膀胱无细胞基质移植物重建兔阴茎白膜的动态观察**☆

背景：目前膀胱无细胞基质移植物已成功用于替代动物膀胱、尿道和修复尿道下裂，但膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜有待观察。 目的: 采用同种异体膀胱无细胞移植物替代兔阴茎白膜，观察重建修复效果。 设计：随机对照观察。 单位：四川大学华西医学实验动物中心、华西组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室。 材料：选用50只雄性健康封闭新西兰兔，动物级别3级，体质量为2.6~3.0 kg,均无包茎及阴茎发育不良，注射生理盐水后无阴茎弯曲，由四川大学华西实验动物中心提供。 方法：实验于2005-12/2007-06在四川大学华西实验动物中心、四川大学组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室完成。①取10只实验兔膀胱制备膀胱无细胞基质移植物。随机数字表法将40只新西兰兔分为对照组和膀胱无细胞基质移植物组，分别在阴茎背侧切除白膜10 mm×5 mm造成缺损，分别采用白膜原位缝合及膀胱无细胞基质移植物修复，每组20只。②分别于术后2，6，12及24周对2组动物进行阴茎海绵体内快速注射生理盐水诱导阴茎勃起，观察阴茎弯曲情况；于上述时间点分别处死实验兔，于术区取材进行苏木精-伊红、Masson染色观察修复部位组织结构变化；Stirus 染色检测检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积，免疫组化染色检测炎性标志因子诱导型一氧化氮合酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达。 主要观察指标：①阴茎弯曲情况。②修复部位组织结构变化。③炎性标志因子诱导型一氧化氮合酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达。④Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积。 结果：纳入重建阴茎白膜术实验兔40只，2只死于麻醉药物过量，2只死于急性肠炎，其余36只均进入结果分析。①术后6周时弯曲发生率最高，对照组2例，膀胱无细胞基质移植物组1例；术后12周对照组及膀胱无细胞基质移植物组各1例发生弯曲；术后24周对照组1例发生弯曲，膀胱无细胞基质移植物组无弯曲发生。②修复部位组织结构变化：术后2周两组修复部位结构欠清，炎性细胞浸润明显，膀胱无细胞基质移植物组移植部位可见膀胱无细胞基质移植物内细胞生长，Masson染色显示术区白膜纤维纤细，排列欠规律。术后6周时白膜恢复完整性，膀胱无细胞基质移植物不能辨别，两组间无明显差异。术后24周移植部位白膜完整均匀，纤维恢复内环外纵排列，和正常白膜不能区别。③两组术后诱导型一氧化氮合酶及转化生长因子β1，2周表达最强，术后6周只有少数纤维细胞和血管内皮细胞有表达，术后12，24周仅有极少的血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶和转化生长因子β1，同时间点2组诱导型一氧化氮合酶和转化生长因子β1没有差别。④术后2周两组Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维共同存在，比例相当。以后Ⅰ型胶原纤维逐渐增加，而Ⅲ型胶原纤维逐渐减少，术后24周以Ⅰ型胶原纤维为主，Ⅲ型胶原纤维已不明显。 结论：膀胱无细胞基质移植物修复新西兰兔阴茎白膜无明显的炎症反应和纤维化，是较为理想的阴茎白膜修复材料。     

偏光显微镜观察发育性髋关节脱位圆韧带组织的病理变化

背景：发育性髋关节脱位与关节囊、韧带等致密结缔组织细胞外基质中的胶原蛋白有密切关系。 目的：观察发育性髋关节脱位与正常儿的髋关节圆韧带的形态学特点，分析Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量及二者比例(Ⅰ/Ⅲ)变化规律。 设计、时间及地点：分组对照观察，于2006-10/2007-03卫生部先天畸形实验室完成。 对象：选择2005-06/2006-08在中国医科大学附属盛京医院儿童骨科住院并第1次手术发育性髋关节脱位患儿21例。根据术前X射线片按Tönnis标准分3组，髋臼发育不良组3例、髋关节半脱位组12例、髋关节脱位组6例。选择因其他疾病第1次行髋关节手术及尸检患儿13例为对照组。标本取自患者股骨头相连接部位圆韧带。 方法：将各组标本行苦味酸-天狼猩红染色。 主要观察指标：分别在普通显微镜和偏振光显微镜下并测量Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量及计算比例(Ⅰ/Ⅲ)。 结果：Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量随年龄增加而增加；对照组Ⅰ型胶原明显高于各病例组(P < 0.01)， Ⅲ型胶原稍低于病例组(P < 0.05)。胶原含量比例(Ⅰ/Ⅲ)随着年龄增加没有明显变化 (P > 0.05)；各病例组胶原含量比例明显低于对照组(P < 0.05)。 结论：发育性髋关节脱位患儿和对照组间圆韧带Ⅰ和Ⅲ型胶原含量及比例(Ⅰ/Ⅲ)有较大差别，发育性髋关节脱位发生可能与关节囊中胶原紊乱有关。     

