补骨脂二氢黄酮甲醚诱导HepaRG细胞损伤机制探讨

目的利用HepaRG细胞,探讨补骨脂二氢黄酮甲醚毒性剂量及其毒性作用机制。方法 MTT法确定毒性及剂量。以浓度为6.25、12.5、25μmol·L~(-1)的补骨脂二氢黄酮甲醚作用于细胞24 h后,首先利用Hoechst 33342/PI及LDH的方法检测细胞死亡,并检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3活性。通过检测线粒体膜电位、ATP含量、线粒体膜通道开放孔开放性及细胞色素C的含量,观察其对线粒体损伤的影响。结果补骨脂二氢黄酮甲醚给药24 h后,凋亡蛋白Bax/Bcl-2比例、caspase-3活性随药物浓度增大而增加,在6.25~25μmol·L~(-1)时,其凋亡率呈现明显的剂量依赖性,但在25μmol·L~(-1)时细胞以坏死为主。作用24 h后线粒体损伤相关指标明显加剧。结论补骨脂二氢黄酮甲醚作用于HepaRG细胞后通过损伤线粒体诱导细胞凋亡和坏死。     

一氧化氮供体PABA/NO经线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡

目的研究新型一氧化氮(NO)供体,O~2-{2,4-二硝基-5-[4-(N-甲基氨基)苯甲酰氧基]苯基}-1-(N,N-二甲基氨基)偶氮-1-鎓-1,2-二醇(PABA/NO)对人肝癌细胞凋亡的影响。方法 PABA/NO 7.5,15.0和30.0μmol·L~(-1)处理细胞24 h后,CCK-8法检测细胞存活率,倒置显微镜下检测细胞形态,DAF-FM DA荧光染色法检测细胞内NO水平,膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,罗丹明123(Rh123)染色法检测细胞线粒体膜电位,Western蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bax、活化胱天蛋白酶3、细胞色素c(Cyt c)和凋亡诱导因子(AIF)蛋白表达。结果与细胞对照组比较,PABA/NO可显著抑制HepG2细胞存活,24 h时IC50值为(10.8±0.6)μmol·L~(-1);形态上出现胞膜皱缩、细胞扁圆等变化;细胞内NO水平提高,荧光强度分别为121±9(P<0.05),174±31(P<0.05)和230±43(P<0.01);凋亡率由原来的(2.9±0.5)%增加至(17.0±4.5)%,(39.8±5.4)%和(74.3±45.2)%(P<0.01);细胞内Rh123的荧光强度由原来的668±69下降到605±73,420±65(P<0.05)和242±47(P<0.01);PABA/NO引起Bcl-2表达下调(P<0.01)、Bax及活化胱天蛋白酶3表达上调,胞浆中Cyt c的表达由原来的0.15±0.04升高到0.27±0.06(P<0.05),0.38±0.07(P<0.01)和0.82±0.16(P<0.01)。胞核中AIF的表达由原来0.183±0.032升高至0.231±0.011,0.682±0.020(P<0.01)和0.966±0.090(P<0.01)。加入NO清除剂羧基(carboxy)-PTIO后,可逆转PABA/NO引起的Bcl-2表达下调,对Bax、活化胱天蛋白酶3、胞浆中Cyt c和胞核中AIF蛋白表达的上调也有一定的逆转作用(P<0.01)。结论 PABA/NO可能经线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡。     

雷公藤甲素诱导人肝细胞凋亡的机制

目的 探讨雷公藤甲素诱导人肝细胞L-02凋亡的机制.方法 将L-02细胞分为对照组和雷公藤甲素50 nM实验组,处理48 h后,采用MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率、活性氧(ROS)的荧光强度,试剂盒检测细胞色素C的浓度以及半胱天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)和Caspase-3的活性,Western blot检测细胞中B细胞淋巴瘤-白血病2(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)的表达.结果 与对照组相比,实验组细胞存活率下降,细胞凋亡率上升,Bcl-2表达下调,Bax表达、细胞色素C浓度、ROS荧光强度、Caspase-9和Caspase-3活性均明显上调(P＜0.05或P＜0.01).结论 雷公藤甲素可以抑制L-02细胞的存活,通过激活线粒体凋亡途径促进L-02细胞凋亡,下调Bcl-2与Bax比率,促进细胞色素C释放,诱导ROS生成,进一步破坏线粒体膜,增加细胞色素C的释放,激活Caspase-9和Caspase-3介导的细胞凋亡通路,最终诱导细胞凋亡.     

