重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141的表达和生物活性测定

目的：建立表达及纯化重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（rhPTHrP1-141）的方法。方法：将已构建好的表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141重组质粒转化大肠杆菌M15[PREP4]，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。金属螯合亲和层析去除杂蛋白后，超滤离心进一步纯化目的蛋白。使用UMR106细胞测定所制备的rhPTHrP1-141对cAMP生成的刺激作用。结果：SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为rhPTHrP1-141。目的蛋白经纯化后，能刺激UMR106细胞内cAMP浓度升高，有剂量依赖关系。结论：成功建立了rhPTHrP1-141的制备及纯化方法，PTHrP1-141的表达量可达到60mg／L培养基。表达产物经体外实验证实具有生物活性。     

双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。     

慢性肾功能衰竭甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关蛋白的变化及相关性的临床研究

目的　探讨慢性肾功能衰竭 (CRF)患者甲状旁腺激素 (PTH)和甲状旁腺激素相关蛋白 (PTHr P)的关系。方法　采用放免法测定 92例 CRF患者和 30例正常人血清 PTH和血浆 PTHr P含量 ,并按 CRF分期 ,将 CRF患者分为四期。结果　 (1 )在慢性肾功能衰竭各个阶段 ,血清 PTH、血浆 PTHr P含量较正常对照组明显升高 (P<0 .0 1 )。 (2 )相关分析显示血清 PTH与血肌酐 (Scr)、血尿素氮 (BUN)、碱性磷酸酶 (AL P)、血压 (BP)存在显著正相关 (P<0 .0 1 ) ,与血红蛋白 (Hb)存在显著负相关 ,与钙 (Ca)、磷 (P)无相关性 (P>0 .0 5)。血浆 PTHr P与Scr、 BUN存在显著正相关 (P<0 .0 1或 P<0 .0 5) ,与 Ca、 P、 Hb、 ALP、 BP无显著相关性 (P>0 .0 5)。两者与年龄、病程均无显著相关性 (P>0 .0 5)。结论　 (1 )血清 PTH含量及血浆 PTHr P均可反映慢性肾功能衰竭的程度 ,其含量随肾功能损害的加重而逐渐升高。 (2 )血清 PTH含量及血浆 PTHr P反映肾功能损伤基本一致 ,但两者与 Ca、P、Hb、ALP、 BP相关性不完全相同     

重组腺病毒表达载体pDC316/PEDF的构建

目的：构建色素上皮衍生因子（PEDF）基因腺病毒表达载体，为老年性黄斑变性基因治疗奠定基础。方法：从大鼠视网膜组织中提取总RNA，RT—PCR扩增PEDF基因eDNA，并将回收的PEDF基因克隆入质粒pGEM—Teasy载体中，亚克隆入腺病毒表达载体质粒pDC316中，并以DNA序列分析加以证实。结果：基因测序结果表明，所克隆的PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列，与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDFmRNA序列（NM-177927）完全一致。结论：PEDF基因腺病毒表达载体的成功构建，为下一步体外包装成病毒颗粒研究基因治疗脉络膜新生血管奠定了基础。     

重组人甲状旁腺激素1-34的纯化研究

重组人甲状旁腺激素(rhPTH(1-34))在工程菌pET(32a+)-PTH(1-34)/BL21(DE3)中以胞内可溶性融合蛋白形式高效表达。经过高压匀浆破菌处理,取上清经过亲和层析、酶切、阴离子交换层析、反相层析和阳离子交换层析进行分离纯化,得到rhPTH(1-34)原液样品纯度在98%以上,比活性达到1.05×104U/mg。     

重组人甲状旁腺激素1-34的氨基酸组成分析

分析重组人甲状旁腺激素 1-3 4的氨基酸组成 ,为该品种的结构鉴定提供依据。水解条件含 1%苯酚的6mol L盐酸 ,10 5℃水解 2 4h ;衍生方法异硫氰酸苯酯 (PITC)柱前衍生法 ;氨基酸测定色谱条件色谱柱为PhenomenexprodigyODS 10 0A。 (4 .6mm× 2 5cm ,5 μm) ;流动相A为 0 .1mol L醋酸钠 (pH6.5 ) -乙腈 (93 :7) ,B为水 -乙腈 (1:4) ;二元梯度洗脱 ;检测波长为 2 5 4nm ;流速为 1ml min ;柱温为 40℃。结果 :实验值与理论值一致 ,偏差小于 10 %。本法准确、可靠、重现性好 ,可用于该产品的质量控制。     

乳糖诱导表达重组人甲状旁腺激素rhPTH(1-34)

目的研究以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组人甲状旁腺激素的可行性。方法对乳糖浓度、诱导时间及发酵培养方式进行研究,确定了乳糖诱导的最佳条件。结果 0.6%的乳糖诱导4 h,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白的56.8%,采取分批补料培养方式,5 L发酵罐中蛋白表达量达到42.6%。结论乳糖能作为诱导剂诱导rhPTH(1-34)在大肠杆菌中的表达。     

重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达

目的:将人类Tudor-SN蛋白SN(1～4)基因片段分别定向连入pERFP-C1质粒,使Tudor-SN蛋白SN各功能片段与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pERFP-C1载体上,再将构建成功的pERFP-C1-Tudor-SN-SN(1～4)重组质粒转染入HeLa细胞内,在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜下观察到红色融合蛋白的表达。结论:重组pERFP-C1-h Tudor-SN-SN(1～4)质粒构建及表达成功。     