可吸收表皮生长因子复合膜防止肌腱粘连的研究★

背景：采用液态分子生物材料作为屏障预防肌腱粘连发生，存在药物降解快、流失量大、屏障作用不理想等问题，因此研究者们越来越多的倾向于膜态屏障材料的研制开发。同时发现肌腱损伤后，腱细胞在多种内源性的生长因子作用下增殖分化，促进了肌腱的内源性愈合，但究竟哪一种因子是肌腱愈合的特异性因子，也是学者们研究的焦点之一。 目的：观察表皮生长因子复合胶原膜在预防鞘管区肌腱粘连、促进肌腱内源性愈合中的作用。 方法：将30只10月龄雄性leghorn公鸡随机分为3组，每组10只。将每只鸡的左足第三趾造成挤压撕脱伤模型，用改良Kessler缝合法缝接。断端分别包裹复合有表皮生长因子的胶原膜、单纯的胶原膜以及断端不加任何处理。术后4周，对标本进行大体观察、生物力学测试、光镜、电镜等观察。 结果与结论：表皮生长因子胶原膜组肌腱粘连程度较轻，腱缝合段内的胶原纤维数量多，以粗大的Ⅰ型胶原为主；成纤维细胞数量少，腱细胞成熟。单纯胶原膜组肌腱粘连较轻，但腱缝合段内的胶原纤维数量少，排列稀疏，以纤细的Ⅲ型胶原为主；空白对照组肌腱与周围组织粘连重，腱缝合段内的胶原纤维数量较多，排列紊乱，Ⅰ、Ⅲ型胶原交错排列。结果表明表皮生长因子来促进肌腱的内源性愈合，可降解胶原膜修复腱鞘可阻止肌腱的外源性愈合，从而达到防止肌腱粘连的目的。     

软骨组织工程支架材料的胶原结构分析

背景：在软骨组织工程化组织培养过程中发现不同类型的胶原材料影响软骨细胞的分化与表达，胶原材料的来源、结构及性质的稳定性决定软骨组织工程研究的可靠性。 目的：表征Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原的结构，阐明用于软骨组织修复的不同类型的胶原材料的结构特点，指导软骨组织工程支架材料的选取。 方法：取来自新生小牛皮的Ⅰ型胶原、来自成猪关节软骨的Ⅱ型胶原及来自新生小牛皮的Ⅲ型胶原，分别将3种胶原材料进行傅里叶变换红外光谱、示差扫描量热法、SDS-PAGE和苦味酸-天狼腥红染色分析，比较结构上的差异。 结果与结论：新生小牛皮Ⅰ型和Ⅲ型胶原与成猪关节软骨Ⅱ型胶原具有相似的官能团，热变性温度分别是104.2 ℃、 99.7 ℃和92.5 ℃。SDS-PAGE分析Ⅰ型胶原中Ⅲ型胶原的百分含量为(11.29±0.91)%。苦味酸-天狼腥红染色显示Ⅰ型为红色和橙色的紧密排列的粗纤维，有很强的双折光；Ⅱ型胶原为红色的疏松的网状纤维；Ⅲ型胶原为绿色的疏松的细纤维。3种胶原的官能团结构和重要特征十分相似，但其高级结构有较大的差异，其相互关系的分析对软骨组织工程支架材料的选择和制备有十分重要的意义。 关键词：支架材料；Ⅰ型胶原；Ⅱ型胶原；Ⅲ型胶原；软骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.002     

红花对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞及Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响

