高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨高浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含60、120 mmol/L葡萄糖的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含120 mmol/L甘露醇的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cad-herin、α-SMA、Collagen I mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果高浓度葡萄糖(60、120 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表达水平显著增加(P0.05);大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cad-herin蛋白表达水平显著下降(P0.05)。结论高浓度葡萄糖能上调α-SMA、Collagen I表达和下调E-cadherin表达,高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨晚期糖基化终产物对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含40 mmol/L晚期糖基化终产物(AGEs)、80 mmol/L AGEs的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含80 mmol/LBSA的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA的表达;应用Western blot检测E-cadher-in、α-SMA蛋白的表达;应用ELISA法检测间皮细胞TGF-β1、VEGF蛋白表达水平。结果①AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;②AGEs(40 mmol/L、80mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA和α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达水平显著增加(P<0.05);③AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论 AGEs能上调α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF表达和下调E-cadherin表达,AGEs诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

microRNA-192在晚期糖基化终产物诱导人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化中的作用

目的探讨microRNA-192(miR-192)对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的调控作用。方法人腹膜间皮细胞、转染miR-192抑制物后人腹膜间皮细胞和转染miR-192抑制物阴性对照的人腹膜间皮细胞在含AGEs的培养基培养72 h,以M199培养基和含80 m M BSA的M199培养基为对照,然后运用实时荧光定量PCR法检测miR-192和mRNA的表达情况,运用蛋白质印迹法检测蛋白的表达情况。结果在AGEs刺激后,人腹膜间皮细胞miR-192、胶原蛋白I(Collagen I)mRNA、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白表达水平显著上升(P0.05),而E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA和蛋白表达水平显著下降(P0.05)。与转染miR-192抑制物阴性对照的人腹膜间皮细胞相比,转染miR-192抑制物的人腹膜间皮细胞miR-192、Collagen I mRNA、α-SMAmRNA和蛋白表达水平显著下降(P0.05),而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平显著上升(P0.05)。结论 AGEs可能通过上调miR-192表达诱导人腹膜间皮细胞EMT。miR-192抑物可能通过下调miR-192表达阻止AGEs诱导人腹膜间皮细胞EMT。miR-192在AGEs诱导人腹膜间皮细胞EMT中起重要调控作用。     

骨形成蛋白-7对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响

目的探讨骨形成蛋白-7(BMP-7)对晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响。方法晚期糖基化终产物诱导发生上皮-间叶转化的体外培养大鼠腹膜间皮细胞,分别经含5 ng/mL及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基和含10 ng/mL BMP-7及80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基培养48 h,以含80 mmol/L晚期糖基化终产物的M199培养基为对照,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cadherin、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Collagen I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;应用ELISA法检测间皮细胞TGF-β1、VEGF蛋白表达水平。结果 BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。BMP-7作用后,上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGFmRNA和α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论 BMP-7能上调上皮-间叶转化的大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin表达和下调α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF表达,BMP-7能逆转晚期糖基化终产物诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

血红素加氧酶-1对高糖诱导大鼠腹膜间皮细胞转化生长因子β1和纤维连接蛋白表达的影响

目的研究血红素加氧酶-1（HO-1）对高糖作用下体外培养的大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转化生长因子β1（TGF-β1）和纤维连接蛋白（FN）表达的影响。方法将原代培养的第3代RPMC随机分为对照组、高糖组、钴原卟啉（CoPP）＋高糖组和CoPP组。同步培养72h后,以反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组细胞TGF-β1和FNmRNA表达情况;酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞上清液中TGF-β1和FN的蛋白质水平。结果高糖组、CoPP＋高糖组和CoPP组的HO-1mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组,其中CoPP＋高糖组显著高于高糖组;高糖组和CoPP＋高糖组的FNmRNA及蛋白表达水平显著高于对照组及CoPP组;高糖组、CoPP＋高糖组TGF-β1mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组及CoPP组,其中CoPP＋高糖组显著低于高糖组。结论 HO-1可抑制高糖诱导的RPMCTGF-β1和FN的表达,具有抗腹膜纤维化的作用。     

