携带幽门螺杆菌hpaA基因减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建

构建携带幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA基因的重组活减毒鼠伤沙门疫苗菌。方法：用分子生物学方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行核苷酸测序,重组质粒经再导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,提取重组菌苗质粒,聚合酶链反应（PCR）和酶切鉴定,筛选目的克隆。结果：经PCR和酶切证实,构建了携带hpaA基因（560bp)的重组核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结论：S我建并鉴定了携带H.pylorihpaA基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌,为探索制备H.ylori口服份活疫苗奠定了基础。     

携带幽门螺杆菌热休克蛋白B亚单位基因重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建和鉴定

背景：幽门螺杆菌(h.pylori)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，以减毒鼠伤寒沙门菌为载体构建活疫苗己成为探索新型H．pylori疫苗的重要途径。目的：构建携带H．pylori热休克蛋白B亚单位(hspB)基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌。方法：应用基因工程技术将1640bp的hspB基因克隆入原核表达质粒pTrc99A。对重组质粒进行序列测定，并将测序结果与基因文库中H.pylori-hspB的基因和蛋白序列进行BLAST分析，再将重组质粒导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。结果：重组质粒经聚合酶链反应(PCR)和双酶切，证实构建了携带hspB基因的重组原核表达质粒pTrc99A—hspB，后者成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL3261。所构建的重组质粒pTrc99A—hspB中所含的H.pylori-hspB与基因文库中量H.pylori-hspB基因和蛋白的同源性均为97％。结论：成功构建并鉴定了携带量H.pylori-hspB基因的重组活减毒鼠伤寒沙门疫苗菌，为研制H.pylori口服疫苗奠定了基础。     

重组原核表达质粒PTrc99A-ureB/hlyE 的构建和表达

目的 构建表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）尿素酶B亚单位（ureB）基因与大肠杆菌K-12株hlyE基因融合表达的原核表达质粒pTcr99A-hlyE.并表达。方法 用PCR扩增hlyE基因，经本科切连接反应将其克隆入重组原核表达质粒并测序，与GenBank中的核酸和蛋白序列进行BLAST分析，重组的阳性克隆经IPTG诱导培养，SDS-PAGE电泳进行表达分析，薄层扫描分析融合蛋白的含量。结果 对重组质粒进行酶切和PCR检测，证明构建了携带hlyE及ureB基因的重组原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE,核酸序列测定及同源性分析证实所构建的原核表达质粒pTrc99A-ureB/hlyE中所含的Hp-ureB及hlyE与GeneBank中的Hp-ureB和hlyE序列的同源性分别为97.42%（1663/1707）、99%（910/918）。重组细菌JM109可表达约100kD的融合蛋白含量的15.5%。结论 构建并鉴定了原核表达质粒pTrc99A-hlyE并高效表达，为研究Hp口服疫苗奠定了基础。     

表达幽门螺杆菌NAP蛋白的减毒沙门疫苗菌株预防幽门螺杆菌感染

目的建立表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)中性粒细胞活化蛋白(Hp-NAP)的减毒沙门疫苗菌,并利用人类幽门螺杆菌感染的小鼠模型研究疫苗菌对Hp感染的免疫保护作用。方法利用分子克隆技术构建携带Hp-NAP基因的重组原核表达质粒pTrc99A-NAP,经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列,并与美国国立医学图书馆基因文库中相关序列的同源性进行比较。重组质粒pTrc99A-NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261,培养后筛选阳性菌落,抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp-NAP蛋白用SDS-PAGE和West-blotting进行鉴定,用薄层扫描分析蛋白含量。C57BL/6小鼠随机分成4组,分别灌胃给予生理盐水(A组)、减毒鼠伤寒沙门菌SL3261(B组)、携带pTrc99A的SL326组(C组)、携带pTrc99A-NAP的SL326组重(D组)。免疫后4周,予Hp攻击,攻击菌量107CFU/只,灌胃2次,每日1次。攻击4周后处死动物,取胃组织分别行改良Giemsa染色及定量细菌培养,观察Hp定植情况。结果核苷酸序列测定及同源性分析证实,克隆的Hp-NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98%(397/402),氨基酸序列的同源性为98%(131/133)。pTrc99A-NAP转化的减毒沙门菌,可表达Mr约15000的Hp-NAP蛋白,表达量约占菌体蛋白量的37·5%;表达的新生蛋白能与小鼠抗Hp血清特异性反应,具有良好的免疫原性。同空白对照组、SL3261组和SL3261(pTrc99A)组相比,表达Hp-NAP的疫苗株组实验动物的胃组织Hp定植密度明显下降(P<0·05)。结论成功构建表达Hp-NAP的减毒沙门疫苗菌;重组疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免疫预防作用,可作为未来多组分重组减毒沙门疫苗菌的侯选菌株之一。     

