多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法

目的 建立一种快速鉴定和鉴别五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法.方法 利用五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因stx1、stx2、eaeA、lt、stIb、aggR、ipaH及16S rRNA基因rrs,建立8重PCR反应体系,并对PCR引物、反应体系和循环条件进行优化.结果 8对PCR引物均能特异地扩增相...     

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

多重PCR和基因芯片检验致病性大肠埃希菌

致病性大肠埃希菌包括肠道致病性和肠道外致病性两大部分。两部分中又各包括多种致病性大肠埃希菌。长期以来,此类细菌的检测缺乏可常规应用的鉴别手段,成为临床细菌学检验的薄弱环节。此类感染的普遍性和严重性迫切需要可靠的致病性大肠埃希菌的检测技术。该文重点介绍多重PCR技术同时检测多种致腹泻大肠埃希菌以及基因芯片技术同时检测多种肠道内和肠道外感染的大肠埃希菌。     

北京某医院感染性腹泻患者致泻性大肠埃希菌毒力和耐药特征分析

目的 明确本院感染性腹泻患者致泻性大肠埃希菌毒力和耐药特征。方法 采用VITEK MS微生物质谱检测系统初步鉴定,多重实时荧光PCR检测毒力基因,对本院感染性腹泻患者临床分离的致泻性大肠埃希菌(Diarrheagenic Escherichia coli, DEC)进行5种型别鉴定。微量肉汤稀释法和E-test法药敏试验检测DEC菌株的耐药表型特征。二代测序及生物信息学分析其耐药分子特征。采用Fisher确切概率法进行统计学分析。结果 本院DEC检出率为11.9%,其中EAEC占比37.5%,非典型EPEC占比34.38%,ETEC占比25.0%,EIEC占比3.12%,未检出EHEC菌株。32株DEC对氨苄西林、四环素、甲氨苄啶/磺胺异恶唑耐药率最高,分别为53.12%、43.75%和37.5%。ESBLs(+)株占比18.75%,其多重耐药菌株检出率为83.83%,显著高于ESBLs(-)菌株,差异有统计学意义(P=0.042)。32株DEC共有25个ST型,优势基因型为ST10共4株(12.5%),ST28、ST31和ST3153各2株(各占比6.25%),其他21个型别各1株菌...     

长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌实时荧光多重PCR检测结果分析

目的了解长沙市食品从业人员致泻大肠埃希菌感染、分布及毒力基因携带情况。方法抽取长沙市9个单位258例食品从业人员为研究对象,采用实时荧光多重聚合酶链反应(PCR)检测致泻大肠埃希菌。结果致泻大肠埃希菌感染率为15.5%(40/258),其中肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)占10.9%(28/258),肠致病性大肠埃希菌(EPEC)占3.1%(8/258),肠出血性大肠埃希菌(EHEC)占1.6%(4/258),未检出肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)。28株EAEC携带uidA基因26株,aggR+pic基因13株,astA基因27株,携带率分别为92.9%、46.4%、96.4%;8株EPEC全部携带eae和uidA基因;4株EHEC中3株携带eae基因,且都携带stx1+stx2基因。结论建立持续监测致泻大肠埃希菌的机制和深入研究其分子流行病学理论,除了为监管部门制订和评价公共卫生措施提供基础数据,对评价食品安全状况,有效控制传染源、保护人民群众健康具有重要意义。     

北京市朝阳区腹泻患者致泻性大肠埃希菌流行特征及毒力基因携带情况分析

目的分析北京市朝阳区感染性腹泻样本中致泻性大肠埃希菌（DEC）流行特征及毒力基因携带情况。方法收集2014 — 2017年北京市朝阳区哨点医院感染性腹泻样本,分离培养后应用real-time PCR方法检测DEC的主要毒力基因。 其中利用eae、stx1、stx2、lt、st、aggR和ipaH 7种毒力基因进行DEC的分型鉴定,此外,检测并分析bfpA、astA、escV、pic、perA、ehxA、pet和ipaBCD等重要的毒力基因分布情况。结果从1 977份腹泻样本中共分离出94株DEC,检出率为4.75%。 DEC的检出率具有随年龄增加而升高的趋势。 0 ~ 5岁年龄组肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）和肠致病性大肠埃希菌（EPEC）构成比分别是59.62%、23.08%。 5岁以上年龄组肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）构成比是59.52%。 81.25%EPEC（13/16）未携带bfpA,为非典型EPEC（aEPEC）。 38株EAEC中astA、pic和pet的携带率分别为39.47%、68.42%和92.11%。 30株ETEC的st、lt和astA携带率分别是46.67%、56.67%和53.33%;仅1株（3.33%）ETEC同时含有st和lt。 4株EHEC全部携带 eae、escV和ehxA。 6株肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）中ipaBCD、astA携带率为16.67%和33.33%。结论北京市朝阳区流行的DEC以EAEC、ETEC和EPEC为主,其中EPEC主要为aEPEC。 婴幼儿主要感染EAEC,成年人主要感染ETEC。 DEC中存在多种毒力基因,其中astA广泛存在于多种DEC中。     

