临床分离弗劳地枸橼酸杆菌耐药性分析及质粒介导的AmpC酶基因检测

目的了解安徽地区临床分离弗劳地枸橼酸杆菌临床分布、耐药性及质粒介导Amp C酶(p Amp Cs)基因的流行情况。方法收集2012～2017年安徽省细菌耐药监控中心监测网内的34所医院报送的临床分离的104株弗劳地枸橼酸杆菌,采用琼脂稀释法进行抗生素敏感性实验。提取细菌质粒,聚合酶链式反应(PCR)检测质粒介导Amp C酶基因,对阳性扩增产物进行测序分析; Amp C酶阳性菌株做转移接合试验,PCR扩增并测序确定接合子的基因型;测定供体菌、受体菌和接合子对多种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。结果 104株弗劳地枸橼酸杆菌临床分布广泛,最多见于呼吸内科(30. 77%)及重症监护病房(24. 04%),标本来源以痰液、尿液最多。4株Amp C酶基因阳性的菌株中,有3株DHA-1基因阳性,1株ACT-1基因阳性。4株Amp C酶基因阳性的菌株有3株转移接合成功。这3株接合子与受体菌相比,对多种常用抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素的MIC值提高了8～128倍。结论弗劳地枸橼酸杆菌临床分布广泛,耐药严重,携带有质粒介导的Amp C酶基因的菌株对多种β-内酰胺类抗生素耐药,并且可通过接合性质粒在不同菌属间播散。     

肺炎克雷伯菌新的qnrB31和qnrB32基因的特性

目的研究肺炎克雷伯菌中质粒介导的喹诺酮类耐药基因的分布和特性。方法 PCR检测qnr、qepA、aac(6’)-Ib-cr基因,阳性产物进行DNA测序以确定其基因型,接合转移试验探讨质粒介导的喹诺酮类耐药基因的体外转移性,稀释法测定试验菌株的MIC,用切胶回收的方法初步定位耐药基因。结果我们在肺炎克雷伯菌KP3606株发现新的基因亚型qnrB31,GenBank登录号为HQ418999,肺炎克雷伯菌KP4047株发现新的基因亚型qnrB32,GenBank登录号为HQ704413;体外接合转移试验获得成功,各菌株和各接合子对喹诺酮类药物敏感试验有不同的结果,未检出qnrA、qnrS、qnrC、qnrD、qepA、aac(6’)-Ib-cr基因;经基因定位,qnrB31和qnrB32基因位于约23kb的质粒上。结论在喹诺酮类耐药的各种基因中,qnrB是最有可能发生变异的基因,应引起足够的重视。     

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。     

KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制研究

目的 研究克雷伯菌属对亚胺培南耐药机制以及KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制。方法 收集四川大学华西医院两个阶段（2009～2010年和2012～2013年）分离的对亚胺培南耐药的克雷伯菌属细菌。琼脂稀释法测定亚胺培南最低抑菌浓度(MIC),CARB ChromID平板和改良Hodges试验检测碳青霉烯耐药表型,PCR检测细菌的KPC-2基因表达。质粒接合试验检测质粒传播性。随机引物扩增多态性DNA（RAPD）方法和肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）技术分别用于分析质粒和菌株的同源性。结果 第一阶段筛选并确证耐亚胺培南的3株产酸克雷伯菌首先获得碳青酶烯类抗生素耐药性,第二阶段筛选并确证耐亚胺培南的7株肺炎克雷伯菌出现相同的获得性耐药。PCR显示10株细菌均携带KPC-2型基因。质粒接合试验显示产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因的质粒可以传递到受体菌,且与KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌中携带的质粒具有同源性。ERIC-PCR结果显示7株KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌具有同源性。结论 四川大学华西医院分离的对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌主要耐药机制是产生KPC-2型碳青霉烯酶。产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因质粒,该质粒具有传递性且与肺炎克雷伯菌携带质粒相同。肺炎克雷伯菌中耐药株的传播形式为同一克隆传播,而在克雷伯菌属中不同菌种间耐药传播途径为同一质粒的水平传播。     