重组人甲状旁腺激素(1-34)片段促进动物骨折愈合的研究

目的：通过实验动物骨折模型观察重组人甲状旁腺激素（1-34）片段[rhPTH（1-34）]促进动物骨折愈合作用，并初步探讨rhPTH（1-34）的作用机制。方法：制备日本大耳自家兔标准骨折模型，随机分为对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，高、中、低剂量组皮下间歇注射不同剂量的rhPTH（1-34）。检测血清骨特异性碱性磷酸酶（bAKP）、骨保护素（OPG）、骨钙素（BGP）、白介素-6（IL-6）指标，同时进行病理组织形态学及骨组织形态计量学观察。结果：X线片和组织学结果显示，与对照组相比，rhPTH（1-34）各组骨折愈合速度加快，骨形成活跃。rhPTH（1-34）各组在术后1周后，血清bAKP均明显升高（P〈0．05）。随后高剂量组bAKP仍呈上升趋势，其余各组随骨折愈合而逐渐下降至正常水平。除低剂量组外，其他实验各组血清OPG水平在2周达到最高值，随后除高剂量组外，也相对维持在高的水平。实验各组术后IL-6水平均比术前有一定程度的升高，术后4周对照组升高尤为显著。结论：rhPTH（1-34）可以促进兔骨折早期愈合，促进骨形成并且可抑制骨吸收。     

人Prp8蛋白基因片段的克隆

目的：构建人Prp8基因全长真核表达质粒。方法：从HeLa细胞中提取总体RNA,两步法合成cDNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,扩增出人Prp8基因的四段序列,首先克隆至pTZ57R/T载体,再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建pcDNA3.1（＋）-Prp8重组质粒。结果：RT-PCR法获得Prp8基因的4段序列,长度分别为2025、1090、1966、1963bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1（＋）真核表达载体连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1（＋）-Prp8重组质粒构建成功。结论：成功克隆了人Prp8的编码基因,并构建了表达载体pcDNA3.1（＋）-Prp8。     

人类U5·116 ku蛋白基因片段的克隆

目的:构建人类U5·116 ku基因全长真核表达质粒。方法:从HeLa细胞中提取总体RNA,一步法合成单链cDNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,扩增出人类U5·116 ku基因两段连续的序列,首先分别克隆至pTZ57R/T载体,两段序列连接成全长后再定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒。结果:RT-PCR法获得U5·116 ku基因两段连续的序列,长度分别为1672bp和1246bp,分别与pTZ57R/T载体连接后,选择合适的酶切位点再连接成全长序列,然后将全长序列和pcDNA3.1(-)真核表达载体进行连接、转化、酶切鉴定及序列分析后,证实pcDNA3.1(-)-U5·116 ku重组质粒构建成功。结论:成功克隆了人类U5·116 ku的编码基因,并构建了其真核表达质粒pcDNA3.1(-)-U5·116 ku。     

重组人甲状旁腺激素基因工程研究进展

甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）是由甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激素。它主要调节脊椎动物体内钙和磷的代谢。目前,PTH及其类似物已成为治疗骨质疏松症的首选药物。随着PTH基因序列的阐明,通过基因工程手段获得高效、低毒、稳定的重组PTH,已成为研究热点。本文对PTH的结构功能、基因工程研究及临床应用问题进行综述。     

Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒的构建和制备

目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒。方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶SalⅠ、KpnⅠ切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs。电转法将被PmeⅠ切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7～11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.281 5×1012 V.P/mL。结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。     

绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的人脂联素（Adiponectin）真核表达质粒。方法：用本实验室已构建好的人脂联素克隆载体pMD18—T／Adiponeetin为模板，结合已设计好的特异性引物。采用PCR方法克隆出Adiponectin目的片段，将该目的片段再连至真核表达载体pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO上，转化入TOP10感受态细胞中，通过筛选得到融合有绿色荧光蛋白的重组质粒pcDNA3．1／CT—GFP—TOPO—Adiponectin。结果：PCR获得长度为736bp的目的片段，经pcDNA3．1／CT—GFP-TOPO真核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与genebank检索的人脂联素cDNA序列（Accession NM-004797）100％配。结论：绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体构建成功。     

MIBP1基因敲除载体的构建

目的:构建MIBP1基因敲除载体。方法:以小鼠129胚胎干细胞基因组DNA为模板,根据GenBank注册序列,扩增小鼠MBP-2基因启动子区5′端片段(5′arm)和内含子区3′端片段(3′arm),然后分别克隆进敲除载体pKOScramblerNTKV-1906,酶切鉴定后即得到MIBP1基因敲除载体pNTKV-3′,5′arm。用SalⅠ对pNTKV-3′,5′arm线性化,用于胚胎干细胞电转染。结果:成功扩增并克隆到小鼠129胚胎干细胞MBP-2基因的5′arm和3′arm片段,构建了MIBP1基因敲除载体。结论:成功构建了MIBP1基因敲除载体。     

人TIMP-2基因逆转录病毒重组体的构建及表达

目的：构建含人ＴＩＭＰ－２基因可调控逆转现毒重组体。方法：通过四步亚克隆将编码人组织金属蛋白酶抑制剂－２（ＴＩＭＰ－２）的基因片段从表达载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中切下,定向插入经改良的逆转录病毒载体ｐＬ－ＭＴ上,以限制性内切酶鉴定插入方向是否正确。结果：结果：限制性内切酶谱分析与理论计算相等。结论：含人组织金属蛋白酶抑制剂ＴＩＭＰ－２基因可逆转录病毒重组体构建成功,为体外胶原代谢的基因调控研究提供