冷冻保存同种异体软骨移植修复膝关节软骨缺损

背景：采用传统方法冻存后,关节软骨细胞存活率低,且软骨表层与深层的软骨细胞存活率差别较大,移植物易发生退行性变,导致手术失败。 目的：经打孔梯度降温冻存膝关节软骨后并行异体移植,观察打孔梯度降温冻存对兔关节软骨的影响。 方法：自2月龄新西兰白兔膝关节股骨膑面取骨软骨移植物,随机分为3组：实验组在软骨面以3 mm×3 mm矩阵打孔,梯度降温冷冻保存。以非打孔经梯度降温冷冻保存组、非打孔超低温冷冻保存组为对照。复温后移植到成年新西兰白兔相应膝关节缺损部位,观察各组移植物大体形态学、组织化学、免疫组织化学染色效果的差别。 结果与结论：实验组、非打孔经梯度降温冷冻保存组大体形态学、组织化学、免疫组织化学染色效果均明显优于非打孔超低温冷冻保存组。实验组与非打孔经梯度降温冷冻保存组效果差别不明显,但实验组明显加强了对中间层软骨组织的保护程度。提示关节软骨的梯度降温冷冻保存效果优于快速降温冷冻保存;关节软骨打孔冷冻保存对深层细胞有一定的保护作用,提高了软骨细胞存活率,延缓了移植软骨组织的退变过程。     

软骨细胞复合胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养*★

背景：关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复，需要将骨与软骨组织工程结合起来，构建骨软骨双层支架，或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨。 目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。 时间及地点：体外细胞学实验，于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室进行。 材料：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，上层以胶原/壳聚糖为主，下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm。 方法：体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3 周，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周。 主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。 结果：修复体/细胞体外培养3周，修复体上细胞数量明显增多，并分泌细胞基质，包裹在软骨细胞周围，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。 结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好，有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。     

脂肪干细胞与软骨细胞共培养的实验研究

背景：有研究发现关节软骨微环境可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 目的：验证软骨细胞能否诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化,以便成为组织工程构建关节软骨可能的新方法。 设计、时间及地点：随机对照细胞实验,于2007-09/2008-07在南京大学生物医药生物技术国家重点实验室完成。 材料：清洁级成年新西兰大白兔,雌雄不限,体质量1.5~2.0 kg。 方法：分离培养原代新西兰大白兔脂肪干细胞和软骨细胞,分别种植于6孔板和插入式细胞培养皿共培养2周后,胰酶消化终止。脂肪干细胞分别行油红O染色、碱性磷酸酶检测和甲苯胺蓝染色法鉴定。 主要观察指标：倒置显微镜观察共培养前后脂肪干细胞的形态变化。甲苯胺蓝染色法检测共培养后脂肪干细胞的蛋白多糖的表达水平。免疫细胞化学检测共培养后脂肪干细胞的Ⅱ型胶原的表达水平。反转录-聚合酶链反应检测蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录水平。 结果：脂肪干细胞分别经油红O染色、碱性磷酸酶染色和甲苯胺蓝染色法鉴定证实,分离的细胞具有多向分化能力,是脂肪来源的间充质干细胞。共培养1周后部分脂肪干细胞变圆,2周时其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高。 结论：与软骨细胞共培养后,脂肪干细胞可以被诱导成软骨样细胞。     

离心管内培养第1代骺板软骨细胞作为软骨移植材料的可行性

目的：作者前期研究已证明，第1代骺软骨细胞可在离心管内形成富含软骨特异性蛋白基质的软骨组织。本实验进一步观察第1代骺板软骨细胞在离心管内培养形成的软骨组织特征，并与半月板、骺板及关节软骨组织进行比较。 方法：实验于2006-07/2007-04在四川大学华西医院科研楼组织工程实验室完成。取4周龄新西兰大白兔四肢骺板分离软骨细胞，行单层传代培养，取第1代细胞行无支架离心管培养，观察其形成的软骨组织特征,另取6周龄新西兰大白兔股骨髁关节软骨、胫骨近端骺板及半月板，与离心管培养软骨一并行透射电镜观察，比较其软骨细胞及细胞外基质结构。 结果：第1代骺板软骨细胞经无支架离心管培养能形成软骨。离心管内培养形成的软骨具有独特的超微结构，与骺板及关节软骨有一定的相似性，而与半月板有明显区别。4种细胞都有各自不同的细胞及细胞外基质特征。 结论：第1代骺板软骨细胞在离心管内培养形成的软骨组织具有与骺板及关节软骨相似的微观结构。     

