恶性症原虫血期抗原表达及人免疫血清用于克隆筛选的研究

近期研究表明,疟疾疫苗在该病的控制中将发挥重要作用。我们用重组DNA技术,建立了恶性疟原虫血期抗原基因组DNA库,并用病人免疫血清筛选出了具有免疫保护作用的表达抗原,此抗原有希望成为疟疾疫苗。 材料和方法 一、免疫血清 48份血清采自巴布亚新几内亚恶性疟流行区,用前经IFA和Western Blotting筛选出阳性者与大肠杆菌/λgt11溶源菌4℃作用1h,以除去抗     

恶性疟原虫血期抗原表达和人免疫血清筛选克隆的研究

用细菌噬菌体λgtll表达系统建立恶性疟原虫血期基因组DNA库,并在大肠杆菌Y1090R~-M~ 变性株中进行抗原表达,用恶性疟病人免疫血清筛选出表达恶性疟抗原的克隆20株,共中有2株与48份病人血清均起反应。这两株克隆在细菌中的表达产物比野生型λgtll的多出1条分子量大于β一半乳糖苷酶的多肽,而且此蛋白多肽可与兔抗β一半乳糖苷酶血清和病人免疫血清出现反应。     

融合蛋白斑点ELISA检测恶性疟抗体

利用基因工程技术将恶性疟原虫基因组DNA与噬菌体λgt11重组,并在宿主菌E.Coli Y1090中表达出融合蛋白,以此蛋白作为抗原,用斑点ELISA法检测恶性疟抗体。当血清1:100稀释时,46份病人血清全为阳性,20份正常人血清全为阴性,与IFA检查结果一致。研究表明此种融合蛋白可替代疟疾全虫抗原,可解决抗原来源和纯化问题。     

恶性疟原虫FCC1／HN株185 kDa和8241kDa保护性抗原的超微结构定位

用LR White树脂低温包埋感染人恶性疟原虫FCC1／HN株的红细胞，用保护性单克隆抗体F6－D3和F6－C2并结合蛋白A－胶体金探针免疫标记恶性疟原虫红内期185kDa和82／41kDa蛋白。结果表明单克隆抗体F6－D3识别的185kDa蛋白定位于游离的和细胞内的裂殖子表面以及未成熟裂殖体的细胞质、质膜及带虫泡膜。而单克隆抗体F6－C2识别的81／41kDa蛋白则定位于未成熟裂殖体及成熟殖子的棒状体中。从超微结构上表明185kDa和82／41kDa保护性抗原分别为恶性疟原虫FCC1／HN株的裂殖子表面抗原和裂殖子棒状体抗原。     

恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48/45基因编码序列的体外扩增

目的：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs和Pfs48／45的基因序列,为进一步对其进行克隆和体外高效表达创造条件。方法：特定寡核苷酸引物的设计、合成与纯化;恶性疟原虫FCC1／HN株体外培养;利用碱裂解法从培养的恶性疟原虫FCC1／HN株提取染色体DNA;PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析。结果：从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA中特异扩增出编码Pfs25和Pfs48／45基因序列,其片段大小分别为657bp和1,359bp。而用间日疟原虫基因组DNA为模板作对照,无扩增条带出现。结论：体外扩增编码恶性疟原虫传播阻断抗原Pfs25和Pfs48／45基因序列与预期长度相符合,从而,为该基因的克隆、测序和表达奠定基础。     

恶性疟:丛生状天门冬酰胺富含蛋白与福氏佐剂或免疫刺激复合物在实验兔中所引起的免疫作用

恶性疟原虫丛生状天门冬酰胺富含蛋白(CARP)为一约含30%天门冬酰胺的裂殖子相关抗原。恶性疟原虫基因组中所克隆的1.4kbCARP基因5’端DNA序列的分析提示该基因片段可能编码完整的CARP,且该基因产物是分子量为50kDa的蛋白质。为分     

用单克隆抗体鉴定恶性疟原虫裂殖子表面抗原

用海南省恶性疟原虫Fcc7801/HN作为抗原,制备的抗恶性疟原虫单克隆抗体C6株具有明显的抑制体外恶性疟原虫生长的作用,并且与恶性疟原虫Fcc-1/HN,Fcc7802/HN,Fcc8703/JS和伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫有较广泛的交叉免疫荧光反应。用免疫电镜观察,此株单克隆抗体能识别恶性疟原虫裂殖子表面抗原,用免疫印迹法测得该抗原分子量为71kDa,此抗原有可能成为疟疾疫苗的候选抗原。     

一步法提纯恶性疟原虫具有β-半乳糖苷酶活性的杂交蛋白

噬菌体λgt11是一个常用于分子克隆的良好载体,外源DNA插到β-半乳糖酶基因上,并在大肠杆菌中以杂交蛋白的形式而表达。然而由于此蛋白仍保持该酶的活性,不能直接应用。必须进一步提纯。本文报道用DEAE—Sephacel离子交换层析一步法提纯恶性疟原虫血期抗原基因表达的杂交蛋白的结果。     