葡萄糖腹膜透析液诱导间皮细胞凋亡的体外研究

[目的]了解葡萄糖腹膜透析液(PDS)对体外培养人腹膜间皮细胞凋亡的影响.[方法]通过向培养液中添加1.5%葡萄糖腹膜透析液,观察细胞caspase-3活性变化,应用Annexin V/PI双染色流式细胞仪方法以及TUNEL方法观察腹膜间皮细胞凋亡的情况.[结果]PDS组细胞caspase-3活性较对照组明显上升Annexin V-FITC/PI双标记结果显示PDS组细胞凋亡率为(46.8士14.2)%,显著高于对照组的(9.04士4.86)%(P＜0.05).TUNEL结果显示PDS组细胞凋亡明显高于对照组.[结论]葡萄糖腹膜透析液可以明显诱导腹膜间皮细胞细胞凋亡的发生.     

非编码RNA在腹膜间皮细胞上皮间质转化中的研究进展

腹膜纤维化是患者退出腹膜透析的主要原因,其关键步骤是腹膜间皮细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)。越来越多的证据表明非编码RNA在腹膜间皮细胞EMT过程中有重要调控的作用。本文对非编码RNA在腹膜间皮细胞EMT中的研究发现进行综述,总结micro RNA和lnc RNA作为腹膜纤维化的诊断预测和治疗靶点的最新进展。     

糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间充质转化的机制研究进展

糖尿病肾病(DN)发生肾纤维化是导致终末期肾脏病(ESRD)的关键原因。肾小管上皮细胞(RTEC)上皮-间充质转化(EMT)参与了DN肾组织纤维化的发生和发展。目前DN中EMT的发病机制仍不完全清楚,尚需进一步探索。本文将对DN中参与RTEC的EMT的多重机制做一综述,以期为通过抑制小管上皮细胞(TEC)的EMT治疗DN提供思路。     

灯盏花素对腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞转化生长因子β1的影响

背景：从不同层面了解灯盏花素阻止/延缓腹膜功能衰竭的作用及其机制,从而在临床上推广使用灯盏花素来阻止/延缓腹膜功能衰竭从而延长终末期肾脏病患者腹膜透析时间、提高透析质量、减少透析失败率,提高腹膜透析远期疗效具有广泛的应用前景。目的：观察灯盏花素对腹膜透析液诱导的人腹膜间皮细胞转化生长因子β1分泌及其增殖活性的影响。方法：体外培养人腹膜间皮细胞,分为5组：分别为对照组、腹膜透析液组、灯盏花素终浓度为5,10,20μmol/L组。检测各组上清液中转化生长因子β1的水平以及间皮细胞的增殖活性。结果与结论：腹膜间皮细胞在腹膜透析液诱导下,转化生长因子β1分泌显著增加、细胞增殖活性显著降低。灯盏花素5μmol/L组转化生长因子β1分泌低于腹膜透析液组（P〈0.05）,细胞增殖活性高于腹膜透析液组（P〈0.05）;灯盏花素10,20μmol/L组转化生长因子β1分泌显著低于腹膜透析液组（P〈0.01）,细胞增殖活性显著高于腹膜透析液组（P〈0.01）。结果显示灯盏花素可以抑制腹膜间皮细胞转化生长因子β1分泌,拮抗腹膜透析液对腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用。     