藻酸钙凝珠复合自体软骨细胞修复成年兔关节软骨缺损*☆

摘要 背景：软骨缺损的修复一直是骨科界的难题之一，近几年发展起来的应用组织工程学技术修复软骨缺损的方法，逐渐被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的手段。 目的：应用藻酸钙凝珠-自体软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损，观察损伤近期修复情况。 方法：成年新西兰大白兔30只，左膝取软骨细胞，右膝造模。采用体外培养后的第3代自体软骨细胞复合海藻酸钠凝胶，混入CaCl2溶液中制成串珠状凝珠，体外培养4周。实验组植入海藻酸钙凝珠-自体软骨细胞复合物，对照组植入不含细胞的海藻酸钙凝珠，空白组不做任何处理。 结果与结论：纳入新西兰大白兔30只，除其中1 只术后单侧膝关节僵硬强直外，其余均未见手术后关节活动障碍，所有动物术后无感染，无死亡。苏木精-伊红染色可见，实验组修复组织以透明软骨为主，对照组以纤维软骨修复为主，空白组修复不明显，以纤维软组织修复为主。免疫组织化学染色可见实验组修复组织以表达Ⅱ型胶原为主，对照组Ⅱ型胶原免疫组化着色较淡，Ⅱ型胶原表达量少。空白组修复组织不表达Ⅱ型胶原。结果提示藻酸钙凝珠-自体软骨细胞修复软骨缺损有较好效果，表明自体软骨细胞复合藻酸钙凝珠能为软骨组织工程提供一种很好的思路。 关键词：藻酸钙凝珠；软骨细胞；软骨组织工程；修复；生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.003     

转化生长因子β1基因修饰兔B型滑膜细胞复合Pluronic-F127体内构建组织工程软骨

背景：兔B型滑膜细胞在转化生长因子的作用下,具有向软骨细胞分化的潜力,形成的细胞在体外可保持软骨细胞的表型,但转染后的细胞能否与支架材料一起形成软骨组织尚没有深入的研究。 目的：以脂质体法转染兔B型滑膜细胞,将转染后细胞复合Pluronic-F127在裸鼠体内构建组织工程软骨,观察转染后细胞体内向软骨组织方向分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学试验,随机分组动物实验,于2007-04/2008-05在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。 材料：3月龄健康新西兰大白兔,雌雄不限,4周龄体质量为20 g左右的BALB/c裸鼠共12只,雌雄不限。 方法：取新西兰大白兔膝关节腔内面的滑膜组织,以酶消化法进行分离培养、纯化、传代,以脂质体法进行转染,以G418筛选阳克隆,同时检测转化生长因子β1、Ⅱ型胶原的表达;4 ℃将Pluronic-F127溶解,配成质量分数为30%液体,然后与转染后稳定表达的细胞进行混合,同时取软骨细胞混合Pluronic-F127、空载体转染细胞混合Pluronic-F127作为对照组,各组细胞浓度均为5×1010 L-1的复合物,迅速以0.2 mL注射器行裸鼠背部皮下注射,分别在术后4,6,8周处死实验裸鼠,取出裸鼠背部组织进行观察。 主要观察指标：细胞生长曲线、转染后细胞表型变化观察、裸鼠皮下组织块组织学观察。 结果：生长曲线显示B型滑膜细胞在脂质体法转染后生长活性降低,至转染后6,7 d,细胞基本恢复正常的增殖能力,转染后第4天,滑膜细胞转化生长因子β1表达阳性,转染后第7天,滑膜细胞胞浆内抗Ⅱ型胶原染色为阳性,PluronicF-127与B型滑膜细胞混合后在裸鼠皮下4周形成不成熟的软骨样组织,8周形成成熟的软骨样组织,抗Ⅱ型胶原染色为阳性。 结论：转染转化生长因子β1基因的B型滑膜细胞在体外可以表达软骨细胞的表型,形成软骨样细胞,而在裸鼠体内复合Pluronic F-127可保持软骨细胞表型,形成软骨样组织。     