细胞凋亡的线粒体途径机制研究

细胞凋亡是细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定而主动采取的、由基因决定的、自动结束细胞生命的过程。线粒体在细胞凋亡中发挥着重要的作用。线粒体通透性转变孔（MPTP）开放导致线粒体内释放出包括细胞色素C（cyt-c、Smac／DIABLO和AIF等线粒体凋亡因子在内的各种蛋白,从而启动细胞凋亡程序引起细胞凋亡。Cyt—c释放到细胞浆后,Cyt—c、dATP、Aapf-1和procaspase-9组成聚合体,称为凋亡体。凋亡体可激活其下游的procaspase-3,从而导致细胞死亡。在凋亡诱导因素的刺激下,AIF可从线粒体转位进入胞核,直接引起染色质浓缩及DNA的断裂。AIF的转位足以介导体外细胞凋亡的发生。     

科罗索酸上调Bax表达诱导宫颈癌细胞凋亡

目的探讨科罗索酸对宫颈癌细胞Hela的凋亡诱导作用。方法不同浓度(10～50μmol·L~(-1))科罗索酸处理宫颈癌Hela细胞,MTT法检测细胞活性,SPSS12.0统计软件包计算半数抑制浓度(IC_(50)),流式细胞术检测细胞凋亡,荧光检测法检测凋亡酶caspase-3活性,western blot检测细胞蛋白Bax、Bcl-2表达。结果科罗索酸抑制宫颈癌Hela细胞活性随药物浓度及时间的增加而增高,24、48及72 h的IC_(50)分别为45、34、28μmol·L~(-1)。科罗索酸诱导Hela细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01),凋亡酶活性也明显高于对照组(P<0.01),科罗索酸可上调Bax而不影响Bcl-2的表达。结论科罗索酸可抑制宫颈癌Hela细胞活性,诱导细胞凋亡,其机制可能与上调Bax蛋白表达有关。     

线粒体凋亡通路在棕榈酸诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨线粒体凋亡通路在棕榈酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡中的作用。方法不同浓度棕榈酸(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L~(-1))作用HUVECs(0、12、24、48 h),MTT法检测HUVECs增殖能力;免疫荧光法检测HUVECs细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达水平;免疫印迹法检测HUVECs中AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax等线粒体凋亡通路蛋白的表达水平;TUNEL法检测细胞内凋亡水平。结果 0.4 mmol·L~(-1)棕榈酸作用HUVECs 24 h时,细胞增殖率明显降低;AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2的水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡水平明显增高(P<0.05);线粒体通透性抑制剂环孢素A (ciclosporine A, CsA)预处理组HUVECs凋亡水平明显下调(P<0.05)。结论棕榈酸所致血管内皮细胞损伤的发病机制可能与线粒体凋亡相关通路密切关联,此研究对脂毒性心肌损伤的防治有重要意义。     