背景：研究发现红花对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成有抑制作用,但其具体作用机制与活体研究尚未进一步展开。 目的：观察红花对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。 设计、时间、地点：随机对照动物实验,于2006-11/2008-03在重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心及研究所完成。 材料：新西兰大白兔27只,雌雄不限;50%红花注射液由山西太原华卫药业有限公司产品,批准文号：国药准字Z14020008。 方法：兔耳腹侧建立增生性瘢痕模型,每耳2块。分为5组。术后第45天开始对增生性瘢痕行注射治疗。①正常皮肤组：为自身兔耳腹侧皮肤。②阳性对照组：右耳外侧增生性瘢痕,不予以任何处理。③生理盐水组右耳内侧增生性瘢痕,注射生理盐水。④低浓度红花组：左耳内侧增生性瘢痕,注射125 g/L红花液。⑤高浓度红花组：左耳外侧增生性瘢痕,注射500 g/L红花液。1次/周,连续注射4次。注射后第2,4,6周分别切取8只兔耳增生性瘢痕及皮肤待查。 主要观察指标：瘢痕厚度,硬度;Mallory染色检测成纤维细胞密度胶原纤维排列及致密度。免疫组织化学方法检测每块组织Ⅰ、Ⅲ型胶原面密度,计算Ⅰ/Ⅲ型胶原比值。 结果：注射后第4,6周,各组增生性瘢痕色泽均逐渐变浅,厚度及硬度均逐渐变小,尤以高浓度组明显,差异与其他增生性瘢痕组比较存在显著性意义(P < 0.05)。注射后第4,6周,高浓度红花组成纤维细胞密度较其他增生性瘢痕组低(P < 0.05)。注射后第4,6周,高、低浓度红花组I型胶原面密度值较阳性对照及生理盐水组低(P < 0.05),且高浓度红花组低于低浓度红花组(P < 0.05);各增生性瘢痕组Ⅰ/Ⅲ型胶原比值在注射后第2,4,6周均逐渐增高;同一时间段,高浓度红花组Ⅰ/Ⅲ型胶原比值为所有增生性瘢痕组中最低(P < 0.05),低浓度红花组Ⅰ/Ⅲ型胶原比值与阳性对照及生理盐水组比较,差异有显著性意义。 结论：高浓度红花液能促进兔耳增生性瘢痕的软化,组织顺应性增加。     

重组碱性成纤维细胞生长因子/I型胶原复合材料修复兔半月板无血运区软骨损伤

摘要 背景：单独应用重组碱性成纤维细胞生长因子对无血运区半月板损伤的愈合无明显影响,考虑主要与其在体内易被吸收和降解等有关。近年来Ⅰ型胶原作为生物性载体的应用逐渐增多。 目的：观察重组碱性成纤维细胞生长因子/Ⅰ型胶原复合材料修复兔半月板软骨损伤的效果。 方法：选用健康新西兰大白兔36只,首先在兔半月板上造成统一的无血运区损伤模型。随机分为空白对照组、重组碱性成纤维细胞生长因子组和重组碱性成纤维细胞生长因子/Ⅰ型胶原组。术后2,6,12周分批处死实验动物,进行大体形态观察和组织学检查。 结果与结论：重组碱性成纤维细胞生长因子组对无血运区损伤愈合无明显影响,但对半月板边缘滑膜中成纤维细胞有明显的促增殖作用;重组碱性成纤维细胞生长因子/Ⅰ型胶原组表现为纤维软骨样组织愈合,但其愈合组织与正常半月板组织仍有差异。结果表明应用重组碱性成纤维细胞生长因子/Ⅰ型胶原复合型材料治疗半月板无血运区的损伤是一种有效的治疗方法。 关键词：半月板;软骨;损伤;重组成纤维细胞生长因子;I型胶原 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.34.006     