第1代骺板软骨细胞离心管内培养生成软骨组织的观察★

目的：骺板软骨细胞聚集体离心管内培养能生成具有良好组织结构和较高含量的软骨基质特异性成分，然而应用这一技术一般均以原代软骨细胞为种子细胞。观察第1代骺板软骨细胞高数量聚集离心管培养生成软骨组织的可行性及其生物学特点,并对此技术进行初步评价。 方法：实验于2006-07/2007-04在四川大学华西医院科研楼组织工程实验室完成。自4周龄新西兰大白兔骺板按三步酶消化法分离软骨细胞，行单层传代培养，取第1代细胞，以5×105个细胞/管接种于15 mL离心管内，离心沉降聚集，连续培养2周。大体、倒置相差显微镜观察软骨细胞形态；光学显微镜观察软骨的组织学结构；透射电镜观察了解细胞及细胞外基质的超微结构。 结果：①第1代骺板软骨细胞经离心管培养能形成软骨，随时间的延长，生成的软骨组织体积逐渐增大，到第2周时直径为1.5~2.0 mm，高为0.8~1.4 mm。②外周组织结构类似于骺软骨的生发层或软骨膜，由多层细胞构成，随时间的延长而减少。其中心为肥大软骨细胞，且随培养时间的延长而增多。2周时，软骨组织甲苯胺蓝染色呈强的红色异染反应，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性，番红“O”染色呈强阳性。③细胞核内以常染色质为主，且分布均匀，细胞周围及细胞间质结构稀疏、排列紊乱，缺乏紧密的胶原网络结构。 结论：高数量第1代骺板软骨细胞聚集离心管培养能形成软骨组织，有独特的超微结构，富含软骨特异性蛋白基质。     

雌激素对生长板软骨细胞增殖的调节*☆

背景：雌激素是生长板闭合过程必不可少的因素,但目前尚无实验从不同层次揭示雌激素对生长板软骨细胞增殖率、细胞周期分析、细胞凋亡的超微结构改变的影响。 目的：探讨雌激素对生长板软骨细胞增殖能力的调节特点及其在生长板增殖能力老化过程中的作用。 方法：选取12周龄新西兰雌兔30只,切除双侧卵巢制备去卵巢模型,4周后雌二醇组每周注射苯甲酸雌二醇,模型组注射灭菌棉籽油。分别于23,26,29周龄时处死白兔,并于处死前7,1 h皮下注射BrdU,免疫组织化学染色检测肋骨生长板软骨BrdU阳性细胞;分离单细胞悬液,采用流式细胞仪作细胞周期分析;透射电镜观察软骨细胞超微结构。 结果与结论：两组大鼠BrdU阳性细胞染色率均逐渐下降,雌二醇组肋骨生长板软骨细胞BrdU阳性染色率在23,26周龄时高于模型组(P < 0.05),29周龄时两组差异无显著性意义(P > 0.05)。雌二醇组在23,26周龄时S期软骨细胞增多,至29周龄时明显减少;模型组S期软骨细胞的比例无明显改变,至29周出现G2/M期软骨细胞比例减少,细胞增殖指数降低。电镜观察发现,雌二醇组生长板有更多“暗细胞”形式的凋亡增殖软骨细胞。说明雌激素作用早期可促进软骨细胞增殖,但在作用后期出现细胞周期阻滞,软骨细胞增殖率降低,凋亡增多,从而促进生长板老化过程。     