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒鼠伤寒杆菌口服疫苗的制备

目的制备抗幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)减毒鼠伤寒杆菌活菌疫苗,观察其免疫效果.方法构建表达UreB的原核表达载体PTc01-UreB并转化减毒鼠伤寒杆菌SL3261,得到重组菌SL3261/PTc01-UreB.应用抗Hp菌体蛋白兔血清行Western-blot检测UreB在SL3261中的表达.将SL3261/PTc01-UreB口服免疫Balb/c小鼠,12周后应用ELISA检测肠液和血清中的特异性抗体反应.SL3261/PTc01-UreB在Luria-Bertani培养液中连续传代60代以确定其稳定性.结果成功构建PTc01-UreB原核表达载体.Western-blot显示,其转化减毒鼠伤寒杆菌SL3261后能表达相对分子质量约61×103的蛋白,与HpUreB亚单位相符,具有抗原性.口服免疫小鼠后,在肠液和血清中可分别检测到针对UreB的特异性IgA和IgG抗体.体外连续培养60代未见PTc01-UreB质粒丢失及对宿主细胞毒性.结论表达HpUreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/PTc01-UreB可用作抗Hp感染口服疫苗.     

优化构建UreB/HpaA双价幽门螺杆菌减毒活菌疫苗的免疫保护作用

目的 以减毒鼠伤寒沙门菌为载体，通过在UreB和HpaA间引入由3个甘氨酸残基组成的三肽柔韧接头，构建成UreB／HpaA双价抗幽门螺杆菌(Hp)活疫苗，并对照相应单价疫苗和空白载体研究其对C57BL／6小鼠的免疫保护效果。方法 用序列重叠延伸聚合酶链反应扩增带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因UreB／HpaA，进一步以减毒鼠伤寒沙门菌SL3261为载体构建UreB／HpaA双价活疫苗，观察其在小鼠体内的稳定性。用双价活疫苗株免疫Ⅱ级C57BL／6小鼠1次，对照单价活疫苗和空白载体观察其在体内诱导的特异抗体反应和对小鼠的免疫保护作用。结果 测序结果显示，3个甘氨酸残基的编码序列GGTGGAGGC已成功地插入UreB／HpaA融合基因中。双价疫苗灌喂小鼠后，至少能在脾脏和回肠末段存留10d。双价疫苗在小鼠体内诱导血清特异性IgGl和IgG2a水平明显升高。UreB／HpaA双价疫苗的免疫保护率为77．3％(17／22)，而UreB疫苗和HpaA疫苗的免疫保护率分别为50．0％(12／24)和43．5％(10／23)。结论 引入柔韧接头，优化构建表达UreB和HpaA的双价抗Hp活疫苗。UreB／HpaA双价活疫苗对Ⅱ级C57BL／6小鼠有更好的免疫保护作用。     

Construction of an attenuated Salmonella typhimurium vaccine carrying the Helicobacter pylori hpaA gene

OBJECTIVE : Helicobacter pylori is documented to have infected more than half of the world’s population. It colonizes the human stomach and is associated with the development of chronic active gastritis, peptic ulcer disease, gastric adenocarcinoma and gastric mucosa‐associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma. Immunization against this bacterium represents a cost‐effective strategy to reduce global gastric cancer rates and would have a major impact on H. pylori‐related peptic ulcer disease. HpaA, a subunit protein of H. pylori adhesin, is known to be the pathogenic factor and attenuated Salmonella typhimurium is a live vaccine vector. The present study aimed at constructing and identifying a live attenuated S. typhimurium vaccine carrying the hpaA gene of H. pylori. METHODS : The hpaA gene was amplified from H. pylori genomic DNA by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the NcoI‐SalI site of the prokaryotic expression plasmid pTrc99A. After sequence analysis of the hpaA gene, the identified recombinant plasmid was then used to transform a live attenuated S. typhimurium, namely SL3261, and positive clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. RESULTS : Confirmed by PCR, restriction enzyme digestion and sequence analysis, a recombinant prokaryotic expression plasmid, namely pTrc99A‐hpaA, harboring approximately 560 bp hpaA was constructed and the recombinant plasmid was then successfully introduced into a live attenuated S. typhimurium SL3261. CONCLUSION : A recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine harboring the H. pylori hpaA gene was constructed and identified. This work will help develop an oral recombinant live vaccine against H. pylori infection.     

