高表达GPX_l对阿尔茨海默病细胞模型内P-CREB水平的影响

目的探讨细胞内高表达谷胱甘肽过氧化物酶(GPXl)能否提高阿尔茨海默病(AD)细胞模型中cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化水平。方法采用MTT法确定G418的筛选浓度,采用目的质粒与绿色荧光蛋白质粒共转染的方式将GPXl重组质粒和pLNCX空载体质粒转染至PC12细胞,以G418筛选浓度筛选出成功转染进GPXl重组质粒和pLNCX空载体质粒的细胞;采用MTT法确定β淀粉样蛋白(Aβ25-35)的最佳诱导浓度,建立AD细胞模型;以最佳Aβ25-35浓度分别诱导转染GPXl重组质粒组和转染pLNCX空载体质粒组细胞48h,采用免疫细胞化学方法检测诱导前后各组细胞内P-CREB的水平。结果在最佳Aβ25-35浓度诱导转染GPXl重组质粒组和转染pLNCX空载体质粒组前,两组细胞内的P-CREB水平无统计学差异(P>0.05);诱导48h后,两组细胞内P-CREB水平均显著降低(P<0.01),但转染GPXl重组质粒组细胞内的P-CREB水平仍明显高于转染pLNCX空载体质粒组的水平(P<0.01)。结论 Aβ25-35可导致细胞内P-CREB水平降低,转染GPXl重组质粒可在一定程度上逆转Aβ25-35所致的P-CREB水平降低。     

稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白细胞模型的建立与鉴定

目的 建立和鉴定稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白(APP)的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型.方法 脂质体转染法将含人野生型APP751 cDNA的真核表达质粒pcDNA3/APP APP751WT转染至SH-SY5Y细胞,G418对转染后细胞进行筛选,获得稳定表达人野生型APP751细胞模型.Western blotting法、MTT比色法和放射免疫法检测细胞APP表达水平、细胞生长情况和细胞内外β-淀粉样蛋白(Aβ)表达水平.结果 转染组细胞APP表达水平明显高于未转染组和空载体组.未转染组和空载体组细胞滞留期为12 h,对数生长期为12 h-4 d;转染组细胞滞留期为24h,对数生长期为1～4d;培养12 h后,转染组细胞活力低于未转染组和空载体组(t=4.363,P=0.0012;t=4.040,P=0.003),培养1 d后,转染组细胞活力降低,且低于未转染组和空载体组(t=4.736,P=0.001;t=4.317,P=0.005),其余各时间点差异均无统计学意义(P>0.05).转染组细胞细胞外Ap表达水平高于未转染组和空载体组(t=7.690,P=0.000;t=7.448,P=0.000),而3组细胞细胞内A8表达水平则差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功建立稳定表达人野生型APP751的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞模型,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制提供了良好的细胞模型.     

FOXC2过表达通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤U87细胞增殖、迁移

目的 探讨FOXC2过表达对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其机制.方法 体外培养人脑胶质瘤U87细胞和人脑胶质细胞HEB.U87细胞随机分为空白组(未转染任何质粒)、空载体组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、FOXC2过表达组(转染pcDNA3.1-FOXC2过表达质粒)、FOXC2+抑制剂组[转染pcDN...     

早老素-1V97L基因突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响

目的 探讨早老素-1(presenilin-1,PS-1)Val97Leu位点突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响.方法采用一步法定点突变技术,由含有野生型(wild type,wt)PS-1的pcDNA3.1/Zeo(+)质粒合成携带有突变位点Val97Leu的突变型(mutation type,mt)PS-1质粒并转染至神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中,筛选出稳定表达的细胞系.用ELISA法和放射免疫法来检测培养基及胞浆中Aβ42和总Aβ含量;同时检测APP及BACE表达水平的变化.结果48小时,转染突变PS-1基因的细胞,细胞内和细胞外Aβ42的含量较24小时有显著提高,且相对未转染、wt和mock转染的细胞也有显著提高,而各组间总Aβ的含量变化无明显差异.APP及BACE的表达水平各组间也无明显差异.结论 此中国人阿尔茨海默病家系中发现的PS-1基因Val97Leu突变为一新的突变位点,可选择性引起细胞内外Aβ42的增高,因此认为是一病理性突变.     