点种法移植软骨细胞修复关节软骨缺损

背景：生物性的重建虽能达到修复缺损,重建关节面的目的,但功能上难以与正常软骨一致。应用可降解的聚合物把移植的软骨细胞包埋起来进行移植,可能获得真正意义上的透明软骨。 目的：观察以同种异体兔软骨细胞胶原包埋后,点种法移植软骨细胞修复关节软骨缺损的效果。 方法：新西兰纯种兔制备膝关节全层软骨缺损后分为3组：分别进行胶原包埋软骨细胞点种法移植、单纯软骨细胞点种法移植和仅在大面积软骨缺损的软骨下钻孔。 结果与结论：术后2,4,12,24周观察组织学动态变化,发现胶原包埋软骨细胞点种法移植组能获得透明软骨修复,而软骨细胞点种法组和单纯软骨下骨钻孔组缺损区仅为纤维组织填充,并且胶原包埋软骨细胞点种法移植组兔各期平均组织学和组织化学得分均高于其他两组(P < 0.01)。说明胶原包埋点种法软骨细胞移植能获得透明软骨修复,尤其适用于大面积软骨缺损。     

冻存骨髓基质细胞复合材料体内成骨基质的合成能力

摘要 背景: 课题组以往研究显示：体外培养条件下，冻存骨髓基质细胞复苏后仍保持较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力。上述结果仍然需要进一步在体内环境下证实。 目的：观察经超低温冻存后的骨髓基质细胞和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内后Ⅰ型胶原的合成情况。 方法：体外分离培养Beagle犬骨髓基质细胞，冻存12个月后复苏，体外构建骨髓基质细胞和胶原膜材料复合体。分别经矿化诱导培养液、基础培养液培养5 d后，植入裸鼠体内，于术后第4周取出标本，进行大体观察、组织病理学和免疫组化分析，并应用图像分析系统对各组标本中的Ⅰ型胶原进行定量分析。以矿化诱导培养液培养的单纯胶原膜材料为对照组。 结果与结论：对照组在植入胶原膜后，胶原膜边界清晰，膜边缘及内部基本没有细胞生长，Ⅰ型胶原分布很少；在未诱导矿化组，术后第4周可见，胶原膜内有细胞长入，并有细小的条索状新生胶原形成，Ⅰ型胶原分布明显增多；在诱导矿化组，植入后也可见支架材料的分解降解和更多的细胞生长，大量新生的胶原形成类骨质样组织，与前两组对比，Ⅰ型胶原分布增多有显著性意义。结果表明冻存骨髓基质细胞复苏后进行体外培养扩增与诱导分化，并在体内环境下复合胶原支架材料，仍然具有较强成骨能力。 关键词：骨髓基质细胞；胶原膜；免疫组化；裸鼠；成骨能力     

治疗型关节炎护膝对实验性骨关节炎组织形态学的影响

背景：治疗型关节炎护膝具有通经活络、疏导瘀滞、行气活血的作用,已证实是防治膝骨性关节炎行之有效的医疗仪器。 目的：通过观察兔膝骨性关节炎关节软骨组织的病理变化,探讨治疗型关节炎护膝的治疗作用。 设计、时间及地点：随机对照动物观察,于2006-01/10在解放军南京军区福州总医院动物实验中心及病理中心完成。 材料：健康6月龄日本大耳白兔54只,由无锡市惠山江南动物实验中心提供。治疗型关节炎护膝由福建中医学院和福州大学生物医学研究所共同研制,包括疏密波、热软膜程序,两种程序联合为温热动态干扰变频疏密波。微波仪产地日本。 方法：取10只兔作为正常对照组,剩余44只采用改良Hulth法建立膝骨性关节炎模型,造模后随机分为模型对照组9只、微波对照组9只、疏密波组9只、热软膜组8只、疏密波+热软膜组9只。造模后7 d开始每日强迫兔活动30 min,之后正常对照组、模型对照组不进行任何干预,其余组兔固定后分别对应给予微波仪治疗、疏密波治疗、热软膜治疗、疏密波+热软膜联合治疗,30 min/次,1次/d,连续16周。 主要观察指标：通过CR片、光镜和电镜观察膝关节组织形态学变化。 结果：干预16周后,CR片显示正常对照组关节间隙正常,关节面平整光滑,无骨赘;模型对照组内侧间隙明显变窄,有明显骨赘。光镜下正常对照组关节软骨四层结构清晰可辨,软骨细胞排列整齐呈柱状,染色质分布均匀,细胞核清晰;模型对照组关节软骨层变薄,部分区域软骨细胞核固缩、坏死,软骨细胞排列紊乱,四层结构不易分辨。电镜下正常对照组软骨细胞呈椭圆形,细胞及胞膜完整,包质内可见丰富的粗面内质网、高尔基体、线粒体,细胞核完整,染色质分布均匀;模型对照组软骨细胞明显固缩且外形不规则,细胞周晕消失,胞浆内细胞器凝成高电子密度的片状物不易分辨,细胞核不 规则,染色质浓聚,散裂于核中。疏密波+热软膜组在病理程度上的改变明显轻于模型对照组,软骨表面裂纹少,胶原纤维结构基本完整,固缩的软骨细胞少,虽可见部分退变的软骨细胞,但部分软骨细胞具有较多的细胞器,某些区域形成软骨 细胞簇。微波对照组、单纯疏密波组、单纯热软膜组膝关节组织形态学变化介于模型对照组和疏密波+热软膜组之间。 结论：治疗型关节炎护膝的疏密波+热软膜程序能延缓膝关节软骨宏观形态、软骨细胞及软骨基质的退变,效果优于微波仪治疗或单纯的疏密波、热软膜治疗。     

