离心管技术构建的组织工程软骨细胞生物学特性的研究

目的 观察离心管技术构建的组织工程化软骨的细胞生物学特点，探讨该技术构建组织工程化软骨的可行性。方法 取3周龄兔关节软骨的表层软骨，经酶消化获得大量的软骨细胞，用离心管技术构建软骨组织，对培养3周的组织工程软骨进行组织学，免疫组织化学，透射电镜，^3H-TdR掺入量等检查。结果 组织学显示软骨细胞位于陷窝，基质异染，Ⅱ型胶原免疫组化阳性，细胞内富含高尔基体，分泌囊泡和糖原颗粒，^3H-TdR掺入量显示软骨细胞DNA较正常软骨细胞明显增强。结论 离心管内软骨细胞的增殖较正常关节软骨增强，离心管技术可用于组织工程软骨的构建。     

生长因子（IGF—Ⅰ、TGF—β1和BMP—2）对兔关节软骨细胞体外增殖的作用

目的 观察IGF－Ⅰ、TGF-β1和BMP－2对培养兔关节软骨细胞增殖的作用。方法 采用体外培养2兔关节软骨细胞的方法，利用^1H-TdR掺入反映软骨细胞增殖。结果 IGF－Ⅰ和TGF-β1均可促进软骨细胞^3H-TdR掺入增加，并有一定的协同作用。面BMP－2对软骨细胞^3H-TdR掺入无显著影响，但与TGF-β1和IGF－I合用时却有抑制^3H-TdR掺入的作用。结论 生长因子之间的不同组合可以协同或拮抗方式影响软骨细胞的增殖，提示生长因子在关节软骨退变和防治上可能有重要的意义。     

IGF—Ⅰ和TGF—β1对幼年及成年兔关节软骨细胞增殖和代谢的作用

目的 观察IGF－I和TGF－β1对幼年及成年兔关节软骨细胞增殖和代谢的作用。方法 采用体外培养兔关节软骨细胞的方法。利用^3H-TdR和^35S-Na2SO4掺入分别反映软骨细胞增殖和骨质蛋白多糖的合成,应用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡,结果 随年龄增加、关节软骨细胞凋亡增加,同时增殖和蛋白多糖的合成能力下降,而且对IGF－I和TGF－β1反应性亦呈年龄相关下降。但是IGF－I和TGF－β1均可能在一定程度上以剂量依赖方式促进软骨细胞^3H-TdR和^35S-Na2SO4掺入增加。结论 外源性TGF－I和TGF－β1在体外可促进不同年龄兔关节软骨细胞增殖和基质合成,提示外源性生长因子在骨关节炎的防治上可能有一定意义。     

生长因子(IGF-I、TGF-β1和BMP-2)对兔关节软骨细胞体外增殖的作用

目的观察IGF-Ⅰ、TGF-β1和BMP-2对培养兔关节软骨细胞增殖的作用.方法采用体外培养兔关节软骨细胞的方法,利用3H-TdR掺入反映软骨细胞增殖.结果 IGF-Ⅰ和TGF-β1均可促进软骨细胞3H-TdR掺入增加,并有一定的协同作用.而BMP-2对软骨细胞3H-TdR掺入无显著影响,但与TGF-β1和IGF-Ⅰ合用时却有抑制3H-TdR掺入的作用.结论生长因子之间的不同组合可以协同或拮抗方式影响软骨细胞的增殖,提示生长因子在关节软骨退变和防治上可能有重要的意义.     

Bax、bcl-2在组织工程软骨细胞中的表达及其意义

目的　比较分析离心管构建的组织工程软骨细胞与正常兔关节软骨细胞凋亡调控基因bax和bcl 2mRNA、蛋白表达的差别及意义。方法　取 8例离心管构建 3周的组织工程软骨做实验标本 ,以 6例 3周龄兔关节软骨作正常对照。采用逆转录 /聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测bax和bcl 2mRNA的表达 ,免疫组化技术检测bax、bcl 2蛋白。结果　组织工程软骨和正常关节软骨细胞均表达bax和bcl 2mRNA ;组织工程软骨细胞bax和bcl 2mRNA的表达量均较正常对照组增高 ,差异显著 (P <0 .0 5 ) ;两组间bax/bcl 2的比值无显著差异 (P >0 .0 5 )。免疫组化检测到相应的bax与bcl 2蛋白表达。结论　组织工程软骨细胞凋亡同样受到bax与bcl 2基因的共同调节     

