071 基于PCR技术的DNA甲基化检测方法研究进展

DNA甲基化是表观遗传修饰最基本的方式,在维持正常细胞功能、胚胎发育和肿瘤发生中起着重要的作用,是当前学术研究的重点和热点.随着研究的深入,为满足不同研究目的需求,DNA甲基化检测方法也得到了较快的发展.本文针对近年来基于PCR技术的DNA甲基化检测方法进行简要的分析总结,为选择适合研究目的的检测方法提供帮助.     

DNA甲基化的分析与状态检测

DNA甲基化是指由甲基转移酶介导，以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，在胞嘧啶5位碳原子上加入一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶的化学反应。DNA甲基化是最常见的复制后调节方式之一，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。CpG甲基化作用已成为阐明正常和病理基因表达现象的重要机制，因而成为当前分子生物学的研究热点之一，近年来，DNA甲基化检测技术有了很大的发展和完善。在此，本文按DNA甲基化检测的目的对DNA甲基化分析检测的技术方法的原理和特点作简要综述。     

表观遗传学DNA甲基化与非创伤性产前诊断

表观遗传学研究与DNA序列改变无关，仅发生表现型改变的过程，DNA甲基化是表观遗传学最具特征的标志之一，DNA甲基化技术的进展将其应用领域扩大到非创伤性产前诊断。甲基化特异性PCR可快速、灵敏地根据胎儿和母亲之间DNA甲基化的差异从母血浆中检测胎儿DNA。     

DNA甲基化在肺癌早期诊断中的研究进展

目的：通过文献综述分析DNA甲基化在肺癌早期诊断中的研究方法和应用方向。方法：共计阅读50篇与DNA甲基化相关的科研论文，对文献中提到的研究方法、研究类型以及研究结果进行了归纳分析，最后将具有代表性的研究结果作为本文的引用内容。结果：抑癌基因的启动子甲基化研究是目前肺癌早期诊断的主要研究方法，并在肺组织、外周血、肺泡灌洗液等标本的监测中表现出巨大的应用潜力。结论：DNA甲基化的样本检测技术虽然已经获得了大量的研究成果，但仍然存在灵敏度低、获取困难等问题急需解决，本文的一系列综述对后期的研究具有一定的参考意义。     

DNA甲基化研究方法的回顾与评价

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用,是目前新的研究热点之一.随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求,这些方法概括起来可分为3类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.该文主要介绍目前应用的大部分DNA甲基化研究方法,并对其相关特性进行简要分析与总结.     

毛细管胶束电动色谱测定基因组DNA甲基化水平

DNA甲基化作为表遗传学的重要研究内容,是哺乳动物表达调控的主要表遗传学形式.研究表明,DNA甲基化与肿瘤关系密切[1-2],全基因组DNA低甲基化是肿瘤细胞基本特征之一[3-4],在肿瘤的发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的混乱.DNA甲基化改变能否作为生物标志用于临床早期诊断已成为当前研究的热点.目前,用于DNA整体甲基化水平检测方法有多种,但能真正从定量的角度进行快速、精确分析的方法却很少.笔者采用毛细管胶束电动色谱(miceller electrokinetic capillary chromatography,MECC)法同时分离DNA酶解后5类单核苷酸(包括mdC),建立了一种快速检测基因组DNA整体甲基化水平的方法.     

一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法。方法应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，通过MGMT基因甲基化与非甲基化特异PCR的扩增，与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较。结果改良法对于低至15．625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物，而传统法对于62．5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物。结论改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度，该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段。     

镉转化细胞DNA异常甲基化对肿瘤相关基因表达的影响

目的 对镉转化细胞DNA异常甲基化及其对肿瘤相关基因表达的影响进行研究，探讨镉的外遗传致癌机制。方法 从CdCl2转化BAIB／c—3T3细胞中提取基因组DNA，经甲基化非敏感性酶(Mse1)单独消化或Mse1和甲基化敏感性酶(BstUl)联合消化，消化产物用甲基化敏感性内切酶指纹法(MSRF)进行分析，差异显示出异常甲基化基因片段，进一步以异常甲基化DNA为探针进行Southern分子杂交加以证实，并进行DNA序列测定，与基因文库中的基因进行类比分析。结果 发现镉转化细胞存在异常甲基化DNA，其中一个甲基化DNA片段为p16抑癌基因。结论 DNA高甲基化会导致基因表达抑制，因此，p16基因高甲基化会导致其抑癌功能减弱或丧失，这可能是镉诱导细胞转化及其致癌作用的一种外遗传机制。     