北京地区腹泻就诊患者中肠致病性大肠埃希菌分离株特征分析

目的 分析北京市通州区腹泻就诊患者中肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离株的特征。 方法 eaeA基因聚合酶链反应(PCR)扩增阳性的菌株,进行系统生化鉴定、EPEC诊断血清分型、bfpA基因PCR扩增以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。 结果 20株成年人腹泻患者EPEC分离株中,仅1株鉴定为O126血清群;4株儿童腹泻患者分离株中,仅1株鉴定为O26血清群。儿童与成年人腹泻患者EPEC分离株bfpA基因均为阴性。23株EPEC菌株的PFGE带型呈高度多态性,聚类图显示与患者年龄及性别无明显相关。 结论 北京市通州区腹泻患者EPEC分离株以非典型为主,单纯通过血清群来诊断EPEC的方法,将会造成极大的漏诊。     

儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的检测

目的了解儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的感染情况。方法对95份腹泻患儿粪标本中分离出的大肠埃希菌,用荧光聚合酶链反应（PCR）的方法检测毒力基因,鉴定致泻性大肠埃希菌。结果检测出15株阳性菌株,阳性率为15．8％,其中肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）6株、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）4株、弥散聚集性大肠埃希菌（DAEC）4株和肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）1株。结论致泻性大肠埃希菌是引起儿童腹泻的主要致病菌,临床实验室应加强对致泻性大肠埃希菌的检测。     

肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因型检测的多重聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立快速准确的肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因检测的多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)方法,并在人及动物源菌株中应用. 方法 针对肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌、vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3保守基因设计引物,建立肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因型检测的MPCR方法;应用建立的MPCR方法检测98株人及动物源菌株菌种及万古霉素耐药基因,并比较MPCR方法检测结果与检测菌株的VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪菌种鉴定结果及琼脂稀释法的万古霉素及替考拉宁药敏检测结果,分析MPCR方法检测结果与其他方法的一致性. 结果 成功建立了用于检测肠球菌属和常见肠球菌种及万古霉素耐药基因型的MPCR方法.MPCR方法和VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪对98株检测菌株菌种鉴定结果一致;MPCR方法检测98株菌万古霉素耐药基因型与药敏检测其耐药表型相对应. 结论 建立的MPCR方法成功用于检测人及动物源肠球菌种属及万古霉素耐药基因型,为快速准确鉴别肠球菌种属及万古霉素耐药肠球菌耐药基因型提供方法,对于有效监测万古霉素耐药肠球菌,控制其传播、流行具有重要意义.     

多重聚合酶链反应检测革兰阴性杆菌中质粒介导ampC基因

目的运用多重聚合酶链反应(PCR)检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因,了解该基因在我院的流行情况。方法采用头孢西丁初筛试验筛选出符合头孢菌素酶(AmpC)表型筛选条件的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌共50株,通过热裂解法进行DNA抽提,采用6组ampC特异引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物,进一步DNA测序确定其基因型。结果50株试验菌中有8株为阳性,分别为肺炎克雷伯菌5株,大肠埃希菌3株,基因型为CIT型1株,DHA型4株,EBC型3株。结论我院质粒介导ampC基因型主要为DHA型、EBC型和CIT型。多重PCR是特异性高、简便检测质粒ampC基因型的分子生物学方法。     

多重聚合酶链反应检测革兰阴性杆菌中质粒介导ampC基因

目的运用多重聚合酶链反应（PCR）检测革兰阴性杆菌的质粒ampC基因,了解该基因在我院的流行情况。方法采用头孢西丁初筛试验筛选出符合头孢菌素酶（AmpC）表型筛选条件的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌共50株,通过热裂解法进行DNA抽提,采用6组ampC特异引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物,进一步DNA测序确定其基因型。结果50株试验菌中有8株为阳性,分别为肺炎克雷伯菌5株,大肠埃希菌3株,基因型为CIT型1株,DHA型4株,EBC型3株。结论我院质粒介导ampC基因型主要为DHA型、EBC型和CIT型。多重PCR是特异性高、简便检测质粒ampC基因型的分子生物学方法。     