持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响

背景：骨髓基质干细胞来源的成骨细胞是骨髓腔内主要的受力细胞,在人工关节置换病例中,其生命活动状况与假体传导压力有密切关系。 目的：观察持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响,揭示持续压力致假体松动下沉进展及其置换后活动影响的生物学机制。 设计、时间及地点：随机分组设计,细胞学体外观察,于2004-02/2007-10在解放军第四军医大学骨科研究所完成。 材料：出生1个月的新西兰幼兔1只,体质量0.5 kg,取其骨髓基质干细胞用于实验。 方法：传代培养兔骨髓基质干细胞,将生长良好的第3代骨髓基质干细胞按1×104个/孔随机接种于7块24孔培养板,14 h后细胞完全贴壁,换新鲜含体积分数为10%胎牛血清的DMEM。实验随机将4块培养板分为4组：对照组不予加压,20 kPa持续压力组,60 kPa持续压力组,100 kPa持续压力组分别在规定的时间内每天施以20,60,100 kPa的持续3 h压力。 主要观察指标：四甲基偶氮唑盐法检测培养1,3,5,7 d各组骨髓基质干细胞的吸光度值变化。 结果：除培养第1天外,第3,5,7天各压力组骨髓基质干细胞的吸光度值均低于对照组(P < 0.01)。其中第3天20 kPa持续压力组与60 kPa持续压力组吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05),但均高于100 kPa持续压力组(P < 0.05)。第5天不同持续压力组吸光度值两两比较差异具有显著性意义(P < 0.05),压力越高,吸光度值越低。第7天100 kPa持续压力组吸光度值低于压力20 kPa持续压力组(P < 0.05)。 结论：关节置换后早期患者不宜过早下地,否则将产生持续性应力,可以引起骨髓腔内骨髓基质干细胞的抑止,从而不利于骨质愈合,容易产生假体下沉和松动。     

Apoptosls of endothelial cells of cerebral basllar arteries In symptomatic cerebral vasospasm rabbit models-Electron mlcroscoplc observatlon

