多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的检测

目的了解儿童肠道感染中致泻性大肠埃希菌的感染情况。方法对95份腹泻患儿粪标本中分离出的大肠埃希菌,用荧光聚合酶链反应（PCR）的方法检测毒力基因,鉴定致泻性大肠埃希菌。结果检测出15株阳性菌株,阳性率为15．8％,其中肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）6株、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）4株、弥散聚集性大肠埃希菌（DAEC）4株和肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）1株。结论致泻性大肠埃希菌是引起儿童腹泻的主要致病菌,临床实验室应加强对致泻性大肠埃希菌的检测。     

多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

多重PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的 建立一种快速、特异的检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌株的多重PCR方法。 方法 针对O157:H7菌株的O157、H7抗原特异基因rfbE O157、fliC H7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因设计相应引物,在同一扩增体系中进行PCR反应,通过优化多重PCR 反应条件和循环参数,建立检测O157:H7菌株的多重PCR方法,并测定其特异性和灵敏度。 结果 6 对特异性引物各自扩增相应的基因片段,检测结果与常规PCR 获得的结果一致。细菌纯培养物的检测灵敏度为1.33×10⁴ CFU。 结论 该多重PCR方法能在一次检测中同时反映待测菌株是否为肠出血性大肠埃希菌O157:H7及其携带毒力基因的情况,可为O157:H7大肠埃希菌感染的诊断及流行病学调查提供一种简便、快速的检测手段。     

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx1和stx2基因

摘要：目的：建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。 方法：根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。 结果：双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×10² copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×10³ CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。 结论: 建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。     

联合分子检测法对腹泻患者粪便中致泻性大肠埃希菌的调查

  目的  采用胃肠道感染测试条（FA GI）联合实时聚合酶链式反应（PCR）直接检测法,回顾性调查山东省青岛市腹泻患者致泻性大肠埃希菌（DEC）的感染情况及菌株基因型,并与传统方法进行比较,探讨不同检测方法在腹泻监测中的应用。  方法  对2018年青岛市2家哨点医院采集的263份腹泻粪便标本,采用传统培养法分离大肠埃希菌并送至青岛市疾病预防控制中心,利用多重PCR方法鉴定DEC;同时采用FA GI联合实时PCR的方法直接检测粪便中的DEC。 将每5份粪便样标本混合为1份混合样品,用FA GI进行检测,再用实时PCR方法检测阳性混合样品中的单个样品。  结果  263份标本中,采用传统分离培养联合多重PCR法检测,15份样品阳性,阳性率为5.7%。 其中,肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）阳性的标本分别为7、4、3、1份。 采用FA GI联合实时PCR直接检测法检测,阳性样品35 份,阳性率为13.3%。 其中ETEC、EAEC、EPEC、EIEC阳性的标本分别为12、12、9、2份。 2种方法均未检到产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）阳性的标本。 2种方法毒力基因检测结果一致。 EAEC、ETEC、EPEC携带的主要毒力基因分别为pic、estIb和eae。  结论  FA GI联合实时PCR直接检测法显著提高了粪便中DEC的检出率,敏感性和特异性高,省时省力,可以辅助DEC常规监测,准确地反映DEC的流行和分布情况,为DEC的防控提供有力的实验室依据。     

2016年福建省永安及南平监测点五种致泻性大肠埃希菌监测分析

目的 对福建永安及南平两个检测哨点2016年的281份腹泻病例进行5种致泻性大肠埃希菌病原检测,为病例的确诊及致泻性大肠埃希菌流行病学的提供实验数据.方法 收集281份其他感染性腹泻病例(排除霍乱、菌痢、伤寒副伤寒)的粪便标本,接种麦康凯平板,选取初步生化符合大肠杆菌的菌落,然后用致泻性大肠埃希菌多重PCR和单重PCR检测方法确定其致病型别.结果 281份腹泻病例粪便标本共检出致泻性大肠埃希菌17株,检出率6.05%,其中aEPEC 4株,ETEC 6株,EAEC 7株,其他型别未检出.结论 福建地区致泻性大肠埃希菌致病型别以aEPEC,ETEC,EAEC为主,多重PCR检测方法能有效的对致泻性大肠埃希菌病进行确诊及了解菌株的毒力基因携带情况,并为我省的致泻性大肠埃希菌的流行病学资料的积累及疾病防控提供快速客观的依据.     