产志贺样毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定

目的　探讨产志贺样毒素大肠埃希菌（ Ｓ Ｌ Ｔ Ｅ Ｃ） 在小儿腹泻中的病原学地位。方法　根据肠出血性大肠埃希菌（ Ｅ Ｈ Ｅ Ｃ） Ｏ１５７ ： Ｈ７ 的 Ｓ Ｌ Ｔ１ 、 Ｓ Ｌ Ｔ２ 、ｅａｅ Ａ 基因片段设计了３ 对引物,采用聚合酶链反应检测大肠埃希菌中 Ｓ Ｌ Ｔ１ 、 Ｓ Ｌ Ｔ２ 和ｅａｅ Ａ 毒力基因。结果　２９ 株标准致泻大肠埃希菌（ Ｅ Ｈ Ｅ Ｃ、 Ｅ Ｐ Ｅ Ｃ、 Ｅ Ｔ Ｅ Ｃ） 和１０ 株其他肠道病原菌中,只有１ 株 Ｅ Ｈ Ｅ Ｃ检出 Ｓ Ｌ Ｔ１ 、 Ｓ Ｌ Ｔ２ 、ｅａｅ Ａ 毒力基因,其他均为阴性。从１ ０３２ 例腹泻患儿粪便中分离的４７４ 株未定型大肠埃希菌中,检出 Ｓ Ｌ Ｔ１ ２０ 株（４２ ％ ） , Ｓ Ｌ Ｔ２ ７ 株（１５ ％ ） ;７４ 株肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希菌（ Ｅ Ｓ Ｉ Ｅ Ｃ） 中检出 Ｓ Ｌ Ｔ１ １５ 株（２０３ ％ ） , Ｓ Ｌ Ｔ２ ５株（６８ ％ ） 。结论　 Ｓ Ｌ Ｔ Ｅ Ｃ 是太原地区引起小儿腹泻的一种重要的致泻病原菌。     

多重聚合酶链反应检测呼吸机相关性气管-支气管炎和肺炎患者常见致病菌的研究

目的 探讨多重聚合酶链反应(PCR)技术在快速检测呼吸机相关性气管-支气管炎(VAT)和呼吸机相关性肺炎(VAP)常见致病菌中的临床作用和价值.方法 留取75例外科重症监护病房(ICU)机械通气并发VAT或VAP患者的痰标本,进行细菌培养、普通PCR、多重PCR检测,比较3种方法对致病菌检出率的差异.结果 细菌培养法对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯杆菌分离阳性检出率分别为50.7％、45.3％、30.7％、41.3％和58.7％,普通PCR阳性检出率分别为88.0％、89.3％、78.7％、85.3％和93.3％,多重PCR阳性检出率分别为92.1％、90.7％、82.7％、89.3％和96.0％.普通PCR和多重PCR对5种致病菌的阳性检出率均高于细菌培养(均P＜0.05);且多重PCR较普通PCR具有快速检测的优点.结论 与细菌培养比较,普通PCR和多重PCR对VAT和VAP5种常见致病菌的阳性检出率高,且多重PCR可有效节省人力、财力.     

多重聚合酶链反应在肺炎链球菌血清学分型中的应用

肺炎链球菌是儿科感染中常见的病原菌之一。基于荚膜多糖抗原的特点,传统荚膜肿胀实验可将肺炎链球菌分为46个血清群,90多种血清型。近年来随着分子生物学技术的发展,多重聚合酶链反应(MPPCR)技术不断成熟并逐步代替常规的荚膜肿胀实验,用于血清学分型。该技术具有简便快速、成本相对较低等优点,能有效的监测临床上肺炎链球菌流行血清型。     

乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法,并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物,并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件;将T载体与HBVRT区扩增后纯化的产物进行连接反应,然后转染大肠杆菌（DH5a）,经蓝、白斑筛选后挑取阳性菌落,提取质粒,制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：10的缓冲液倍比稀释,制作标准曲线,线性方程为：Y=-3．344X＋37（r2=0．9999）;通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA,表明其最低检测限为5×10^2 IU／mL;拷贝数介于5×10^2～5×10^8 IU／mI。之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法;该方法可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药;联合该法与血清标志物检测,可更准确评价HBV感染者病情。