BACKGROUND: Recent researchers report that vasospasm is caused by that, on one hand, damage of endothelial cells reduces synthesis and liberation of vessel dilator; on the other hand, defluxion of endothelial cells directly exposure vascular smooth muscles in active materials of vasoconstriction in blood. OBJECTIVE: To study whether apoptosis of cerebrovascular cells occurs in symptomatic cerebral vasospasm (CVS) rabbit models by using transmission electron microscope. DESIGN: Contrast observation. SETTINGS: The Fifth Endemic Area, the 89 Hospital of Chinese PLA; Minimally Invasive Neurosurgical Center, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University of Chinese PLA. MATERIALS: A total of 24 New Zealand rabbits, of either sex, weighing 2.4–3.0 kg, of clear grade, were selected from the Experimental Animal Center of the Fourth Military Medical University of Chinese PLA. JEM-2000EX transmission electron microscope was made in Japan. METHODS: The experiment was carried out in the Laboratory of Anatomy (National Key Laboratory), the Fourth Military Medical University of Chinese PLA from April 2001 to April 2002. ① Preparation of symptomatic CVS models: Eighteen animals which were successfully modeled were randomly divided into experimental group (n =13) and control group (n =5). Animals in the experimental group were poured with blood into cavitas subarachnoidealis; while, animals in the control group were poured with the same volume of saline into cavitas subarachnoidealis. At the 5th day injection, three rabbits selected from the experimental group were anesthetized and perfused into left ventricle. And then, aorta pectoralis and caval vein were blocked by using ring clamp. Cranium was rapidly cut open to obtain cerebral basilar artery and a few of brain tissues. Both of them were fixed for 8 hours. Two rabbits selected from the control group were perfused with the same method to obtain basilar artery and brain tissues and fix. ② After fixation by using optic microscope, samples were stained with lead citrate uranyl acetate staining, observed with electron microscope and photographed. MAIN OUTCOME MEASURES: Morphological changes of cytoplasm and nucleus of vascular endothelial cells and smooth muscle cells in the two groups. RESULTS: Morphology of vascular endothelial cells in cerebral basilar artery was not changed in the control group. However, vascular endothelial cells in the experimental group showed that cytochondria were swelling; endocytoplasmic reticulum was amplified; chromatin margination was clear; nucleus was in pyknosis; endothelial cells fell down from basal membrane; cell-cell junction was broken. Changes of smooth muscle cells were similar to those of endothelial cells. Severely, it was shown that nuclear pyknosis was obvious, and this was like early apoptosis. CONCLUSION: Apoptosis of endothelial cells may occur in spasmodic vessels.     

人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞向永生化细胞的转变

背景：颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源，如何使其获得永生化具有重要意义。人类细胞自发永生化的频率非常低，而一些永生化的基因可以显著增加这种频率。 目的：观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用。 设计、时间及地点：观察性实验，于2007-09/2008-06在解放军第四军医大学完成。 材料：选择清洁级孕8.5 d SD大鼠3只，6周，体质量180 g；先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb/c裸小鼠，体质量18~21 g，均由解放军第四军医大学实验动物中心提供。质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供。 方法：原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后，将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞，经G418筛选后扩增，并连续培养。采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达，检测细胞的端粒酶活性，绘制细胞生长曲线观察其增殖能力，并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性。 主要观察指标：细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果。 结果：①质粒PCIneo-hTERT转染细胞后24 h，有少量细胞死亡。加G418后48 h，细胞逐步开始大量死亡。12 d后出现抗性细胞克隆，共有3个细胞克隆生长良好。分别命名为克隆1、2、3。克隆1和克隆2经过20~25代的传代后，细胞发生衰老、死亡；而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好，稳定表达人端粒酶催化亚基和P75。经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高，且能持续表达。②人端粒酶催化亚基基因转染后，3个细胞克隆在初期的增殖能力较强，随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢，出现死亡，克隆3越过衰老期，且无致瘤性。 结论：人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后，细胞得以永生化，其表型稳定，可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞。     

碳质股骨头生物相容性的动物实验*★

背景：已有大量的临床和体外实验研究表明，低温热解各向同性碳具有优良的生物学性能，但作为人工关节假体涂层，置入髋关节内的研究还鲜见报道，其在人工半髋关节假体置换中的生物学性能还没有得到验证。 目的：通过动物假体置入实验，观察经低温热解各向同性碳(含硅)喷涂后碳质股骨头假体的组织相容性及表面摩擦磨损特性。 设计、时间及地点：动物体内进行碳质人工半髋关节替换，随机对照动物实验，于2008-10/2009-04在解放军第二军医大学动物实验中心完成。 材料：碳质人工半髋关节由吉林市中心医院提供。股骨头以碳石墨材料为基体，沉积含硅的低温热解各向同性碳为涂层。 方法：对16只成年新西兰大白兔进行右侧半髋关节置换术，置入碳质股骨头假体。按照观察时间点随机分为术后6周组4只，术后11周组6只，术后21周组6只，其中21周组从18周开始在动物实验中心草坪上进行诱导性运动，2 h/d。 主要观察指标：通过大体、X射线片、组织切片观察假体置入后的组织相容性及界面摩擦磨损现象。 结果：碳质股骨头假体在动物体内无毒副作用，无明显炎症反应和异物反应，在碳质假体周围发现有新生软骨组织，运动实验后碳质股骨头表面没有明显磨损和碳颗粒游离现象。 结论：涂膜碳质材料作为人工股骨头具有优良的生物相容性和耐磨特能，是一种极具应用前景的人工假体材料。 关键词：碳质股骨头；人工髋关节；生物相容性；新生软骨；磨损     