IGF-I和TGF-β1对幼年及成年兔关节软骨细胞增殖和代谢的作用

目的观察IGF-I和TGF-β1对幼年及成年兔关节软骨细胞增殖和代谢的作用。方法采用体外培养兔关节软骨细胞的方法,利用3H-TdR和35S-Na2SO4掺入分别反映软骨细胞增殖和基质蛋白多糖的合成,应用TUNEL法检测软骨细胞的凋亡。结果随年龄增加,关节软骨细胞凋亡增加,同时增殖和蛋白多糖的合成能力下降,而且对IGF-I和TGF-β1的反应性亦呈年龄相关下降。但是IGF-I和TGF-β1均可能在一定程度上以剂量依赖方式促进软骨细胞3H-TdR和35S-Na2SO4掺入增加。结论外源性IGF-I和TGF-β1在体外可促进不同年龄兔关节软骨细胞增殖和基质合成,提示外源性生长因子在骨关节炎的防治上可能有一定意义。     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

鞣酸对人食管癌细胞系EC9706的抑制作用

目的 探讨鞣酸对体外培养的人食管癌细胞EC9706的生长抑制作用。方法 不同浓度鞣酸（100、200、300、400、500μmol／L）作用EC9706细胞24、48、72、96h后，通过MTT比色法研究鞣酸对EC9706细胞增殖的影响，采用流式细胞仪观察400μmol／L鞣酸能否诱导EC9706细胞凋亡。^3HTdR、^3HLeucine掺入法研究400μmol／L鞣酸对食管癌细胞DNA复制及蛋白合成的影响。结果 鞣酸呈时间、剂量依赖性方式抑制EC9706细胞增殖；流式细胞术检测显示出典型的凋亡峰，细胞凋亡率为46．8％；^3H—TdR、^3H—Leucine掺入量明显减少。结论 鞣酸可以抑制食管癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，可能是预防和治疗食管癌的一种新型化合物。     

60Coγ射线诱导的K562细胞增殖抑制和凋亡的研究

目的：观察不同剂量的γ射线和照后不同时间的K562细胞的增殖抑制及凋亡情况。方法：细胞动态计数；^3H-TdR掺入分析；利用ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit在荧光显微镜下观察荧光情况和在流式细胞仪上测定凋亡细胞的比例。结果：在不同剂量照射和照后的不同时间处，^60Coγ射线诱导的细胞增殖抑制和凋亡情况明显不同：细胞增殖抑制情况与受照剂量的大小呈正相关，细胞凋亡比例与受照剂量的大小未见明显相关性，而表现为在照后6h处凋亡细胞较多。结论：^60Coγ射线照射引起的肿瘤细胞增殖抑制有一定的发生时机，并且表现出剂量相关性，而其引起的凋亡效应则更多地表现为时间相关性。     

流式细胞术法与3H-TdR掺入法观察细胞增殖的相关性研究

目的:研究3H-TdR掺入法和流式细胞术法研究指标的相关性,探讨用流式细胞术法来替代3H-TdR掺入法的数据依据.方法:用3H-TdR掺入法和流式细胞术法对细胞DNA合成和有丝分裂进行检测.结果:流式细胞仪指标与3H-TdR掺入实验指标呈高度的正相关关系,相关系数分别为:PI与cpm相关系数为r=0.964;SPF与3H-TdR,掺入的相关悉数r=0.876,且经检验有统计学意义(P＜0.01).结论:主动脉平滑肌细胞增殖指数、S期细胞分数与3H-TdR掺入值密切相关.     