硅转化BALB/c-3T3细胞基因组DNA异常甲基化的研究

目的 对硅转化细胞基因组DNA异常甲基化进行研究，探讨硅的表遗传致癌机制。方法 从结晶型硅(Si)转化BALB/c-3T3细胞中提取基因组DNA，经Msel(甲基化非敏感性酶)单独消化或Msel和BstU1(甲基化敏感性酶)联合消化，消化产物用甲基化敏感性内切酶指纹法(MSRF)进行分析，差异显示出异常甲基化基因片段，进一步将异常甲基化DNA片段亚克隆和序列测定，再与基因文库中的基因进行类比分析。结果发现硅转化细胞存在6条异常甲基化DNA(其中1条为高甲基化，5条有低甲基化现象)，序列测定显示这些异常甲基化基因片段似乎来源于一些RNA转录和蛋白质翻译等基因家族。结论DNA异常甲基化会导致基因表达激活或抑制，因此硅转化细胞基因组某些功能基因DNA异常甲基化导致的异常表达，可能间接是硅诱导细胞转化及其致癌作用的一种表遗传机制。     

DNA甲基化及其芯片技术研究进展

DNA甲基化是最早发现的、最基本的表观遗传学机制.大量研究表明DNA甲基化与人类疾病有密切关系.DNA甲基化改变包括全基因组水平DNA低甲基化和CpG岛局部高甲基化.DNA甲基化分析方法发展迅速,尤其是近年来,DNA甲基化芯片技术已成为高通量分析DNA甲基化的快速、有效的方法.DNA甲基化芯片主要包括CpG岛微阵列和甲基化寡核苷探针微阵列.本文围绕DNA甲基化相关概念、发生机制、与疾病的关系及主要研究方法等方面进行综述.     

石蜡包埋组织中甲基化特异性PCR全程的质量控制

近年来有关DNA甲基化与肿瘤发生的关系日益受到人们的重视,成为肿瘤分子生物学研究热点之一.而现在对DNA甲基化状态的检测方法不多,Herman等(1996年)在黍亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的PCR,(methyrlafion-specific PCR.MSP)是一个快速敏感的基因甲基化分析方法.它将DNA先用重亚硫酸盐处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变.     

表观遗传学DNA甲基化与非创伤性产前诊断

表观遗传学研究与DNA序列改变无关,仅发生表现型改变的过程,DNA甲基化是表观遗传学最具特征的标志之一,DNA甲基化技术的进展将其应用领域扩大到非创伤性产前诊断。甲基化特异性PCR可快速、灵敏地根据胎儿和母亲之间DNA甲基化的差异从母血浆中检测胎儿DNA。     

一种基于HRM技术的快速DNA甲基化检测方法

目的:建立经济可靠的基于MS-HRM技术的检测DNA甲基化的方法。方法:采用简单的沉淀法纯化回收Bis-DNA(重亚硫酸钠处理后的DNA),首次采用picogreen为MS-HRM分析染料,并用新建立的方法检测结直肠癌患者组织SEPT9启动子甲基化水平。结果:新方法的回收率在63%以上,纯度、得率都显著优于经典方法中的Promega Wizard DNA Clean-up System,Picogreen染料可检测到低至0.5%甲基化。共检测34例结直肠癌组织,其中SEPT9异常甲基化的组织33例,占97%,检出率高于文献报导。结论:本文建立的方法简单快速、灵敏度高、重复性好、经济、可操作性强的优点。     

厨师人群基因组DNA总甲基化水平及影响因素分析

目的探讨烹饪油烟(cooking oil fume,COF)对机体基因组DNA总甲基化水平的影响。方法选取哈尔滨市内宾馆、酒楼等餐饮业从业人员,以120名中餐厨师作为COF暴露人群,以120名从事后勤、市场采购、客房、前台等人员作为对照人群,进行流行病学问卷调查,并采集血液进行基因组DNA总甲基化水平检测。结果 COF暴露组和对照组人群的年龄、受教育程度、吸烟情况、二手烟暴露、工龄等因素差异无统计学意义(P0.05)。两组人群DNA均有不同程度甲基化,但暴露组人群DNA总甲基化水平显著高于对照组(P0.05)。多元回归分析表明COF暴露量是影响厨师DNA总甲基化水平的危险因素,COF暴露量越大,DNA总甲基化水平越高。结论在本研究条件下,长期暴露于COF的厨师人群DNA总甲基化水平显著高于一般人群,DNA总甲基化水平与COF暴露量成正相关,DNA总甲基化水平可作为COF暴露的候选效应生物学标志物,应用于厨师人群肿瘤的早期筛查。     

表观遗传学中DNA甲基化与结直肠癌关系的研究进展

DNA甲基化是恶性肿瘤中常见的一种表观遗传学改变,其可直接导致抑癌基因的转录发生失活,参与恶性肿瘤的发生和发病过程。所以近几年来,DNA甲基化成为表观遗传学研究的关注点,通过对DNA甲基化深入研究,发现有些特异性的异常甲基化的检测,可成为早期诊断肿瘤的特异分子指标。因此,我们现在进一步研究表观遗传学中DNA甲基化与结直肠癌的关系,现分析如下。     