江苏省建湖地区大肠埃希菌O157:H7毒力基因分析

目的对检测出的17份肠出血性大肠埃希菌0157：H7阳性菌株进行毒力基因分析。方法收集江苏省建湖地区2008年5月～9月监测出的17株肠出血性大肠埃希菌0157：H7阳性菌株,利用单一和多重PCR法检测不同来源菌株0157抗原编码（rfbE）、H7鞭毛抗原编码（fliC）、志贺样毒素（stx1和stx2）、溶血素（hly）和黏附抹平因子（eaeA）。结果通过血清学方法确定的17株肠出血性大肠埃希菌0157：H7阳性菌株,再通过PCR法检测,其中15株大肠埃希菌rfbE和fliC基因检测为阳性,确认为EHEC O157：H7,其中9株菌株扩增出全部毒力基因,5株菌株扩增出除stxl外其它全部毒力基因,1株仅检出stx2,hly毒力基因;2株大肠埃希菌rfbE基因检测阳性、fliC基因检测为阴性,确认为O157：H7-大肠埃希菌,无毒力基因检出。结论该地区存在O157：H7大肠埃希菌强毒株污染,从流行病学角度看具潜在的流行性危险,当地疾控部门应加强O157：H7的综合监测。     

rep-PCR检测产ESBL大肠埃希菌

目的　用重复序列引物聚合酶链反应 (rep- PCR)的方法分析呼吸科住院患者痰标本中分离到的产超广谱β内酰胺酶(ESBL)大肠埃希菌是否同一起源菌株。方法　用双纸片确认法检测超广谱β内酰胺酶 (ESBL)。用K B法测定对抗生素的敏感程度,选用肠道菌广泛存在的基因间重复片段为引物进行扩增,对产ESBL大肠埃希菌进行基因分型。结果　rep -PCR法可将大肠埃希菌扩增出丰富的区带。分离到的 22株产ESBL大肠埃希菌分属 3个基因型。结论　rep- PCR法可用于医院内感染的流行病学调查。     

深圳地区产ESBLs大肠埃希菌CTX—M基因分型研究

目的 利用聚合酶链反应(PCR)技术和基因序列测定技术,了解深圳地区产CTX-M大肠埃希菌基因型分布情况,并分析产CTX-M酶大肠埃希菌的耐药性.方法 应用3组PCR引物分别扩增产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌株质粒DNA的CTX-M基因,并对所有阳性的PCR产物进行DNA测序.应用琼脂稀释法检测所有产CTX-M大肠埃希菌株的最低抑菌浓度(MIC).结果 121株产ESBLs大肠埃希菌共检出CTX-M基因阳性株87株,总阳性率为71.9%,测序结果显示6株为CTX-M-3型,10株为CTX-M-15型,58株为CTX-M-14型,9株为CTX-M-9型,4株为CTX-M-13型.检出的87株CTX-M型大肠埃希菌株对头孢噻肟的耐药最为突出,对头孢他啶、氨曲南和头孢吡肟的耐药率较低.结论 产CTX-M大肠埃希菌基因型主要为CTX-M-14基因型.产CTX-M酶大肠埃希菌对亚胺培南活性最高,其次为哌拉西林/他唑巴坦、头孢西丁、阿米卡星和阿莫西林/克拉维酸等.临床上可依据药敏报告加以选用.     

鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法

目的 建立一种快速鉴定和鉴别五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法.方法 利用五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因stx1、stx2、eaeA、lt、stIb、aggR、ipaH及16S rRNA基因rrs,建立8重PCR反应体系,并对PCR引物、反应体系和循环条件进行优化.结果 8对PCR引物均能特异地扩增相...     

空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157多重PCR分子检测研究

目的建立同时检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌（简称单增李斯特菌）和大肠杆菌O157的多重聚合酶链反应（PCR）检测技术。方法根椐空肠弯曲菌mapA基因序列、单增李斯特菌的编码溶血素（hly）基因序列和大肠杆菌的O157抗原（rfbE）基因序列,分别设计了3对特异引物,PCR扩增的目的基因片段为589 bp、360 bp和194bp;并对反应条件进行了优化。结果对3种致病菌检测,多重PCR检测DNA的敏感度分别为空肠弯曲菌2.264 ng、单增李斯特菌37.92 ng、大肠杆菌2.100 ng,样品检测时间6-8 h。结论该方法操作简便,检测周期短,特异性和敏感度高,为同时检测污染样品中空肠弯曲菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157奠定了基础。     

用聚合酶链反应检测LT—大肠埃希菌

本文报告了用聚合酶链反应快速检测ＬＴ－Ｅ Ｃｏｌｉ的实验方法及应用。使用了二个寡核苷酸引物，直接将大便标本接种于ＬＢ肉汤中，对ＬＴＡ亚基一段高度保守区域的ＤＮＡ进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，检测了３０株细菌，只有ＬＴ－Ｅ Ｃｏｌｉ，ＬＴ／ＳＴ－Ｅ Ｃｏｌｉ为阳性，其余细菌检测均为阴性，最低检测细菌量为５０ＣＦＵ，整个检测过程在７ｈ内完成。用此方法，检测了４０株从腹泻患者标本中分离的大肠埃希菌，并     