质粒介导喹诺酮类qnr基因在肠杆菌科细菌中的流行及耐药特性研究

目的 了解质粒介导喹诺酮耐药qnr基因在临床分离的三种常见肠杆菌科细菌中的分布,研究qnr阳性株的质粒特性和流行播散情况.方法 VITEK-60全自动微生物分析仪检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性,琼脂稀释法检测环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC);PCR扩增质粒介导的喹诺酮类耐药基因 (qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS),阳性产物进行DNA测序比对以确定基因型;.对qnr基因阳性菌株进行接合转移试验,探讨qnr基因的可转移性;脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)分析同源性及流行播散情况.结果 301株大肠埃希菌中共检出qnr阳性菌株14株,其中2株同时携带两种基因,qnrA、qnrB、qnrS基因分别检出5、2、9株;145株肺炎克雷伯菌中共检出qnr阳性菌株17株,其中1株同时携带两种基因,qnrA、qnrB、qnrS基因分别检出1、11、6株;173株阴沟肠杆菌中共检出qnr阳性菌株57株,其中3株同时携带两种基因,qnrA、qnrB、qnrS基因分别检出14、36、10株;所有菌株中均未检出qnrC和qnrD基因;接合转移试验结果显示,14株qnr基因阳性的大肠埃希菌、17株qnr阳性肺炎克雷伯菌和57株qnr阳性阴沟肠杆菌中分别有4、3和26株体外接合成功,qnrB阳性阴沟肠杆菌中少数菌株存在同源性,大多呈散发流行趋势.结论 临床肠杆科细菌中存在qnr阳性菌株的流行,总体以qnrB为主;qnr基因在喹诺酮类耐药和敏感菌株中均存在,喹诺酮类药物敏感菌株中qnr基因的检出值得关注;qnr基因可通过其所在质粒进行水平转移;携带qnrB基因的阴沟肠杆菌大多无同源性,呈散发流行趋势.     

抗菌药物诱导性肠球菌耐药的实验研究

目的 研究肠球菌耐药性的产生机制,指导临床合理用药.方法 采用一步诱导法,对8株粪肠球菌、2株屎肠球菌进行四环素诱导性耐药试验.对诱导出的菌株用琼脂稀释法测定药物敏感性;用PCR法检测四环素耐药基因tetM、tetL.结果 10株实验菌中的2株诱导产生了多株稳定的四环素耐药株.耐药株的MIC分别为16～128 mg·L-1,与原株(MIC 0.25 mg·L-1、2 mg·L-1)比较,分别增加了64～512和16～64倍.在1株实验菌的诱导耐药株的质粒DNA上检测到tetL耐药基因,另一株实验菌株的诱导耐药株的染色体DNA上检测到tetM耐药基因.结论 一步法抗菌药物诱导性耐药试验的结果表明,肠球菌可在高于耐药MIC浓度的抗菌药物短期作用后获得耐药性.     

泛耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究

目的 研究铜绿假单胞菌(PA)泛耐药(PDR)机制.方法 琼脂稀释法测定14种抗菌药物对泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)的最低抑菌浓度(MIC).肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链反应(ERIC-PCR)分析耐药菌株同源性.PCR扩增检测超广谱B内酰胺酶(ESBL)、碳青霉烯酶、质粒介导AmpC酶等分析B.内酰胺类的耐药机制;PCR扩增检测16种氨基糖苷钝化酶基因分析氨基糖苷类耐药机制;PCR扩增检测qnr基因、DNA旋转酶基因gyrA、gyrB和拓扑异构酶Ⅳ基因parC和parE,分析氟喹诺酮类耐药机制;PCR扩增oprD2编码基因及序列分析和MC207110检测外排泵分析膜屏障机制引起的碳青霉烯类耐药机制.结果 19株PDR-PA的ERIC-PCR分型结果显示具有5个型别,其中以A和B型为主,分别有6株和7株.17株检出VEB-3型ESBL基因,其中1株同时检出OXA-10型ESBL基因;未检测出质粒AmpC酶和碳青霉烯酶基因.19株均检出ant(3")I氨基糖苷钝化酶基因,其中18株同时捡出ant(3)Ⅱ酶基因;19株发生gyrA突变,其中14株同时发生了parC突变,未检测出qnr基因.19株oprD2编码基因均发生小片段缺失.16株显示具外排泵机制.结论 提示产生VEB-3型ESBL、aac(3)Ⅱ和ant(3")I氨基糖苷钝化酶、DNA旋转酶gyrA和拓扑异构酶ParC基因发生突变,以及OprD2蛋白缺失和外排泵高表达是本组PDR-PA泛耐药的重要原因.     