离子交换色谱法检测人血白细胞基因组DNA整体甲基化水平

目的改进现有方法,能快速、稳定、简便地测定人基因组DNA整体甲基化水平。方法采用美国HPAgilent1100色谱工作站,利用离子交换液相色谱法对健康人外周血白细胞基因组DNA整体甲基化水平进行检测。色谱柱采用德国MN公司的强阳离子交换色谱柱（250mm×4．6mm5μm）;流动相为60mM醋酸＋15％乙腈,用氢氧化钠调节pH为4．6;流速为1．0ml／min;检测器波长为276nm;柱温为28℃;进样量为50μl。基因组DNA整体甲基化水平用5甲基脱氧胞嘧啶核苷占DNA样品中总脱氧胞嘧啶核苷的百分数来表示。结果在上述色谱条件下,约10min可以将DNA中的脱氧胞嘧啶核苷和5甲基脱氧胞嘧啶核苷完全分离。并测得健康成人血白细胞基因组DNA整体甲基化水平为（4．389±0．0159）％。结论本方法能快速、有效地对基因组DNA整体甲基化水平进行检测,可供广大实验室采用。     

放射介入工作人员DNA甲基化和染色体损伤影响因素分析

目的观察和研究放射介入工作人员DNA甲基化和染色体损伤情况,分析介入操作年限等因素对DNA甲基化和染色体损伤指标的影响。方法高效液相色谱法检测淋巴细胞DNA甲基化结合微量全血培养法观察染色体畸变和微核情况并分析。结果放射介入工作人员微核率和染色体畸变率均高于对照组;介入操作年限10年组DNA总甲基化率低于其他2组;不同介入操作年限组间微核率和染色体畸变率比较,上述差异均有统计学意义(P0.05);微核率和染色体畸变率与DNA总甲基化率呈负相关,介入操作年限与微核率和染色体畸变率呈正相关(r=0.634,P0.05),与DNA总甲基化率呈负相关(r=-0.306,P0.05)。结论介入工作人员职业暴露工作年限是DNA甲基化降低、染色体畸变率和微核率增加的重要风险因素。     

SRY和maspin基因对胎儿游离DNA的检测效率

目的:探讨应用非性别依赖的表观遗传学标记代替SRY基因检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的可行性。方法:分别以SRY基因和不同甲基化状态的maspin基因序列为标记对孕妇和非妊娠女性血浆中的游离DNA进行PCR和甲基化PCR检测,并对结果进行统计学分析。结果:孕男胎孕妇血浆DNA标本中SRY基因的检出率为93.9%。u-maspin(maspin基因的非甲基化序列)仅在妊娠组中被检测出,检出率88.3%。两检出率间的差异不具有统计学意义。m-maspin(maspin基因的甲基化序列)在妊娠组和非妊娠组中的检出率无差异。结论:u-maspin基因可作为非性别依赖的胎儿DNA特异性标志物,相对于以SRY基因作为标志物有助于扩大非创伤性产前诊断的临床应用范围。     

甲基化荧光PCR检测母血中游离胎儿maspin基因的研究

目的:探讨Taqman探针与甲基化特异性PCR(MSP)技术结合测定孕妇血浆中甲基化maspin(M-maspin)基因和非甲基化maspin(U-maspin)基因的可行性,并分析微量U-maspin的临床意义。方法:选择正常早、中、晚期妊娠妇女各30例为研究对象,健康未妊娠女性30例为对照,提取其血浆游离DNA。通过含目的基因质粒标准品绘制标准曲线,并应用甲基化荧光PCR方法检测各组血浆标本亚硫酸氢盐修饰后M-maspin基因和U-maspin基因的含量,分别代表母源性游离DNA和胎源性游离DNA水平。结果:除3例早期妊娠孕妇外,其余孕妇血浆中均检出了U-maspin基因,平均浓度在早期妊娠组为57拷贝/ml,中期妊娠组为121拷贝/ml,晚期妊娠组为561拷贝/ml;占母源性M-maspin基因的比例分别为1.88%、3.21%、9.58%。结论:母血中U-maspin基因具有游离胎儿DNA的动力学特点,可能成为一种通用胎儿标记物,应用甲基化荧光PCR技术检测孕妇血浆中微量U-maspin基因方法准确、可行。     

ABO基因启动子CpG岛甲基化与鼻咽癌的相关性研究

目的 探讨鼻咽癌与ABO基因启动子CpG岛甲基化的相关性,为鼻咽癌的早期诊断提供依据.方法 采用病例对照研究,取46例鼻咽癌患者和30例健康者的基因组DNA样本应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)-序列直接测定技术,检测ABO基因启动子DNA序列,采用重亚硫酸盐转化后克隆测序法检测ABO基因启动子CpG岛甲基化程度.结果 鼻咽癌患者和健康人群的ABO基因启动子序列未发现有序列的不同.与正常对照标本比较,分析的ABO启动子区内共37个CpG位点的甲基化水平,发现鼻咽癌患者所有位点均检出甲基化,呈现不同程度的甲基化水平,其中nt-26C残基甲基化高达20.52％.结论 鼻咽癌与ABO启动子CpG岛甲基化存在相关性,多个甲基化位点可能是鼻咽癌的特异性表现.