利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

人脂肪组织细胞外基质支架的构建

目的 探讨从人脂肪组织中提取细胞外基质并构建支架的方法,研究其结构特点,分析其作为脂肪组织工程支架的可行性.方法 收集抽脂术患者的脂肪组织,共7例,每例约310 ml,10 ml用来分离培养脂肪来源干细胞,300 ml提取细胞外基质,并制备成粉末状,扫描电镜观察其表面结构.DiI荧光标记脂肪来源干细胞,统计荧光标记后细胞存活率;将荧光标记前、后的细胞与支架粘附,检测其粘附率,所得数据用SPSS 13.0软件两样本t检验进行统计学比较,分析标记前后细胞粘附率有无差异;荧光显微镜下观察细胞在支架表面生长情况.结果 从人脂肪组织中提取得到脂肪来源干细胞和细胞外基质粉末.脂肪来源干细胞具有成脂、成软骨和成骨分化的能力;扫描电镜观察细胞外基质粉末具有多孔、粗糙表面和光滑表面的结构.脂肪来源干细胞与支架粘附较好;DiI标记前、后细胞粘附率分别为(88.81±4.81)％和(86.48±4.58)％,两样本t检验,P=0.371,差异无统计学意义(P＞0.05).荧光显微镜下脂肪来源干细胞在细胞外基质支架上生长状态良好.结论 人脂肪组织细胞外基质粉末容易获取,形状和颗粒体积具有高度的多样性,表面积较大,有利于脂肪干细胞的粘附和增殖,可作为一种较理想的脂肪组织工程支架材料.     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的　研究人MSC诱导为成骨细胞后 ,其在脱钙骨上的粘附特性。方法　采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞 ,条件培养液诱导培养至第 3代细胞 ,经相差显微镜观察 ,钙结节茜素红染色 ,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白 ,RT -PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达。不同浓度细胞悬液接种脱钙骨 ,MTT计数未粘附细胞量 ,计算不同浓度下MSC的粘附率 ,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量。结果　MSC经体外诱导形成钙结节 ,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性 ,RT -PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达。脱钙骨上接种MSC达到饱和后 ,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降。单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为 3 .5×1 0 7/ g。 结论　人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型 ,在脱钙骨上有良好的粘附能力 ,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量     

人骨髓基质细胞诱导成骨细胞和脱钙骨粘附率的研究

目的研究人MSC诱导为成骨细胞后,其在脱钙骨上的粘附特性.方法采用密度梯度法分离人骨髓中骨髓基质干细胞,条件培养液诱导培养至第3代细胞,经相差显微镜观察,钙结节茜素红染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白,RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.不同浓度细胞悬液接种脱钙骨,MTT计数未粘附细胞量,计算不同浓度下MSC的粘附率,单位重量脱钙骨上MSC最多能粘附的细胞数量.结果 MSC经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和骨钙蛋白免疫组化结果阳性,RT-PCR证实Ⅰ型胶原和骨钙蛋白mRNA的表达.脱钙骨上接种MSC达到饱和后,MSC的粘附率随接种浓度上升而下降.单位重量脱钙骨最多粘附的MSC量为3.5×107/g.结论人MSC在体外经条件培养液诱导可表达成骨细胞表型,在脱钙骨上有良好的粘附能力,单位重量脱钙骨上存在MSC的最大粘附细胞数量.     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。     

低温保存对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上体外增殖及成骨能力的影响

目的研究低温保存对人骨髓基质干细胞(BMSCs)在脱钙骨(DBM)上生长特性及成骨能力的影响。方法取3例志愿者骨髓(3～5mL),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。第3代BMSCs在-196℃下保存24h,37℃复苏,测定细胞成活率。低温保存前、后的BMSCs分别用成骨诱导液诱导培养,至90%融合时,收集细胞接种在DBM支架上,并测定细胞在DBM上的粘附率。DiI荧光染料标记BMSCs,例置相差显微镜、荧光显微镜和SEM观察低温保存前、后的BMSCs在DBM上的生长及基质分泌情况,MTT法测定细胞在DBM上的增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞在DBM上的成骨能力。结果复苏细胞的存活率为(90．24±0．02)%。低温保存前、后的BMSCs在DBM上的粘附率分别为(97．25±1．17)%和(97．00±1．09)%。倒置相差显微镜及SEM观察显示低温保存前、后的BMSCs在DBM上粘附、生长良好,有大量细胞外基质分泌、沉积。低温保存前、后的BMSCs在DBM上MTT吸光度值和ALP活性的检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)；体外培养12d时,MTT吸光度值及ALP活性同时达到峰值。低温保存前、后的BMSCs在DBM上分泌OCN的量差异无显著性意义(P＞0．05),OCN含量随着培养时间延长而不断上升,在观察期(16d)内未出现平台期。结论低温保存对人BMSCs在DBM上的体外增殖、粘附及成骨能力影响差异无显著性意义,低温保存的人BMSCs可作为组织工程骨的种子细胞。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

鸵鸟钙磷陶瓷支架细胞相容性研究

目的：评价由鸵鸟松质骨制备的钙磷陶瓷支架的细胞相容性。方法：通过物理、化学方法将煅烧的鸵鸟松质骨改性为HAP／β-TCP／NaCaPO4多相钙磷陶瓷，然后分离兔骨髓基质细胞，体外扩增、诱导后接种于鸵鸟钙磷陶瓷支架。骨髓基质细胞与支架复合培养8天，通过相差显微镜、扫描电镜观察细胞在材料上的粘附、伸展及生长情况。通过细胞计数观察细胞增殖情况。结果：骨髓基质细胞在鸵鸟钙磷陶瓷支架表面及孔隙内粘附、伸展、增殖良好。结论：鸵鸟钙磷陶瓷支架具有良好的细胞相容性。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