组织工程牙周膜的体外构建**

背景：利用牙周膜干细胞的多向分化潜能修复牙周缺损是近来研究的热点课题。 目的：探讨利用可吸收生物材料冻干胶原膜和犬牙周膜干细胞在体外构建组织工程牙周膜的可行性。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2003-11/2004-10在解放军第四军医大学口腔医院组织工程实验中心完成。 材料：生物膜为冻干胶原膜由解放军第四军医大学口腔医院组织工程实验中心提供。从4只1周岁犬的下颌前牙中分离培养牙周膜干细胞。 方法：取第3代犬牙周膜干细胞扩增至1×107数量级,种植在冻干胶原膜的表面,形成细胞-生物材料复合物,每日更换培养液,倒置相差显微镜动态观察细胞形态和黏附生长状况,体外培养1周左右,组织做扫描电镜、透射电镜和苏木精-伊红染色,观察细胞在冻干胶原膜材料中的生长、增殖以及基质分泌情况。 主要观察指标：①光镜观察细胞接种后生长状况。②电镜和组织学观察细胞支架复合结果。 结果：培养6 d后,犬牙周膜干细胞分泌的基质与支架材料形成网状结构。复合物体外培养1周,细胞黏附在生物支架上,细胞增殖和生长良好,分泌大量基质并形成纤维状结构,细胞复层生长,伸入膜的内部,增殖的细胞和分泌的基质与膜交接成一整体,复合物成为纤维网状组织,基本具备牙周膜的纤维状结构。 结论：利用冻干胶原膜为支架,犬牙周膜干细胞为种子细胞,可在体外成功构建组织工程化牙周膜。     

Distributive characteristics of projection from vestibular nuclei to nucleus raphe magnus in rats

BACKGROUND: Morphological studies have confirmed that vestibular nuclei accepts serotoninergic projections from nucleus raphe magnus, nucleus raphes pallidus, etc. But it is still unclear whether there is bi-directional association between vestibular nuclei and nucleus raphe magnus. OBJECTIVE: To observe the characteristics of projective fibers from vestibular nuclei to nucleus raphe magnus using tetramethyl rhodamine (TMR) in rats, so as to provide more sufficient morphological evidence of neural association from vestibular nuclei. DESIGN: An observational experiment. SETTING: Department of Anatomy (K.K. Leung Brain Research Center), the Fourth Military Medical University of Chinese PLA. MATERIALS: Eighteen male SD rats of clean degree, weighing 250-280 g, were provided by the Experimental Animal Center of the Fourth Military Medical University of Chinese PLA. METHODS: The experiments were carried out in the laboratory of Department of Anatomy (K.K. Leung Brain Research Center), the Fourth Military Medical University of Chinese PLA from September 2006 to January 2007. All the rats were anesthetized with intraperitoneal injection of pentobarbital sodium, then according to the coordinates on the rat brain atlas, 0.1 μL TMR (100 g/L) was injected into nucleus raphes magnus via the tip of glass microtubule by means of microinjection. Seven days later, the rats were anesthetized, then perfused and fixed to remove brain, and then frozen coronal brain sections were prepared. The retrogradely labeled neurons in the injected and projected sites were observed under fluorescence microscope. Light filters with evoked wave length of 540-553 nm and emission wave length ≥ 1 580 nm were selected to observe the orange TMR-labeled neurons. All the sections were observed and counted under the fluorescence microscope. MAIN OUTCOME MEASURES: Characteristics and number of retrogradely labeled neurons at different sites of nuclei. RESULTS: Totally 18 SD rats were enrolled, 9 of them were excluded due to the deviation of injected site, and the other 9 were involved in the final analysis of results. The concentrated region of TMR injection was mainly restricted to nucleus raphes magnus, and diffused to the surrounding area to different extents. There were obvious differences in the distributions of the labeled neurons among the subdivisions in vestibular nuclei, as well as the distributions of the labeled neurons at different sites in the same subdivision. The majority of the labeled neurons distributed in the rostral levels of medial vestibular nucleus and the lateral vestibular nucleus, while fewer labeled neurons were observed in superior vestibular nucleus. CONCLUSION: ① There might be bi-directional association between vestibular nucli and nucleus raphe magnus, suggesting that nucleus raphe magnus played a role in the transmission and processing of vestibular information. ② The projection from nucleus raphe magnus to vestibular nucleus has certain distributive characteristics in the region.     