环巴胺对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞增殖凋亡的影响及其抗凋亡机制

目的：研究Hedgehog( Hh)信号通路阻断剂环巴胺对佐剂性关节炎(AIA)大鼠关节软骨细胞增殖凋亡的影响及抗凋亡机制。方法弗氏完全佐剂诱导AIA大鼠模型,胰酶-胶原酶法分离培养关节软骨细胞,环巴胺体外给药处理AIA软骨细胞,MTT法检测细胞增殖,DNA电泳、Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡, RT-PCR 检测Shh、Gli1、Ptch1、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA 的表达。结果环巴胺(0.08、0.4、2、10、50μmol/L)剂量依赖性地提高AIA软骨细胞增殖。 AIA组可见凋亡细胞DNA梯状条带,环巴胺(0.4、2、10μmol/L)给药组的梯状条带明显减少;AIA组存在核碎裂与染色质固缩,环巴胺给药组均匀蓝色荧光的细胞数量增多;流式分析结果表明AIA软骨细胞凋亡率显著升高,环巴胺明显减少细胞凋亡率;与正常组相比, AIA组软骨细胞中Hh信号通路相关基因( Shh、Ptch1、Gli1) mRNA表达显著升高,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达显著下降,而促凋亡基因Bax、Caspase-3 mRNA表达明显升高。环巴胺体外给药能抑制Hh信号通路过度活化,提高Bcl-2 mR-NA表达,并降低Bax、Caspase-3 mRNA表达。结论环巴胺体外给药能促进AIA软骨细胞的增殖,并抑制AIA软骨细胞的过度凋亡;该抗凋亡作用和调节Bcl-2、Bax和Caspase-3表达密切相关,提示干预软骨细胞Hh信号通路对保护类风湿关节炎关节软骨具有潜在的治疗意义。     

人骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞过程中免疫原性改变的实验研究

目的 探讨人骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）诱导分化成软骨细胞过程中协同刺激分子的表达及其对细胞免疫原性改变的影响。方法 用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养BMSCs,经形态学观察、流式细胞仪鉴定后诱导成软骨样细胞,用流式检测细胞表面协同刺激分子的表达情况;将未分化的BMSCs及诱导后的成软骨样细胞分别与T细胞共培养,采用3H-TdR法检测T细胞的增殖情况。结果 人BMSCs不表达或低表达协同刺激分子CD28、CD80、CD83、CD86,抑制T细胞增殖;而诱导后的成软骨细胞上调表达CD28、CD80、CD83、CD86,并促进T细胞增殖。结论 人BMSCs对T细胞增殖有抑制作用;而诱导后的成软骨细胞免疫原性增强,促进T细胞增殖。     

Canstatin基因表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建可表达人血管生成抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,探索canstatin对人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)和人肺腺癌A5 49细胞株的生物学效应。方法　RT PCR法从胎儿肝组织中获取canstatincDNA全长 ,并将其克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上。阳离子脂质体介导该重组载体转染HUVE细胞系、A5 49细胞株。RT PCR法检测其对canstatinmRNA的表达。台盼蓝拒染法活细胞记数 ,3 H TdR掺入法检测细胞增殖 ,TUNEL法检测细胞凋亡 ,流式细胞术检测细胞周期。结果　成功构建pCMV Script Cans真核表达重组载体 ,并在转染该表达载体的A5 49及HUV EC C细胞株中均检测到canstatinmRNA的表达。HUV EC C细胞株pCMV Script Cans载体转染组比空载体组 3 H TdR掺入量明显减低(P <0 0 1) ,细胞凋亡率明显增加 (P <0 0 1) ,A5 49细胞株转染组与空载体组 3 H TdR掺入量无显著差异 (P >0 0 5 ) ,细胞凋亡率无显著差别 (P >0 0 5 )。结论　pCMV Script Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达canstatin ,并抑制内皮细胞增殖 ,诱导内皮细胞凋亡 ,但对肿瘤细胞没有直接抑制作用。     

两种自制支架材料对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响

目的 评定两种自制支架材料DL－聚乳酸支架，聚磷酸钙纤维对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响。方法 采用材料样品与体外单层培养关节软骨细胞直接接触法，并对其进行倒置显微镜观察，培养细胞计数与DAN含量及其细胞外基质^35S掺入量和羟脯氨酸含量测定。结果 两种支架材料可与培养关节软骨细胞完全相容，无关节软骨细胞毒性；对培养关节软骨细胞的DNA，蛋白多糖及胶原合成无异常影响。结论 两种支架材料具有良好的关节软骨细胞相容性，对其功能物质的合成无异常影响，经其结构与性能优化，即可满足关节软骨组织工程制备的各项要求。     

