散在分布;A组移植15天后,共聚焦白蛋白免疫荧光结果表明,脾内有白蛋白绿色荧光信号。结论 经大鼠颈动脉途径脾动脉插管移植的肝细胞能在脾内存活,证实该途径是肝细胞有效移植途径之一。     

肝细胞脾内移植治疗大鼠肝衰竭

目的:优化急性肝衰竭模型的构建方法及探讨经脾内同种异体肝细胞移植治疗大鼠急性药物性肝衰竭的疗效,并观察脾内移植肝细胞的生物学活性。方法:采用D-氨基半乳糖(D-gal)建立大鼠急性药物性肝衰竭模型。腹腔注射不同剂量的(1.0,1.2,1.4,1.6g/kg)D-gal后,以肝功能指标、病理形态学、死亡率等综合评估肝脏细胞损伤的状态,确定模型构建的最佳方案。造模后24h,随机分为2组进行治疗,Ⅰ组:经脾内移植肝细胞悬液1ml(4.4×107个);Ⅱ组:经脾内移植不含肝细胞的培养液1ml。观察大鼠1周的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学活性。结果:①不同剂量的D-gal可导致不同程度的肝损伤,而以1.2g/kgD-gal造模组的大鼠死亡率适中,肝功能损害及其肝脏病理组织学改变均符合临界急性肝衰竭的程度,较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。②移植后3d,Ⅰ组与Ⅱ组大鼠存活率相比具有显著性差异(P<0.01);肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBiL)均有明显改善(P<0.01);肝组织病理切片显示:Ⅰ组的肝组织损伤程度明显比Ⅱ组轻。经HE和PAS染色证实,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。结论:①D-gal1.2g/kg腹腔注射可较好构建SD大鼠急性肝衰竭模型。②经脾内肝细胞移植能明显提高药物性肝衰竭大鼠的存活率、改善肝功能及肝组织病理变化。     

构建携带hIL-10基因的腺病毒载体及其对大鼠肝细胞损伤的保护作用

目的:构建携带人白细胞介素(human interleukin,hIL)-10基因的腺病毒载体,细胞学及动物模型实验鉴定其介导的目的基因表达,并验证其对大鼠肝细胞损伤的保护作用?方法:以pORF-hIL10质粒为模板,PCR扩增hIL-10基因,插入腺病毒质粒pDC315,构建pDC315-hIL10?将质粒pDC315-hIL10与腺病毒包装质粒共转染至293细胞,产生复制缺陷型重组腺病毒Ad5-hIL10;感染大鼠肝细胞,免疫学方法鉴定目的基因的表达;建立体内外大鼠肝细胞损伤模型,验证Ad5-hIL10对肝细胞损伤的保护作用?结果:经PCR扩增?鉴定,证明已正确构建重组腺病毒Ad5-hIL10?大鼠肝细胞感染Ad5-hIL10后,随着病毒感染强度的升高,hIL-10表达明显上升?大鼠肝细胞体外培养模型预先感染病毒Ad5-hIL10,经四氯化碳诱导损伤,则细胞存活率随感染强度(multiplicity of infection,MOI)值升高而增加,至MOI=50时,细胞存活率恢复至92%;大鼠体内肝损伤模型显示,与损伤对照组和空白病毒对照组比较,Ad5-hIL10处理的大鼠肝细胞水样变性和间质炎症反应均减轻,肝功能的各项指标均有明显改善(P < 0.05)?结论:成功构建了重组腺病毒质粒Ad5-hIL10,且能明显提高肝细胞的存活能力,对肝功能有明显保护作用?