用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的　阐明 Fcc1/ HN株与云南株间的不同生物学特性。　方法　用 M2 6 - 32 作探针 ,筛选恶性疟原虫 c DNA基因表达文库 ,根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物 ,分别进行 PCR扩增 ;地高辛酶促生物标记 Fcc1- HN株 DNA的 PCR扩增产物 ,分别与 Fcc1/ HN株 DNA、云南株 DNA和阳性克隆 5 11的扩增产物杂交。　结果　 PCR扩增后 Fcc1/ HN株 DNA在约 5 0 0 bp和 4 5 0 bp处有 2条特异性条带 ;云南株 DNA在约 5 0 0 bp处有 1条较淡的条带和 130 0bp处一较亮的特异性条带 ;阳性克隆 5 11仅在约 5 0 0 bp处有 1条特异性条带。标记探针能与克隆 DNA、恶性疟原虫Fcc1/ HN株和云南株的 PCR扩增产物杂交。　结论　恶性疟原虫 Fcc1/ HN株与云南株在基因组 DNA结构上可能存在差异。     

恶性疟原虫（海南株）cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的 :构建恶性疟原虫 c DNA表达文库。方法 :采用“一步法”提取红内期恶性疟原虫12 2 4 μg RNA,经 Oligo( d T)纤维素柱纯化得到 35.84 μg poly ( A) m RNA。取 10 μg m RNA反转录得到 1.75μg平端双链 c DNA,与含 Eco RI,Not I,Sal I酶切位点的衔接头连接后 ,经分级分离柱纯化回收到 2 0 0 ng大小主要在 50 0 bp- 7kb左右的 c DNA片段。取 50 ng c DNA与λgt11噬菌体臂连接后体外包装 ,完成建库。并采用 PCR方法初步鉴定该文库。结果 :已构建一个含 10 6个重组子的 c DNA表达文库。结论 :文库容量及插入 c DNA片段的大小适合于进一步研究。     

恶性疟原虫海南株AMA-1、Pfs230基因的序列分析

目的　测定恶性疟原虫海南 (FCC1/HN)株裂殖子顶端膜抗原 1(AMA - 1)基因和Pfs2 30基因序列 ,并分别进行序列分析。方法　根据AMA - 1基因已知序列合成一对引物 ,用PCR技术从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增AMA - 1基因 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3 -AMA - 1。根据Pfs2 30基因已知序列合成七对引物 ,分 7段从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pfs2 30基因 ,并分别将扩增片段插入pMD - 18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定克隆的AMA -1、Pfs2 30基因序列 ,应用DNAstar软件辅助进行序列分析和同源性比较。结果　PCR扩增得到恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1和Pfs2 30基因片段。恶性疟原虫FCC1/HN株AMA - 1基因全长 186 9bp ,无内含子 ,编码 6 2 2个氨基酸残基 ,不存在氨基酸重复序列 ,相对分子量约 72 0 4 5kDa ;Pfs2 30基因全长 94 35bp ,无内含子 ,编码 314 4个氨基酸残基 ,分子量为36 4 36kDa。恶性疟原虫FCC1/HN株与FC2 7、7G8、CAMP、FCR3、Thai -Tn、3D7、FVO、KF1916、CMP1、HB3、K1和V1株AMA - 1的同源性在 94 9%以上 ,各株间有 5 3个位置相同的氨基酸残基替代位点 ,并且发生替代的氨基酸残基具二态性。FCC1/HN株分别比 3D7、7G8株Pfs2 30抗原多 9、10个氨基酸残基 ,三个分离株有 2 8个氨基酸替换     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

用重复DNA克隆作为种特异性探针检测恶性疟原虫DNA

用恶性疟原虫重复顺序克隆进行杂交的方法可提高检测系统的重现性和敏感性。分离疟原虫DNA并用CsCl放线菌素D离心去除人DNA杂质。Tanzania株Ⅰ用Sau 3AI部分酶切并克隆到有Bam HI切点的噬菌体M13mp 18中,用标记的全部恶性疟原虫基因组DNA探针进行噬菌斑杂交选出带有重复顺序的克隆株。用标记的恶性疟基因组DNA探针与人     

免疫筛选恶性疟原虫cDNA克隆

目的 :获取恶性疟原虫 (海南株 )抗原的 c DNA克隆并进行初步鉴定。方法 :采用 dot-EL ISA,以兔免疫血清对恶性疟原虫 c DNA表达文库约 80万个重组噬斑进行筛选 ,并用 2 0株单克隆抗体和恶性疟患者血清对强阳性克隆进行再筛选。 PCR初步鉴定 17个强阳性克隆。结果 :兔免疫血清确定了 17个强阳性克隆, 患者血清检测到 11个阳性克隆 (含 8个强阳性 ) ,11株单抗与 9个 c DNA克隆呈阳性反应。 17个强阳性克隆均能扩增出大小在 30 0 bp- 2 .5kb左右的条带。结论 :已筛选到能与抗恶性疟原虫兔血清、单克隆抗体及患者血清产生特异性免疫反应的 c DNA克隆。     