S14G-humanin对β-淀粉样蛋白纤维化及其细胞毒性的影响

目的 探讨S14G-humanin(HNG)对β-淀粉样蛋白(Aβ)纤维化及其细胞毒性的影响.方法 于体外将Aβ1-42和不同浓度HNG共孵育,并设空白对照,应用硫黄素-T(Th-T)荧光法和透射电镜方法,观察HNG对Aβ1-42纤维化的作用;将Aβ1-42和不同浓度HNG共孵育后加入培养的大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞(PC12细胞),应用MTT法测定PC12细胞活性,观察不同浓度HNG对Aβ-42细胞毒性的拮抗作用.结果 (1)不同浓度HNG(100、200、400 μmol/L)+Aβ1-42(100μmol/L)组Th-T荧光强度(241.86±8.41,188.27±4.47,112.36±5.27)均较Aβl-42组(514.85±14.52)显著降低(P<0.01),且各组Th-T荧光强度随HNG浓度增加而降低,各组间比较有统计学差异(P<0.01).(2)透射电镜观察表明不同浓度HNG+Aβ1-42组纤维性Aβ均较Aβ1-42组显著减少.(3)不同浓度HNG(10、20、40 μmol/L)+Aβ1-42(10μmol/L)组PC12细胞活性C(67.83±3.57)%、(79.26±3.13)%、(89.67±3.25)%]均较Aβ1-42组[(57.52±5.41)%]显著增加(P<0.01),且各组细胞活性随HNG浓度增加而增加,各组间比较有统计学差异(P<0.01).结论 HNG在体外能够有效减少纤维性Aβ1-42形成并可抑制其细胞毒性作用,提示HNG有可能成为有效防治阿尔茨海默病的新药物.     

14-3-3蛋白过表达减轻MPP+对PC12细胞的毒性损伤

目的 探讨14-3-3蛋白过表达对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞损伤的保护作用和可能的机制.方法 构建pcDNA3.1(+)-14-3-3真核表达质粒,转染PC12细胞,建立稳定过表达14-3-3蛋白细胞株;通过四甲基偶氮唑盐法(MTT法)、流式细胞术和酶标仪分别检测14-3-3蛋白过表达对MPP+诱导的PC12细胞存活力、凋亡率和SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响.结果 14-3-3蛋白过表达显著增加PC12细胞SOD活性[质粒转染组(9.13±0.41)U/mg,MPP+组(6.45±0.52)U/mg]和GSH-Px活性[质粒转染组(89.66±3.42)μmol/mg,MPP+组(82.73±4.15)μmol/mg]、增强细胞活力[吸光度(A570):质粒转染组0.78±0.06,MPP+组0.54±0.07]、抑制细胞的凋亡(质粒转染组11.87%±3.26%,MPP+组36.30%±2.39%).结论 14-3-3蛋白过表达对MPP+的毒性有保护作用,这是通过增加SOD和GSH-Px的活性,减少氧化应激实现的.     

加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究

目的观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制。方法采用5μMAβ_(1-40)作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ_(1-40)处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究。倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平。结果 Aβ_(1-40)孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ_(1-40)孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高。结论加兰他敏通过抑制Aβ_(1-40)诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用。     