新鲜自体与异体骨软骨移植修复兔关节软骨缺损的比较

背景：骨软骨移植是修复关节软骨损伤的主要方法之一,但新鲜自体骨软骨移植与新鲜异体骨软骨移植相比效果尚无定论。 目的：探讨新鲜自体骨软骨移植与异体骨软骨移植修复兔关节软骨缺损的方法及疗效。 设计、时间及单位：动物实验观察,于2007-01/2008-05在解放军第四军医大学唐都医院骨科完成。 材料：新西兰大白兔9只,随机分为3组,3只/组,分别实施自体骨软骨移植、异体骨软骨移植、单纯软骨缺损3种手术。 方法：自体移植组：在股骨内侧髁负重关节面取直径3 mm骨软骨缺损,于非负重关节面取4块直径1 mm骨软骨柱移植;异体移植组：在股骨内侧髁负重关节面直径3 mm骨软骨缺损处植入相同直径的异体骨软骨柱;对照组：于股骨内侧髁负重关节面取直径3 mm全层软骨缺损,不做处理。 主要观察指标：术后12周取材,进行大体观察,组织学检查和半定量的改良Wakitani score评分。 结果：大体观察异体移植组修复面较自体移植组稍平整,光镜可见自体和异体移植软骨均已覆盖缺损,与正常软骨高度相当。绝大部分修复面为透明软骨,增殖活跃。软骨下骨、松质骨小梁均与骨床完全骨性愈合。自体移植组软骨浅表区细胞数目及排布更接近正常透明软骨,过渡区及辐射区细胞密度、厚度也明显优于异体移植组,基质染色丰富。 结论：自体与异体骨软骨移植的方法均可完成关节软骨缺损的透明软骨修复,自体骨软骨移植更优。     

定制型聚羟基乙酸/聚乳酸支架与犬骨髓基质细胞的体外复合培养

背景：聚羟基乙酸、聚乳酸均属于脂肪族聚酯,是一种具有一定机械强度和良好成型性能的生物可降解材料,在体内无毒,不聚积,且有良好的生物相容性。 目的：应用CAD、CAM、快速成型和激光扫描技术等组成的数字医学系统制作聚羟基乙酸/聚乳酸三维仿真的下颌支髁突形态模型,并检测其细胞生物相容性。 方法：通过CT扫描获得犬头颅骨影像信息,以CAD和CAM实现下颌骨髁突形态的三维重建影像,快速成型技术获得下颌骨髁突的树脂阳模。阴阳模转换获得相应石膏阴模,聚羟基乙酸/聚乳酸在阴模内成型。抽取犬髂骨骨髓获得骨髓基质细胞,与定制型聚羟基乙酸/聚乳酸支架在体外复合培养,检测支架材料的生物相容性。 结果与结论：定制型聚羟基乙酸/聚乳酸支架和影像原型比较,当测试点误差小于1.0 mm时,复合率大于95%。通过CAD、CAM、快速成型技术、预压成型技术和激光扫描技术等组成的数字医学系统可实现颅颌面下颌骨髁突形态结构聚羟基乙酸/聚乳酸生物材料的三维仿真。体外复合培养结果表明,定制型聚羟基乙酸/聚乳酸支架和骨髓基质细胞具有良好的生物相容性。