一种多重PCR方法快速鉴定7种常见肠道病原菌

目的 建立一种能够快速检测并分型5种致泻性大肠埃希菌、志贺菌及沙门菌的多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR) 方法。 方法 设计针对7种常见肠道致病菌的12对引物,通过多重PCR方法扩增后电泳观察相应条带,确定病原菌。临床标本直接划线接种于肠道选择性平皿,挑取可疑菌落直接提取核酸进行多重PCR检测。 结果 所有标准菌株均能扩增到相应目的片段,322份腹泻病标本中使用该方法共检出志贺菌24株(福氏志贺菌7株、宋内志贺菌17株)、 沙门菌5株、EPEC共12株(均为aEPEC)、ETEC共6株(elt阳性3株;est阳性3株)、EIEC共3株、VTEC共1株(stx1和stx2A均阳性)、EAEC共3株。 结论 该方法快速特异,能同时检测7种常见肠道致病菌,可用于腹泻病常见病原的快速检验。     

脓毒症常见病原菌多重实时PCR检测方法的建立

目的 建立可同时检测脓毒症患者血液中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的多重实时PCR方法。方法 根据各病原菌基因组保守序列设计引物和探针,建立多重实时PCR检测方法。对建立的多重实时PCR检测方法进行特异性、敏感性和灵敏度分析,并使用该法对112份脓毒症血培养阳性标本进行验证。结果 成功建立脓毒症常见病原菌的多重实时PCR检测方法。此方法特异性、敏感性良好,灵敏度达10-5 ng/l,与标准检测方法（血培养加生化鉴定）相比,缩短了20 h。112份临床血培养阳性标本中,目标病原菌83例,多重实时PCR检出80例阳性;非目标病原菌29例,多重实时PCR检测均为阴性。检测结果显示,该方法特异性达100%,敏感性达96.39%。结论 该多重实时PCR检测方法具有快速、高效、灵敏、特异的优点,可用于临床重症监护室患者血液常见感染病原菌的诊断。     

Development of a multiplex PCR assay for the identification of pathogenic genes of Escherichia coli in milk and milk products

A multiplex PCR for the simultaneous detection of some pathogenic genes of enteropathogenic, enterotoxigenic and verocytotoxin-producing Escherichia coli was developed. In this study primers found in literature as well as primers to the purpose designed were used. In this way, it was possible to generate specific fragments of 96, 170, 229, 285, 348, 414 and 510 bp for Hlya, St, EaeA, Lt, Vt1, UidA and Vt2 genes, respectively. When applied to bacterial strains experimentally inoculated in milk and milk products, the proposed PCR showed a detection limit of 5 x 10(4)CFU/ml for Hyla, St, Eaea, Vt1 primers, while for Lt and Vt2 primers the limit resulted of 10(6)CFU/ml.     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应（PCR）方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白（hilA）基因、变形杆菌溶血素（hpmA）基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用PrimerPremier5．0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401bp、256bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16（4^3）正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为：94．07pg沙门菌DNA,140．85ng变形杆菌DNA,1．41ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4h培养后样品的最低检测限度分别为：沙门菌10^0菌落形成单位（CFU）／mL、变形杆菌10^1CFU／mL、金黄色葡萄球菌10^0CFU／mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

2010-2015年深圳市龙岗区肠产毒性大肠埃希菌感染的流行特征及脉冲场凝胶电泳分子分型

目的 了解广东省深圳市龙岗区腹泻患者中产毒性大肠埃希菌（ETEC）的流行状况及菌株的分子特征。方法 对2010-2015年来自深圳市龙岗区散发腹泻病例的1204份粪便标本进行ETEC分离培养、生化、血清分群及PCR毒力基因（estIa、estIb、elt）鉴定,并采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对阳性菌株进行分子分型。结果 腹泻人群中ETEC的阳性率为5.8%;年龄分布上检出率差异有统计学意义,以19~25岁成年人感染多见;季节分布上检出率差异无统计学意义。70株ETEC共检出14种血清型,以O159和O148多见,分别占25.7%和18.6%;携带毒力基因以estIb为主,占65.7%。PFGE共分为60个型别,共存在10个克隆群组,C、G为地区内的优势克隆株。结论 2010-2015年深圳市龙岗区腹泻患者中ETEC的检出率较稳定,流行具有年龄分布特征,感染呈高度散发状态,但存在优势克隆菌株的感染流行。