LINC00612靶向结合Bcl-2抑制Aβ1-42孵育的神经元凋亡

目的探讨LINC00612对β-淀粉样蛋白(amyloid protein β,Aβ) 1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法利用Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞建立阿尔茨海默病神经元损伤模型。应用qRT-PCR实验检测Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中LINC00612的表达。将LINC00612过表达质粒转染至Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞,Western blot实验检测Bcl-2的表达,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡。RNA-pulldown和RIP实验检测LINC00612与Bcl-2的结合作用。结果 LINC00612在Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞中低表达。过表达LINC00612显著增加Bcl-2表达量,降低细胞凋亡。RNA-pulldown和RIP实验结果显示LINC00612能够与直接Bcl-2结合。结论过表达LINC00612能够上调Bcl-2表达量,抑制Aβ1-42孵育的SH-SY5Y细胞凋亡。     

小檗碱通过抑制β分泌酶的表达抑制Aβ产生的机理

目的 探讨小檗碱抑制Aβ产生的机理.方法 稳定转染人淀粉样前体蛋白瑞典突变695的人胚胎肾293细胞(HEK293APPsw695)分别给与小檗碱(1μM,5μM,10μM和20μM)48 h、5μM小檗碱(8 h,24 h,48 h和72 h)、U0126(0.5μM)48 h以及小檗碱(5 μM)+U0126(0.5μM)48 h,然后分别通过噻唑蓝(MTT)技术和测定培养基中乳酸脱氢酶的活性研究以上各处理对HEK293APPsw695增殖和毒性的影响,通过ELISA方法检测各处理组对HEK293APPsw695产生Aβ40/42的影响.通过WB方法研究各处理组对β分泌酶和p-ERK1/2表达的影响.结果 以上各处理对HEK293APPsw695细胞的增殖和毒性没有影响,小檗碱以时间和浓度依赖的方式显著抑制Aβ40/42的产生和β分泌酶的表达.以及促进p-ERK1/2的表达,U0126完全逆转小檗碱对Aβ40/42产生和β分泌酶表达的抑制,以及对p-ERK1/2表达的促进.结论 小檗碱可能通过活化ERK1/2通路抑制β分泌酶的表达而抑制Aβ40/42的产生.     

芳香化酶抑制通过降低抗氧化应激能力影响稳转hSOD1-G93A的NSC-34细胞活力

目的 研究抑制芳香化酶表达对稳定转染人SOD1-G93A(hSOD1-G93A)的NSC-34细胞活力的影响并探讨可能的机制.方法 将稳定转染hSOD1-G93A的NSC-34细胞分为三组,分别为对照组(SOD-G93A)、转染空质粒组(SOD1-G93A-E)、转染芳香化酶抑制质粒Cyp19a1 ShRNA组(SOD...     

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默c-Met基因表达对人脑胶质瘤U251细胞生长活力及体外侵袭能力的影响。方法 将设计好的c-Met基因干扰载体转染至U251细胞中,根据转染质粒不同分为空白对照组（不转染任何质粒）、空载体组（转染空载体）和干扰组（转染重组质粒）。采用四唑盐比色法（MTT）检测细胞的生长活力的变化;采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果 MTT检测结果显示干扰组光密度值（0.156±0.164）显著低于空白对照组（0.21±0.146;P<0.05）和空质粒组（0.191±0.138;P<0.05）,而空质粒组和空白对照组无显著差异（P>0.05）。细胞体外侵袭能力检测结果显示,干扰组穿膜细胞数[（13.60±3.34）个]显著低于空白对照组[（32.90±6.49）个;P<0.05]和空质粒组[（23.10±2.77）个;P<0.05],而空质粒组和空白对照组无统计学差异（P>0.05）。结论 沉默c-Met基因表达能明显抑制U251细胞的生长活力及其侵袭能力。     