Genetic regulation of bone mass: from bone density to bone strength

Osteoporosis is a common disease characterized in adults by diminished bone density. Bone is an organ that evolves and grows throughout life, and establishing optimal bone density in childhood and adolescence serves to buffer bone loss later in life. Bone density, a measurable entity, is the clinical substitute for bone strength, or the ability to defend against fracture. Chronic diseases may adversely affect optimal peak bone density. Bone density is under genetic control, as revealed by three lines of investigations. These include (1) the finding of quantitative trait loci for bone density, (2) the finding that specific mutations in genes that are important in the development of osteoblast or osteoclast lineages alter bone density, and (3) the linkeage of known polymorphisms for genes involved in mineral homeostasis to bone density and/or fracture. Future therapeutics for improving peak bone density or delaying bone loss later in life may take advantage of the genetic nature of bone density development.This work was presented in part at the IPNA Seventh Symposium on Growth and Development in Children with Chronic Kidney Disease: The Molecular Basis of Skeletal Growth, 1–3 April 2004, Heidelberg, Germany     

跖骨感染骨外露的显微外科治疗

[目的]回顾总结跖骨骨感染骨外露的显微外科治疗方法。[方法]自1995年～2005年采用显微外科技术治疗214例跖骨骨外露骨感染患者。[结果]全部病例获得随访1～10年，平均随访3年，14例游离植皮术后皮肤成活良好，199例术后皮瓣全部成活，1例腓肠神经营养血管皮瓣移位修复术出现远端部分皮肤坏死，后经换药处理后，伤口自然愈合。皮瓣移植术后质地良好，无溃疡复发。患足均可负重走路。[结论]应用显微外科技术治疗跖骨骨感染骨外露可获得较好的疗效。     

重组合异种骨植骨修复骨囊肿所致骨缺损

2001年10月～2003年9月,笔者共收治28例骨囊肿患者,均采用病灶刮除,瘤腔灭活和重组合异种骨植骨治疗,获得满意疗效,体会如下。     

从骨免疫学到骨微生物学：肠道微生物如何调节骨骼

肠道微生物群被称为人体的第二个基因库,在维持人体平衡中起主要作用。不良饮食习惯、抗生素滥用、病理状态和生活环境改变会对肠道菌群产生负面影响,以引起多种疾病。最新研究发现肠道微生物群与骨质疏松症之间有着密切的联系,同时引入了一个新术语"骨微生物学",该研究领域旨在弥合骨骼生理学、胃肠病学、免疫学和微生物学之间的差距。本文简要介绍了肠道菌群通过免疫系统、新陈代谢和内分泌环境以及其他因素影响骨代谢的潜在机制,通过研究肠道菌群与骨骼健康之间的关系,不仅对于维持骨骼健康和最大程度地减少骨质疏松症很重要,而且对于肠道微生物群是否可作为骨质疏松症新型治疗靶标以及是否可用作骨折预测的生物标志物方面具有重要意义。     

复合人工骨修复骨良性病变切除后骨缺损

目的探讨骨良性病变切除后骨缺损的修复方法，并对其疗效进行评估。方法总结1999年1月-2003年10月我科应用混合自体骨松质的异体脱蛋白骨松质复合自体红骨髓治疗骨良性病变切除后骨缺损28例。年龄12—61岁，平均20，5岁。结果除2例因死亡失访外，其余26例均取得满意随访，平均骨愈合时间为4．2个月。骨腔大小或植骨量不同，骨愈合时间不同。骨腔越大，植骨越多，骨愈合时间越长。本组病例未见明显排斥反应及并发感染。随访至今，无一例复发。结论利用这种复合人工骨修复骨良性病变切除后骨缺损的方法可行性好，安全性高，自体损伤小，便于推广，可用于骨缺损的修复。     

Spinal fusions: bone and bone substitutes

Vertebral arthrodesis is one of the most commonly performed, yet incompletely understood, procedures in spinal surgery. Despite major progress in internal fixation techniques, the high rate of non-unions indicates that physiologic, biologic and molecular events that are crucial to this process are not well known. This article will analyze the general biology of bone regeneration, and particularly discuss the properties and use of various bone graft materials and graft substitutes. Received: 9 August 2000/Accepted: 11 August 2000     

脱钙冻干异体骨移植对骨缺损的修复作用

目的应用脱钙冻干异体骨（DFDBA）修复骨缺损，解决种植区的骨量不足问题。方法在种植外科中，将脱钙冻干异体骨用于19例种植区骨缺损患者，观察种植体动度、牙齿指数（GI）及x线改变等临床指标，评价其临床应用效果。结果19例植骨手术均获成功，无一例种植体周围炎发生，种植体初期稳定性良好。结论脱钙冻干异体骨既有一定的力学支持能力，又有骨诱导作用，且可塑性强。     

Aneurysmal bone cyst of the frontal bone

Aneurysmal bone cyst rarely affects the skull. We report two cases of aneurysmal bone cyst of the frontal bone. One of the cases is associated with pregnancy. The association of pregnancy with aneurysmal bone cyst and enlargement of the aneurysmal bone cyst during the pregnancy have been discussed.     

Assessment of bone density and bone loss

Osteoporosis International - Dual-energy X-ray absorptiometry has become the standard for the evaluation of osteoporosis. It is useful both for identifying those people who are going to be at risk...