压力对体外培养髁突软骨细胞增殖、凋亡的影响

[目的]观察压力对体外培养SD大鼠髁突软骨细胞增殖、凋亡以及合成蛋白多糖的影响,探讨压力与软骨退变之间的相互关系.[方法]在一个大气压基础上,分别对3组体外培养髁突细胞进行加压-10kPa、10kPa,20kPa(5%CO2),以未加压组作为对照,用四唑盐法(MTT法)和流式细胞技术分别检测各组标本在加压3 h和加压24 h后细胞增殖、凋亡的情况;应用硫酸-咔唑法检测各组标本在加压3 h和加压24 h后蛋白多糖的含量.[结果]加压3 h后,各加压组与对照组相比,细胞的增殖、凋亡以及蛋白多糖含量无明显变化;加压24 h后,压力值为20kPa时可以明显拟制增殖,并诱导髁突软骨细胞发生凋亡增加,蛋白多糖含量明显减少.[结论]长时间的异常压力负荷可使髁突软骨细胞增殖减缓、凋亡增加,蛋白多糖含量减少,诱发或加重关节软骨退变.     

人骨关节炎软骨细胞的体外培养

目的:对人骨关节炎软骨细胞的分离、消化和培养进行初步研究,并就其生物学活性同人正常软骨细胞进行比较和评价。方法:以含血清培养液配制的0.05%和0.2%Ⅱ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长、增殖和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化,以及用流式细胞仪检测有或无IL-1β诱导的细胞凋亡和周期变化。结果:①消化后骨关节炎组原代细胞活力平均为82%,少于正常组的95%(P<0.01)。②MTT检测骨关节炎组细胞增殖低于正常组(P<0.01),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O异染反应均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③骨关节炎组细胞凋亡率为6.9%,而正常组为0.5%,IL-1β诱导后凋亡率增加了27.4%,正常组只有12.7%。结论:酶二步消化法具有较高细胞存活率、低污染率和操作简便等特点,分离培养的骨关节炎软骨细胞符合人患骨关节炎时软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

In vitro effects of sodium hyaluronate on the proliferation and the apoptosis in chondrocytes from patients with Kashin-Beck disease and osteoarthritis

Objective:To identify the in vitro effects of sodium hyaluronate(HA) on the proliferation and the apoptosis of chondrocytes from patients with Kashin-Beck disease(KBD) and osteoarthritis(OA). Methods:Samples of articular cartilages from KBD and OA patients, as well as healthy volunteers(6 subjects in each of the 3 groups) were dissected, digested with collagenase and the cells cultured in monolayers. Chondrocytes from each sample were assigned to an untreated group and two HA-treated groups: H0(no HA), H100(HA, 0.1 g/L) and H500(HA, 0.5 g/L). The first passage chondrocytes were used to observe proliferation using the MTT assay, and apoptosis by flow cytometry through Annexin V/PI staining. Results:HA promoted proliferation of chondrocytes in all the three groups, and in KBD and OA groups, for cells cultured for 4 and 6 days, H500 significantly promoted the cell proliferation. The apoptotic rates of both KBD and OA group chondrocytes were in the order H500 < HA100 < H0. Conclusion:Sodium hyaluronate administration has a dose-dependendent vitro effect to promote proliferation and inhibit apoptosis of chondrocytes from patients with KBD and OA.     

趋化素样因子1(CKLF1)对关节软骨细胞增殖及代谢的影响

目的：研究趋化素样因子1(CKLF1)对兔关节软骨细胞增殖及代谢的调节作用。方法：采用体外细胞培养技术及同位素参入法，检测CKLF1真核表达载体转染293T细胞所得条件培养基对软骨细胞DNA、胶原及蛋白多糖合成能力的影响。结果：在含5％(体积分数)胎牛血清(FCS)的DMEM培养条件下，转染后293T细胞表达的CKLFl可抑制兔关节软骨细胞DNA、胶原及蛋白多糖的合成，并可促进诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的转录。结论：CKLF1可能通过提高iNOS的表达抑制关节软骨细胞增殖、胶原及蛋白多糖的合成。