敲低Aurora A基因增强替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞的作用

目的探讨敲低Aurora A基因对替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞的作用。方法以慢病毒介导Aurora A shRNA转染高表达Aurora A基因的U87人脑胶质瘤细胞敲低其表达;转染后荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR、Western blot分别检测Aurora-A mRNA及蛋白表达;证实转染成功后,以不同浓度梯度替莫唑胺作用于未转染组、空载体组和转染组3组细胞,每组5个平行孔,并设空白对照及阴性对照,作用一定时间后用CCK8法测定替莫唑胺对细胞增殖影响;流式细胞仪测替莫唑胺对细胞周期的影响。结果荧光显微镜下可见转染组及空载体组细胞带绿色荧光;未转染组、空载体组和转染组的RT-PCR和Western blot结果灰度值分别为(31023±926)、(30124±1074)、(896±172)和(39556±2306)、(39348±2738)、(574±96)。相对于空载体组和未转染组,转染组的Aurora A mRNA和蛋白表达均降低(P0.001);未转染组、空载体组和转染组的半数有效抑制浓度(IC50)分别为:(43.38±2.15)μmol/L、(43.76±1.52)μmol/L、(22.20±2.34)μmol/L,转染组替莫唑胺半数有效抑制浓度(IC50)降低(P0.01);替莫唑胺处理的转染组G2/M期细胞百分数(88.01%±7.35%)高于空载体组(59.28%±6.76%)和未转染组(58.35%±5.98)(P0.01),与对照的相同细胞株相比G2/M期均延长(P0.01)。结论敲低Aurora A基因表达可增强替莫唑胺抗人脑胶质瘤U87细胞作用。     

多光子激光扫描成像技术对活细胞内淀粉样前体蛋白裂解和β-淀粉样蛋白生成的观察(英文)

目的在活细胞内探究淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解和p一淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的生成机制。方法利用PCR扩增CFP(编码蓝色荧光蛋白),YFP(编码黄色荧光蛋白)和C99(编码APP最后99个氨基酸)三片段。含有54个碱基(编码APP中间18个氨基酸)的片段54bp由生物公司合成。CFP,YFP,54bp和C99四个片段连入载体质粒pcDNA3.0得到重组质粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP- C99。将这两个重组质粒分别瞬时转染SH-SY5Y细胞。利用多光子激光扫描显微镜观察融合基因的表达,荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测APP的β裂解。免疫细胞化学和多光了激光扫描显微镜观察Aβ的生成。MTT检测转染细胞活性。结果(1)限制性内切酶双酶切消化和测序分析鉴定重组质粒序列完全正确。(2)转染细胞内可以观察剑蓝色平和黄色荧光。(3)在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP转染细胞中存在FRET现象;在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞中观察不到FRET现象。(4)免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察到在pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99转染的细胞中有Aβ的牛成。(5)Aβ的沉积广泛分布于细胞内。(6)随着Aβ在细胞内的产生和聚集,细胞的活性逐步下降。结论C99对于APP的β裂解非常重要。早期Aβ首先在细胞内生成并在细胞内形成广泛沉秋。细咆内聚集的Aβ会影响细胞活性,带来不利结果。     

pIRES2-EGFP-Aβ342重组质粒的构建及其在N2a细胞中的表达

目的 构建重组质粒pIRES2-EGFP- Aβ42,转染小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞,建立稳定表达Aβ42的Neuro-2a细胞系,为体外研究阿尔茨海默病提供新的途径.方法 将质粒pGEMT-Aβ42上的Aβ42基因酶切后,与真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-Aβ42.酶切鉴定正确后,采用脂质体介导法转染Neuro-2a细胞,800mg/L G418筛选4w,后续培养G418浓度维持在200mg/L.扩增细胞以低密度培养,HE染色观察细胞形态,免疫组织化学染色法检测Aβ42的表达.结果 酶切鉴定显示重组质粒pIRES2-EGFP- Aβ342构建正确;pIRES2-EGFP-Aβ42转染Neuro-2a细胞,经G418筛选后扩增的细胞均表达绿色荧光蛋白,呈现绿色荧光;免疫组织化学染色显示经G418筛选后的细胞表达Aβ42;HE染色结果显示低密度培养条件下,细胞内表达的Aβ42未引起对细胞形态和增殖能力的明显改变.结论 成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-Aβ42,获得稳定表达Aβ42的细胞系.     