多组分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的　利用人类幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)感染的小鼠模型研究多组分重组减毒沙门疫苗菌对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用。方法　将二级C5 7BL/ 6小鼠随机分成 6组 ,通过灌胃方法分别给予生理盐水 (A组 )、PBS(B组 )、减毒鼠伤寒沙门菌SL32 6 1(C组 )、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A -ureB +pGSTag -katA(D组 )、重组减毒鼠伤寒沙门菌pTrc99A -ureB +pTrc99A -HPaA(F组 )及重组减毒鼠伤寒沙门菌 pTrc99A -ureB +pGSTag -katA +pTrc99A -HPaA(F组 )。免疫后 4周 ,予Hp进行攻击 (A组不攻击 )。攻击菌量 10 7CFU/只 ,灌胃 2次 ,每日 1。再 4周后处死动物 ,取胃组织分别行尿素酶试验、改良Giemsa染色及定量细菌培养 ,观察Hp定植情况。行HE染色观察胃粘膜组织炎症情况。取脾组织行淋巴细胞增殖试验。结果　A组小鼠Hp定植密度为 0 ,B组为 9 4 9× 10 6CFU/ g胃组织 ,C组为 1 4 2× 10 6CFU/ g胃组织 ,D组、E组和F组小鼠分别为 2 92× 10 5CFU/g、5 5 1× 10 5CFU/g和 2 16× 10 5CFU/g胃组织 ,C组、D组、E组和F组与A组和B组相比定植密度均明显降低 (P <0 0 5 )。免疫组与对照组胃粘膜均无明显炎症反应。免疫组脾淋巴细胞增殖试验阳性。结论　口服多组分重组减毒沙门疫苗菌对小鼠Hp感染具有一定免     

Construction and identification of a recombinant live attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain carrying Helicobacter pylori heat shock protein subunit B gene

OBJECTIVE: Because Helicobacter pylori is the principal cause of chronic active gastritis and peptic ulcer disease, the present study explored the possibility of constructing a recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine strain carrying H. pylori heat shock protein subunit B (HspB) gene. METHODS: A 1640‐bp HspB gene was cloned into a prokaryotic expression plasmid pTrc99A. After sequence analysis, the result was compared with the sequence of H. pylori‐HspB gene and protein provided by the Genebank using BLAST analysis. The identified recombinant plasmid was then introduced into a live attenuated S. typhimurium strain SL3261. RESULTS: Using polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzyme digestion, a recombinant pro­karyotic expression plasmid pTrc99A‐HspB harboring the HspB gene was constructed and successfully introduced into a live attenuated S. typhimurium strain SL3261. Most of the H. pylori‐HspB in the recombinant plasmid pTrc99A‐HspB was consistent with the H. pylori‐HspB sequence provided by the Genebank. The exchange of A/T or C/G in the cloned sequence hardly changed the encoded amino acids; the homology for both the genes and proteins of H. pylori SS1 strain was 97%; the homology with other common H. pylori strains J99 and 26695 was 96% for both. CONCLUSION: A recombinant live attenuated S. typhimurium vaccine strain harboring H. pylori‐HspB gene was successfully constructed and verified, which may help in the development of an oral vaccine against H. pylori infection.     

以白细胞介素-2为免疫佐剂的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及其免疫保护作用

背景：细胞因子具有免疫佐剂效应，但将其用作幽门螺杆菌（H．pylori）核酸疫苗佐剂的研究报道尚少。目的：构建同时含H．pylori尿素酶B亚单位（ureB）基因和小鼠白细胞介素-2（IL-2）基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗，体外鉴定其表达蛋白的免疫原性，体内检测其对H．priori感染的免疫保护作用。方法：以聚合酶链反应（PCR）扩增H．priori ureB基因和小鼠IL-2基因，分别插入pUCmT载体，测序，通过一系列酶切、连接反应分别克隆人真核表达载体pIRES，酶切、PCR鉴定；重组质粒pIRES-ureB和pIRES-ureB-IL-2分别转化减毒鼠伤寒沙门菌LB5000，抽提质粒，进一步转化终宿主菌SL7207，反复传代培养。以Lipofectamine^TM2000将重组质粒分别体外转染COS-7细胞，蛋白质印迹法检测表达蛋白的免疫原性。以疫苗菌经口接种小鼠，4周后予H．pylori攻击，攻击后4周鉴定H．pylori感染状况。结果：测序结果显示扩增出的ureB和IL-2基因序列与GenBank中的H．pylori ureB和小鼠IL-2序列一致，酶切、PCR鉴定证实ureB和IL-2基因已克隆人pIRES载体，并成功构建了稳定的含H．pylori ureB和小鼠IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。蛋白质印迹法显示，pIRES-ureB-IL-2转染的COS-7细胞表达特异性UreB和IL-2蛋白。体内实验显示，疫苗接种组小鼠的免疫保护率显著高于PBS对照组（P〈0．01），其中ureB-IL-2疫苗组又显著高于ureB疫苗组（87．5％对62．5％，P〈0．05）。结论：成功构建了编码H．pylori ureB和免疫佐剂IL-2基因的重组活减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗，体外实验证实其可表达具有免疫原性的抗原蛋白和佐剂蛋白，体内实验证实其对小鼠H．pylori感染具有免疫保护性，免疫佐剂IL-2可提高核酸疫苗的免疫保护率。