转化生长因子β1中和抗体对转化生长因子β诱导肌腱胶原和术后粘连的影响

背景: 研究表明,转化生长因子β1在肌腱损伤愈合过程中增加了肌腱细胞胶原的合成和术后粘连的形成。 目的：观察转化生长因子β1抗体对转化生长因子β诱导的肌腱细胞胶原产生及术后粘连形成的影响。 设计、时间及地点：随机分组观察实验,于2005-09/2006-06在同济医学院实验动物中心完成。 材料：选择2~5月龄新西兰大白兔,体质量3.5~4.5 kg。转化生长因子由美国Santa Cruz B iotechnology公司提供。 方法：取兔屈指肌腱分离肌腱成纤维细胞、腱外膜细胞和腱内膜细胞,将细胞随机分成2组,实验组加入1 µg/L 转化生长因子β后,再加入0.1,0.5,1.0 mg/L转化生长因子β1中和抗体,对照组不添加任何试剂,酶联免疫吸附实验测定Ⅰ型胶原。取84只兔行中趾屈指肌腱切断吻合术,将其中36只兔随机分成3组,腱鞘内分别注入生理盐水、1.0,2.0 mg/L转化生长因子β1中和抗体,4,8周后取出肌腱行肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察;余48只兔随机分成2组,腱鞘内分别注入生理盐水和1.0 mg/L转化生长因子β1中和抗体,1,2,4,8周后取出肌腱,原位杂交方法测定肌腱转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达。 主要观察指标：各组兔肌腱细胞胶原产生及术后粘连情况。 结果：酶联免疫吸附实验显示,转化生长因子β1能明显提高肌腱细胞Ⅰ型胶原的产生;转化生长因子β1抗体能降低3种细胞Ⅰ型胶原的产生,随抗体质量浓度增加,Ⅰ型胶原水平逐渐降低,且呈剂量依赖性;术后4,8周,与1.0,2.0 mg/L 转化生长因子β1组比较,生理盐水组屈趾肌腱滑动距离较短,模拟主动屈曲度明显受限(P < 0.05),最大抗断裂载荷各组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。扫描电镜和组织学观察结果显示,术后4,8 周生理盐水组胶原纤维排列紊乱,1.0,2.0 mg/L 转化生长因子β1组胶原纤维排列整齐。原位杂交结果显示,术后各时间点1.0 mg/L 转化生长因子β1组转化生长因子β1 和Ⅰ型胶原mRNA表达均低于生理盐水组(P < 0.05)。 结论：转化生长因子β1抗体能有效抑制转化生长因子β1在肌腱损伤修复中的作用,减少粘连形成。     

毛囊单位移植促进创面愈合

背景：皮肤创伤后毛囊真皮鞘细胞可能直接参与真皮损伤的修复或者转化为成纤维细胞参与皮肤修复。 目的：建立大鼠毛囊单位创面移植模型，对创面愈合过程中真皮成分的生长进行组织学和超微结构观察和分析，拟探索毛囊组织参与创面真皮愈合的潜力。 设计、时间及地点：对照动物实验，于2007-09/2008-04在复旦大学附属中山医院完成。 材料：体质量为200~250 g的18只SD大鼠用于制备毛囊单位创面移植模型及微粒表皮移植模型。 方法：剪取毛囊单位创面移植组大鼠单侧鼠须垫皮肤，伤口原位缝合，用锐器分割鼠须垫毛囊，切取带有毛囊乳头、毛囊周围组织及部分表皮的毛囊单位复合组织。将毛囊单位植入制备好的创面上，每个创面放入5~7个毛囊单位；切取微粒表皮移植组大鼠全层皮肤中剪切取表皮和部分真皮层皮肤，并修剪成约3 mm×3 mm大小，原位植入创面中，每个创面放入5~7个微粒皮片。 主要观察指标：第2，3，4，5周取创面标本，行苏木精-伊红染色、苦味酸天狼猩红染色，制作碱性水处理的扫描电镜标本，在偏振光显微镜和扫描电镜下观察，用图像软件处理并分析。 结果：创面愈合的初期，两组的创面分泌的胶原基质的类型与量均无明显差异。但随着创面愈合的进行，创面中胶原基质发生重塑性的改变，两者创面中基质的Ⅲ型胶原开始减少，Ⅰ型胶原相应增加。在创面形成后第5周时观察到毛囊单位移植组与微粒表皮移植组的Ⅰ型和Ⅲ型胶原的比值均有不同程度增加，对照组增加更明显，二者差异显著（P < 0.05）。用碱性水处理的扫描电镜方法对晚期创面基质的观察也发现毛囊单位移植的创面基质中胶原纤维由粗细不等的纤维交织而成，胶原纤维的排列较致密有序，仍保持了一定的方向性。 结论：在创面形成后期毛囊单位移植的愈合创面中胶原比值更接近正常皮肤，胶原排列更整齐有序，提示毛囊单位创面移植提高创面愈合的长期效果好。     