RNAi沉默CAPN1基因对Aβ 25-35诱导的原代神经细胞的神经毒性及凋亡的影响

目的探讨CAPN1 RNAi对Aβ25-35诱导的原代神经细胞的神经毒性及凋亡的影响。方法利用Aβ25-35诱导原代胎鼠皮质神经元毒性损伤,观察CAPN1 RNAi对神经元细胞活力、凋亡的影响。实验分为4组:对照组(NC)、NC+Aβ、CAPN1 shRNA+Aβ、CAPN1 shRNA+Aβ+P25。CCK-8法检测神经元细胞活力的变化情况;Annexin V-PI方法进行细胞凋亡检测;Real-Time PCR检测转染CAPN1 RNAi后CAPN1 mRNA的表达水平;Western blotting检测CAPN1、CDK5、GSK3β、p-tau/tau蛋白表达的变化。结果 CCK8检测结果显示,与对照组相比,NC+Aβ组细胞活力明显下降,转染CAPN1 shRNA后细胞活力有明显改善(P0.05);与CAPN1 shRNA+Aβ组相比,CAPN1 shRNA+Aβ+P25组细胞活力无显著性差异(P0.05)。Annexin V-PI凋亡实验结果表明:与NC+Aβ组相比,转染CAPN1 shRNA后细胞早期凋亡比例显著降低(P0.01)。RT-PCR检测结果表明:与NC+Aβ组相比,CAPN1 shRNA+Aβ组CAPN1 mRNA的表达显著得到抑制。Western blot发现NC+Aβ组中CAPN1、CDK5、GSK3β、p-tau蛋白表达水平均显著升高,而转染CAPN1 shRNA后均显著下调(P0.01)。结论 CAPN1RNAi可以显著改善Aβ25-35诱导的原代神经细胞的神经毒性及凋亡。     

Me32aT22/2L细胞内肝豆状核变性基因的表达恢复铜转运功能的实验研究

目的 观察Me32aT22/2L细胞内肝豆状核变性基因(ATP7B基因)的表达是否可以转运细胞内的多余铜及纠正铜对细胞的毒性作用.为基因治疗肝豆状核变性奠定基础. 方法 采用脂质体lipofectamin2000,将含ATP7B cDNA重组真核表达质粒pRc/CMV-WD导人Me32aT22/2L细胞内,免疫荧光检测ATP7B在细胞内的表达分布;高铜孵育培养观察外源性ATP7B的铜转运功能,以及检测ATP7B减低高铜对细胞的毒性作用. 结果 转染后的Me32aT22/2L细胞内可检测到ATP7B的表达,且分布在细胞核的周围;在高铜孵育24、48、72 h后,转染空载体组细胞内铜的含量分别为(600.60±69.71)ng/mg、(890.72±65.74)ng/mg和(1189.20±85.71)ng/mg,而表达有外源性ATP7B的细胞内铜的含量分别为(351.33±49.86)ng/mg、(427.38±30.95)ng/mg和(539.10±34.91)ng/mg,两组相比差异均有统计学意义(P,0.01);同时,与转染空载体组相比,转染ATP7B基因的细胞中的细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.01). 结论 ATP7B基因转人Me32aT22/2L细胞后能得到有效表达,并可以将细胞内多余的铜转运出去,从而降低了铜对细胞的凋亡诱导作用.     