五倍子对产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的体外抗菌和质粒消除作用

目的 筛选产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌临床分离菌株,考察五倍子水提液的体外抗菌活性和质粒消除作用。方法 采用水煎煮法制备五倍子水提液,肉汤稀释法进行产超广谱β-内酰胺酶菌株的表型初筛和确证,PCR法对阳性产酶菌株进行基因检测,琼脂平板稀释法测定体外MIC,影印培养法考察质粒消除作用。结果 五倍子水提液对大肠埃希菌临床分离株具有明显的抗菌活性,MIC值为25 mg/mL左右,从50株大肠埃希菌临床分离菌株中筛选到产超广谱β-内酰胺酶菌株12株,阳性率为24%,五倍子对产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的质粒有消除作用（24 h消除率为3.6%,48 h消除率为4.8%）,质粒消除后菌株对氨苄西林等抗生素的MIC值降低。结论 五倍子对临床耐药菌株具抗菌潜力。      

在铜绿假单胞菌临床分离株1类整合子中发现携带新型耐药基因盒

目的:研究铜绿假单胞菌中1类整合子的分布和结构特征及与多重耐药的关系.方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测铜绿假单胞菌1类整合酶基因(int Ⅰ)并扩增其可变区;DNA测序技术分析1类整合子可变区的耐药基因;对1类整合子阳性菌采用琼脂平皿稀释法测定其MIC并进行转移接合明确其耐药基因转移情况;脉冲场凝胶电泳法(PFGE)了解这些阳性菌的遗传相关性.结果:47株铜绿假单胞菌临床分离株中,29株携带1类整合子,未检测到3类整合子.这29株包含的整合子均扩增出长度约4.3 kb的可变区,核酸序列分析发现存在新型耐药基因盒组合形式aac(6')-Ⅱ-aadA13-cmlA8-oxa-10,Genbank基因号为EU182575.其中基因盒aadA13以往未在铜绿假单胞菌中发现.同时第3个开放阅读框与已知基因cmlA5有95%的同源性,为编码氯霉素外排泵的基因盒,将其命名为cmlA8.PFGE结果分析显示29株阳性菌株具有高度的同源性.结论:本院流行的铜绿假单胞菌携带包含新型基因盒及组合形式的Ⅰ类整合子,再次证实1类整合子参与了铜绿假单胞菌的耐药和多重耐药.     

临床分离阴沟肠杆菌中新型氨基糖苷类乙酰转移酶基因的检测

目的 了解临床分离阴沟肠杆菌中新型氨基糖苷类乙酰转移酶基因[aac(6')-Ib-cr基因]的分布.方法 PCR检测aac(6')-Ib-cr基因并将阳性扩增产物进行测序分析;纸片扩散法测定aac(6')-Ib-cr基因阳性菌株对13种抗菌药物的敏感性;改良三维试验检测高产AmpC酶和ESBLs; ERIC-PCR法进行aac(6')-Ib-cr基因阳性菌株同源性检测.结果 81株阴沟肠杆菌中,3株aac(6')-Ib-cr基因阳性(3.7%); aac(6')-Ib-cr基因阳性菌株对氟喹诺酮类,氨基糖苷类,氯霉素,氨苄西林,头孢西丁,第2、3代头孢菌素等显示多重耐药2株产ESBLs和AmpC,1株产ESBLs;ERIC-PCR电泳图谱型显示,3株aac(6')-Ib-cr基因阳性细菌均不属于同一型别.结论 临床分离阴沟肠杆菌中存在aac(6')-Ib-cr基因阳性菌株,为多重耐药、非克隆传播菌株,临床应加强检测和监测.     

耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌耐药机制及治疗策略研究

目的 探索耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌耐药机制及治疗对策.方法 收集来自该院的17株耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌临床资料,采用PCR方法扩增碳青霉烯类耐药基因;采用琼脂稀释法和肉汤稀释棋盘法测磷霉素单药及联合用药最低抑菌浓度(MIC)值,计算部分抑菌浓度指数(ΣFICI).结果 8株菌产blaNDM-1,9株菌产blaIMP,blaKPC、blaoxA-48、blasPM均未检出;磷霉素联合亚胺培南协同作用和相加作用占75.oo％,其中协同作用高达56.25％,磷霉素联合头孢哌酮/舒巴坦钠协同作用和相加作用占50.oo％.结论 磷霉素联合亚胺培南或头孢哌酮/舒巴坦钠体外有较好的抗菌活性,亚胺培南联合磷霉素效果可能更好.     

Transconjugation and genotyping of the plasmid-mediated AmpC β-lactamase and extended-spectrum β-lactamase genes in Klebsiella pneumoniae

Bsckgroud AmpC β-lactamases and extended-spectrum β-lactamases （ESBLs） are becoming predominant causes of resistance to third and forth-generation cephalosporins in Klebsiella pneumoniae （K. pneumoniae）. It is very difficult to treat infectious diseases caused by multidrug-resistant K. pneumoniae. The purpose of the present study was to investigate transconjugation and characteristics of β-lactamase genes in K. pneumoniae producing AmpC β-lactamases and ESBLs.
Methods AmpC β-lactamases were detected by three-dimension test and ESBLs by disc confirmatory test. Minimum inhibitory concentrations （MICs） were determined by agar dilution. Transfer of resistance to EC600 （Rifr） was attempted by conjugation in broth and screened on agar containing cefotaxime （2 μg/ml） plus rifampin （1024 μg/ml）. The genes encoding AmpC or ESBLs and their transconjugants were detected by PCR and verified by DNA sequencing.
Results The resistant rates to ampicillin and piperacillin were 100% in 18 isolates of K. pneumoniae. However, imipenem was still of great bactericidal activity on K. pneumoniae, and its MIC50 was 0.5 μg/mL. Eleven β-lactamase genes, including TEM-1, TEM-11, SHV-13, SHV-28, CTX-M-9, CTX-M-22, CTX-M-55, OXA-1, LEN, OKP-6 and DHA-1, were found from 18 isolates. And at least one β-lactamase gene occurred in each isolate. To our surprise, there were six β-lactamase genes in the CZ04 strain. Among 18 isolates of K. pneumoniae, the partial resistant genes in 8 isolates were conjugated successfully, which had 100% homological sequence with donors by sequence analysis. Compared with donors, 8 transconjugants had attained resistance to most β-lactams, including ampicillin, piperacillin, cefoxitin, cefotaxime and aztreonam, or even amikacin and gentamicin.
Conclusions R plasmids can be easily transferred between the resistant and sensitive negative bacilli. It is very difficult to block and prevent the spread of antimicrobial resistance. So more attention should be paid to reducing the frequency, times and dosage of antimicrobials, especially third or fourth cephalosporins.     

鲍曼不动杆菌OXA基因的检测及ISAba1对其表达的影响

[目的]了解鲍曼不动杆菌的OXA-碳青霉烯酶基因分布情况及插入序列1(ISAba1)对OXA -23基因表达的影响.[方法]收集临床分离的鲍曼不动杆菌无重复株110株.多重PCR扩增OXA - 23 - like、OXA - 24 - like、OXA - 51 - like、OXA - 58 - like基因,并测序...     