用聚合酶链反应技术鉴别恶性疟原虫不同地理株的初步研究

目的 阐明Fccl/HN株与云南株间的不同生物学特性。方法 用M26-32作探针，筛选恶性疟原虫cDNA基因表达文库，根据所获得的靶抗原决定簇表位的基因序列设计引物，分别进行PCR扩增；地高辛酶促生物标记Fccl-HN株DNA的PCR扩增产物，分别与Fccl/HN株DNA，云南株DNA和阳性克隆511的扩增产物杂交。结果 PCR扩增后Fccl/HN株DNA在约500bp和450bp处有2条特异性条带；云南株DNA在约500bp处有1条较淡的条带和1300bp处一较亮的特异性条带，阳性克隆511仅在约500bp处有1条特异性条带，标记探针能与克隆DNA，恶性疟原虫Fccl/HN株和云南株的PCR扩增产物杂交。结论 恶性疟原虫Fccl/HN株与云南株在基因组DNA结构上可能存在差异。     

质粒PF.rep20探针检测我国恶性疟原虫的初步研究

用~(33)P中标记的质粒PF rep20探针以DNA-DNA斑点杂交检测5种疟原虫,仅恶性疟原虫P.f.呈现阳性反应,间日疟原虫、约氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及诺氏疟原虫不发生杂交;~(32)P标记的P.f.海南株基因组DNA探针与上述诸疟原虫均可发生杂交。基因诊断海南省和云南省恶性疟患者血样本39份的杂交阳性率,质粒探针和基因探针分别为94.9％和97.4％。检测人工培养的海南株、云南株和安徽株P.f.敏感度,质粒探针均为0.001％原虫血症和10Pg原虫DNA,基因组探针对海南株原虫为0.0001％和1Pg。提示质粒PF rep20探针种的特异性强,敏感性较高,似可用于我国恶性疟原虫检测。     

DNA探针检测间日疟原虫的初步研究

由于间日疟原虫目前尚不能体外培养,抗原制备困难,使间日疟的流行病学调查及诊断受到限制。本文报道以间日疟原虫红内期基因组DNA库0.24kb DNA片段为探针,用~(32)P标记后进行点杂交试验检测间日疟原虫的初步结果。 材料与方法 含间日疟原虫红内期基因组DNA库亚克隆VPL101/5 0.24kb DNA片段的重组质粒pUC19由澳大利亚昆士兰医学研究所Kidson赠送。按文献方法进行感受态细胞JM 109的制备、重组质     

恶性疟原虫FCC—1/HN株EBA—175和HRP─Ⅱ基因片段的体外扩增与克隆

目的构建恶性疟原虫FCC—1／HN株红细胞结合抗原（EBA—175）和富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP─Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法通过聚合酶链反应（PCR）对恶性疟原虫FCC—1／HN株的EBA─175和HRP─Ⅱ基因进行体外扩增,用HindⅢ／BamHI和BamHI／EcoRI分别消化扩增产物,定向克隆pcDNA3载体,转化至感受态大肠杆菌TG1,经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定。结果从恶性疟原虫FCC—1／HN株基因组DNA中扩增出EBA—175和HRP─Ⅱ两基因片段并定向插入PCDNA3载体构建重组质粒。结论所获重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ的基因片断。     

恶性疟原虫红内期145／102kDa抗原的超微结构定位

用LR White低温包埋法及胶体金标记免疫电镜细胞化学技术对保护性单克隆抗体M26-32识别的体外培养的恶性疟原虫FCC1/HN株红内期145/102 kDa抗原进行超微结构定位研究。发现金颗粒主要定位在该株原虫红内期环状体、滋养体、裂殖体及裂殖子的细胞质中;一些金颗粒则定位于原虫表面的复合膜或散布在感染红细胞的细胞质中。表明145/102kDa抗原是恶性疟原虫FCC1/HN株红内期各无性发育阶段的共同细胞质抗原,其一部分可途经原虫表面的复合膜而被转运到感染红细胞的细胞质。     

恶性疟原虫海南株端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析

目的　克隆恶性疟原虫端粒酶基因 ,为今后筛选抗疟药物提供理论依据。方法　根据四膜虫的端粒酶基因序列 ,设计并合成一对引物 ,从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出端粒酶基因 ,进行测序及利用生物信息学技术对端粒酶基因进行了分析。结果　得到了 2 3kp的恶性疟原虫海南株端粒酶基因。结论　恶性疟原虫端粒酶基因的克隆 ,为今后以端粒酶为靶标筛选抗疟药奠定了基础