大鼠胫骨骨折愈合过程中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白的表达：失神经状态下Western blot方法测定

背景: 近年来大量的实验及临床观察均证实神经因素对骨折愈合有调节和支配作用。Ⅰ型胶原是促成骨细胞分化和增强成骨细胞黏附能力主要因素，是组成骨构架的基质蛋白；而Ⅱ型胶原由软骨细胞产生。 目的：观察失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ，Ⅱ型胶原蛋白表达的变化规律。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-05/12在解放军第二军医大学动物实验室及细胞生物教研究室完成。 材料：选用3月龄健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为2组，单纯胫骨骨折组与脊髓损伤并胫骨骨折组各20只。 方法：单纯胫骨骨折组大鼠于从左胫骨平台前缘插入1根φ0.8 mm克氏针，制成胫骨骨折模型。脊髓损伤并胫骨骨折组在植备上述模型的基础上，横断切除T10 段脊髓约0.3 cm，制成T10脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型。 主要观察指标：分别于伤后1，2，4，5周采用Western blot法检测两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ，Ⅱ型胶原的蛋白表达。 结果：伤后第1周两组大鼠骨折断端骨痂中Ⅰ，Ⅱ型胶原均有表达，脊髓损伤并胫骨骨折组两种胶原的表达程度均高于单纯胫骨骨折组(P < 0.05)；伤后第2周脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原的表达量达到峰值，高于单纯胫骨骨折组(P < 0.05)；伤后第4周单纯胫骨骨折组Ⅰ型胶原表达量达峰值，高于脊髓损伤并胫骨骨折组(P < 0.05)，脊髓损伤并胫骨骨折组Ⅱ型胶原仍有高表达；伤后第5周两组Ⅰ，Ⅱ型胶原表达量均下降。 结论：失神经状态下骨折愈合过程中Ⅰ、Ⅱ胶原的分泌规律与正常骨折愈合一致，区别在于各时间点尤其是在峰值点上表达量有明显差异。     

骨髓间充质干细胞移植对兔急性心肌梗死后胶原重构的影响

背景：研究发现干细胞移植可明显改善心肌梗死后心功能,以往认为主要与干细胞分化为心肌细胞和促血管新生作用有关,近来研究显示旁分泌、抑制心室重构尤其是细胞外胶原重构对心功能的改善起重要作用。 目的：探讨骨髓间充质干细胞移植对兔急性心肌梗死后胶原重构的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-06/08在辽宁中医药大学针灸电生理实验室完成。 材料：健康日本大耳白兔57只,购自辽宁中医药大学实验动物中心。 方法：取2只兔用于制备骨髓间充质干细胞,移植前行BrdU标记。余55只兔取10只作为正常组,45只结扎冠状动脉左室支建立心肌梗死模型,共30只成功造模,随机分为模型组、盐水组、细胞移植组,10只/组。兔心肌梗死后7 d,细胞移植组经耳缘静脉注射骨髓间充质干细胞悬液1 mL(2×106个细胞),盐水组注射1 mL生理盐水,造模后饲养5周。 主要观察指标：采用Masson三色染色法观察心肌间质纤维结构及测量胶原容积分数,免疫组化法测量Ⅰ/Ⅲ型胶原比值。 结果：细胞移植组心肌梗死区可见Brdu染色阳性细胞。细胞移植组梗死中心区和交界区内胶原纤维融合较少,排列有序;模型组和盐水组梗死中心区和交界区内胶原纤维斑块状融合明显,排列紊乱。心肌梗死5周后与正常组比较,模型组梗死区及梗死周围区胶原容积分数显著增加(P < 0.05),Ⅰ/Ⅲ型胶原比值显著下降(P < 0.05);与模型组比较,细胞移植组胶原容积分数、Ⅰ/Ⅲ型胶原比值均显著下降(P < 0.05)。 结论：静脉移植骨髓间充质干细胞可以在心肌梗死区定植,通过减少胶原形成、改善胶原结构来抑制心肌梗死后胶原重构。