磷霉素对尿标本中分离细菌的药物抗菌活性分析

目的分析尿标本中常见分离细菌的磷霉素药物抗菌活性及其特点,为临床用药提供参考。方法对610株中段尿标本分离的细菌进行鉴定及耐药表型分析,同时应用标准琼脂稀释法进行磷霉素药物敏感性检测,包括大肠埃希菌150株、肺炎克雷伯菌150株、阴沟肠杆菌100株、鲍曼不动杆菌50株、金黄色葡萄球菌60株、屎肠球菌50株和粪肠球菌50株。结果不同细菌及其耐药表型之间磷霉素敏感性及最小抑菌浓度（MIC）折点存在差异。磷霉素对大肠埃希菌有很高的抗菌活性,敏感率达98%,但对肺炎克雷伯菌与阴沟肠杆菌的敏感率（分别为90%、85%）均低于大肠埃希菌;屎肠球菌MIC值分布略高于粪肠球菌;磷霉素对金黄色葡萄菌也有很好的抗菌活性,敏感率达90%,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）MIC值分布水平更高;而所有鲍曼不动杆菌的磷霉素MIC值均维持在高水平。结论磷霉素对常见泌尿系统感染细菌有较好的抗菌活性,但临床使用时要考虑不同细菌及耐药表型之间的差异。     

250株质粒介导的耐药淋球菌株的流行趋势分析

目的了解7年来广州地区质粒介导耐药淋球菌株的流行趋势。方法用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MICs),筛选出质粒介导四环素耐药淋球菌(TRNG),以及用纸片碘量法测定质粒介导的产青霉素酶的淋球菌(PPNG)。结果846株淋球菌检出PPNG131株(15.5%)、TRNG184株(21.8%),7年来,PPNG、TRNG流行率经μ检验,P<0.01,有显著性差异。结论PPNG和TRNG流行率呈逐年上升趋势,持续监测质粒介导耐药淋球菌株的流行趋势是十分必要的。     

泛耐药鲍曼不动杆菌整合子Ⅰ和ISCR1结构及基因分型研究

目的研究从临床分离的鲍曼不动杆菌的整合子Ⅰ和ISCR1的分布及结构情况,并对其进行基因分型。方法分离自临床的57株鲍曼不动杆菌,PCR检测整合酶Ⅰ、整合子Ⅰ、ISCR1以及ISCR1可变区,PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分型并进行测序分析可变区携带的耐药基因盒,ERIC-PCR进行基因分型。结果 49株整合酶I阳性,其中47株整合子I扩增阳性,RFLP分为2型,测序结果为aacA4-catB8-aadA1和drf17-aadA5。3株ISCR1以及ISCR1可变区扩增均阳性,可变区经RFLP分为1型,测序结果为orf513-qnrA1-ampR-qacEdeltal,ISCR1阳性菌整合子I均阳性,经ERIC-PCR检测将57株鲍曼不动杆菌分为27个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于鲍曼不动杆菌中,ISCRI携带率较低,氨基糖苷类、甲氧苄啶类和β-内酰胺类耐药基因盒较常见,ERIC-PCR可用于临床鲍曼不动杆菌的分子流行病学研究。     

磷霉素对肠杆菌科细菌的抗菌作用研究

目的评价磷霉素对肠杆菌科细菌的抗菌作用。方法收集3家医院2012年1月到2014年6月非重复分离的150株肠杆菌科细菌,包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和粘质沙雷菌各50株,其中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和粘质沙雷菌各包括25株碳青霉烯敏感株和25株碳青霉烯耐药株,用琼脂稀释法测定磷霉素药敏。结果150株肠杆菌科细菌对磷霉素的耐药率为25.3%,大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷菌对磷霉素的耐药率分别为2.0%、48.0%、26.0%;大肠埃希菌中碳青霉烯敏感株与碳青霉烯耐药株磷霉素耐药率分别为4.0%和0%,肺炎克雷伯菌中碳青霉烯敏感株与碳青霉烯耐药株磷霉素耐药率分别为0%和56.0%,粘质沙雷菌中碳青霉烯敏感株与碳青霉烯耐药株磷霉素耐药率分别为20.0%和24.0%。结论磷霉素对肠杆菌科细菌体外有较好的抗菌活性。