6'-羟基爵床素A诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其机制

目的探讨6'-羟基爵床素A(JR6)对人肝癌Hep G2细胞凋亡的诱导作用及其机制。方法体外培养人肝癌Hep G2细胞,采用MTT法观察不同浓度的JR6和5-氟尿嘧啶(5-FU)对Hep G2细胞存活的作用,荧光显微镜观察Hoechst33258染色后细胞核形态改变,用流式细胞仪检测AnnexinⅤ-FITC/PI双染后Hep G2细胞的凋亡率,JC-1荧光染色观察药物对细胞线粒体膜电位的影响,Western蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白细胞色素c、Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果 JR6 6.1~196μmol·L-1和5-FU 3.4~192μmol·L-1分别作用Hep G2细胞48 h,对Hep G2细胞存活具有抑制作用,IC50分别为74.90和49.75μmol·L-1。JR6 12.3,49和196μmol·L-1作用Hep G2细胞48 h,细胞凋亡率明显增加,由正常对照组的(6.9±2.0)%增加至(13.8±2.0)%,(18.6±4.3)%和(32.4±3.2)%(P<0.05,P<0.01)。Hoechst33258染色结果显示,JR6 49和196μmol·L-1作用Hep G2细胞48 h,部分细胞出现细胞核固缩和染色质凝集等凋亡变化。线粒体膜电位检测结果发现,JR6 49和196μmol·L-1作用48 h能使Hep G2细胞线粒体膜电位水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。线粒体凋亡相关蛋白的检测结果表明,JR6 12.3,49和196μmol·L-1作用Hep G2细胞48 h,胞浆细胞色素c表达增加,促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,且Bax/Bcl-2比值增加(P<0.05,P<0.01)。JR6 49μmol·L-1和5-FU组上述蛋白表达无明显差异。结论 JR6可能通过促进细胞色素c释放、打破Bcl-2/Bax平衡诱导Hep G2细胞凋亡。     

力达霉素经线粒体依赖通路介导细胞凋亡

力达霉素(lidamycin，LDM)是具有我国自主知识产权的烯二炔类抗生素，具有较强的抗肿瘤活性，其抗肿瘤机制有待深入阐明。本研究主要利用人肝癌BEL-7402和乳腺癌MCF-7细胞研究了力达霉素对线粒体凋亡通路相关因子的影响。通过MTT法检测不同剂量力达霉素对肿瘤细胞增殖毒性；蛋白印迹技术检测线粒体和细胞质细胞色素c、总Bax，Bcl-2及p53表达；RT-PCR检测p53和bax mRNA表达等。结果发现，LDM能迅速激活肿瘤细胞线粒体凋亡通路，在2 h内就引起线粒体中细胞色素c释放至细胞质中。同时Bcl-2家族成员中促凋亡成员Bax持续增加，而抗凋亡成员Bcl-2先增加后减少。p53蛋白在6 h显著增加。Bax蛋白表达升高与其mRNA转录水平升高有关，p53蛋白表达升高与转录后水平有关。 Caspase抑制剂可以部分抑制LDM的增殖毒性。因此LDM可以通过激活细胞色素c启动的线粒体凋亡通路发挥抗肿瘤作用。     

熊果酸诱导人急性髓系白血病细胞株U937细胞凋亡的实验研究

目的探讨熊果酸对人急性髓系白血病细胞株U937细胞的作用及机制。方法用不同浓度的熊果酸处理对数生长期的U937细胞48 h后,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测其对细胞增殖的影响;Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫印迹法(Western blot)检测Wnt、β-catenin、p53、Bcl-2、Bax表达,以及细胞浆凋亡诱导因子(AIF)和细胞色素蛋白C(CytC)蛋白表达。结果熊果酸呈浓度依赖性诱导U937细胞增殖抑制和凋亡,上调Bax和细胞浆AIF、CytC表达,下调Wnt、β-catenin、p53及Bcl-2表达。结论熊果酸对U937白血病细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能为抑制Wnt/β-catenin/p53信号途径促发白血病细胞死亡。     

二氢青蒿素诱导HL-60细胞凋亡

目的探讨二氢青蒿素对人早幼粒白血病细胞(HL-60)的治疗作用。方法采用台盼蓝染色法和MTT法测定二氢青蒿素对HL-60细胞存活的影响,吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光双染色、DNA凝胶电泳、流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹分析凋亡相关蛋白的表达。结果二氢青蒿素可抑制HL-60细胞存活,诱导HL-60细胞凋亡,同时降低HL-60细胞Bcl-2蛋白的表达,增加Bax蛋白和凋亡执行蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3的表达,并呈浓度依赖性。结论二氢青蒿素可诱导HL-60细胞凋亡,其机制可能是通过对线粒体凋亡通路中Bcl-2,Bax和caspase-3蛋白表达的调控而发挥作用。