pIRES2-EGFP-Aβ42重组质粒的构建及其在N2a细胞中的表达

目的构建重组质粒pIRES2-EGFP-Aβ42,转染小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞,建立稳定表达Aβ42的Neuro-2a细胞系,为体外研究阿尔茨海默病提供新的途径。方法将质粒pGEMT-Aβ42上的Aβ42基因酶切后,与真核表达质粒pIRES2-EGFP连接,构建重组质粒pIRES2-EGFP-Aβ42。酶切鉴定正确后,采用脂质体介导法转染Neuro-2a细胞,800mg/L G418筛选4w,后续培养G418浓度维持在200mg/L。扩增细胞以低密度培养,HE染色观察细胞形态,免疫组织化学染色法检测Aβ42的表达。结果酶切鉴定显示重组质粒pIRES2-EGFP-Aβ42构建正确;pIRES2-EGFP-Aβ42转染Neuro-2a细胞,经G418筛选后扩增的细胞均表达绿色荧光蛋白,呈现绿色荧光;免疫组织化学染色显示经G418筛选后的细胞表达Aβ42;HE染色结果显示低密度培养条件下,细胞内表达的Aβ42未引起对细胞形态和增殖能力的明显改变。结论成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-Aβ42,获得稳定表达Aβ42的细胞系。     

β-淀粉样蛋白影响维甲类X受体α到细胞质的穿梭

目的 探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)对维甲类X受体α(RXRα)生成及到细胞质迁移的影响。方法 将野生型小鼠脑神经瘤细胞(N2awt)分为对照组和实验组,采用Aβ短肽及淀粉样肽前体蛋白(APP)695过表达处理实验组,应用核质分离结合Western blot方法,检测RXRα在细胞核和细胞质中的含量;分别对上述2组N2awt细胞及阿尔茨海默病(AD)患者及健康对照者的脑组织切片进行免疫荧光定位染色,观察RXRα在细胞核与细胞质中分布的改变。结果 在N2awt细胞中,APP或Aβ增多不影响RXRα的表达但导致RXRα在细胞质中含量与分布增多,分别从对照组的3.2％增加至APP处理组的17.6％及从对照组的3.8％增加至Aβ处理组的14.3％;与健康人比较,AD患者脑皮质细胞中RXRα在细胞质分布增加。结论 Aβ可能影响RXRα到细胞质的穿梭。     

阿尔茨海默病中β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31与自噬的相关性研究

目的 探讨β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31的毒性作用和自噬的关系,以及自噬是否介导C31的清除.方法 首先构建p3 xFLAG—CMV—10—mCherry-C31(C31)质粒和p3xFLAG-CMV-10-mCherry(Vector)质粒(对照),采用脂质体转染法转染入SH-SY5Y和APPsw稳转的HEK293(APPsw HEK293)细胞系中,并通过Western blot方法验证其表达;采用MTT法检测C31和Vector质粒瞬时转染48 h后的细胞存活率;分别予以不同的自噬调节药物,Western blot检测自噬相关蛋白(LC3)和C31水平.最后,通过免疫共沉淀法检测C31是否可以和LC3结合,并采用免疫荧光检测C31是否可以与LC3共定位,以进一步验证自噬是否为介导C31降解的关键途径.结果 在SH-SY5Y和APPsw HEK293细胞系中,C31质粒转染组细胞活力显著低于对照组(P＜0.05);转染C31组与对照组自噬水平无明显差异;促自噬情况下(雷帕霉素和饥饿处理),LC3—Ⅱ的水平比未加药处理组略增高,但未达到统计学意义,C31水平相对于空载水平差异无统计学意义;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于APPsw HEK293细胞后,LC3—Ⅱ水平有轻度降低,但未达到统计学意义,C31水平改变也未达到统计学意义;加入自噬体和溶酶体融合抑制剂氯喹(CQ)和氯化铵(NH4Cl)后,细胞自噬水平有明显的增高,且CQ的作用最为明显,C31水平相对于空载水平明显增高(P＜0.05).在SH—SY5Y细胞中,结果类似,但CQ和NH4Cl作用后,C31水平相对于空载水平无统计学差异.免疫荧光显示C31通过与自噬相关蛋白LC3结合,从而锚定到自噬体上,而参与到自噬代谢过程.结论 C31在SH-SY5Y细胞和APPsw HEK293细胞中均能产生细胞毒性作用.过表达C31不改变细胞的自噬水平.自噬途径介导C31的清除,表明自噬可能在阿尔茨海默病中起到保护作用.