钙敏感受体逆转子宫内膜癌细胞上皮-间充质转化

目的:探讨钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)在缺氧环境下对子宫内膜癌细胞发生上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)的影响。方法:将子宫内膜癌Ishikawa细胞分别转染相应腺病毒,并分为空白组、空载组、沉默CaSR组和过表达CaSR组。将各组细胞进行缺氧后细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)法观察细胞骨架的变化;蛋白质印迹法及IF法检测钙黏附蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、CaSR蛋白表达变化;荧光染料Fura-2/AM示踪监测细胞内钙离子的浓度变化;Transwell迁移试验检测细胞侵袭迁移能力变化。结果:缺氧后,子宫内膜癌细胞的细胞骨架呈梭形样改变;同时E-cadherin表达降低,Vimentin和CaSR表达增加;子宫内膜癌细胞转染沉默及过表达CaSR腺病毒后细胞内钙离子内流分别减少及增加,而与Vimentin表达和细胞侵袭迁移能力呈负相关。结论:缺氧后子宫内膜癌细胞发生EMT及CaSR表达增加,而CaSR的表达增加抑制EMT发生,其机制可能与调控细胞钙离子有关。     

Influence of bicarbonate/low-GDP peritoneal dialysis fluid (BicaVera) on in vitro and ex vivo epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells

♦ Background: Peritoneal membrane damage induced by peritoneal dialysis (PD) is largely associated with epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of mesothelial cells (MCs), which is believed to be a result mainly of the glucose degradation products (GDPs) present in PD solutions.♦ Objectives: This study investigated the impact of bicarbonate-buffered, low-GDP PD solution (BicaVera: Fresenius Medical Care, Bad Homburg, Germany) on EMT of MCs in vitro and ex vivo.♦ Methods: In vitro studies: Omentum-derived MCs were incubated with lactate-buffered standard PD fluid or BicaVera fluid diluted 1:1 with culture medium.Ex vivo studies: From 31 patients randomly distributed to either standard or BicaVera solution and followed for 24 months, effluents were collected every 6 months for determination of EMT markers in effluent MCs.♦ Results: Culturing of MCs with standard fluid in vitro resulted in morphology change to a non-epithelioid shape, with downregulation of E-cadherin (indicative of EMT) and strong induction of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression. By contrast, in vitro exposure of MCs to bicarbonate/low-GDP solution had less impact on both EMT parameters.Ex vivo studies partially confirmed the foregoing results. The BicaVera group, with a higher prevalence of the non-epithelioid MC phenotype at baseline (for unknown reasons), showed a clear and significant trend to gain and maintain an epithelioid phenotype at medium- and longer-term and to show fewer fibrogenic characteristics. By contrast, the standard solution group demonstrated a progressive and significantly higher presence of the non-epithelioid phenotype. Compared with effluent MCs having an epithelioid phenotype, MCs with non-epithelioid morphology showed significantly lower levels of E-cadherin and greater levels of fibronectin and VEGF. In comparing the BicaVera and standard solution groups, MCs from the standard solution group showed significantly higher secretion of interleukin 8 and lower secretion of collagen I, but no differences in the levels of other EMT-associated molecules, including fibronectin, VEGF, E-cadherin, and transforming growth factor β1.Peritonitis incidence was similar in both groups. Functionally, the use of BicaVera fluid was associated with higher transport of small molecules and lower ultrafiltration capacity.♦ Conclusions: Effluent MCs grown ex vivo from patients treated with bicarbonate/low-GDP BicaVera fluid showed a trend to acquire an epithelial phenotype, with lower production of proinflammatory cytokines and chemokines (such as interleukin 8) than was seen with MCs from patients treated with a lactate-buffered standard PD solution.     

蛋白激酶C对高糖作用下腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1调节作用

目的观察蛋白激酶C(PKC)对高糖作用下体外培养的大鼠腹膜间皮细胞(PMCs)胞膜上葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)表达的调节,以探讨长期腹膜透析时如何避免腹膜损伤、改善腹膜透析疗效。方法胰酶消化法提取雄性Wistar大鼠的PMCs细胞进行培养,分别加入不同浓度葡萄糖及PKC抑制剂Go6976,间接免疫荧光法检测PMCs上GLUT1表达,流式细胞仪检测作用前后细胞膜上GLUT1量的改变,生化分析仪检测培养液内葡萄糖浓度的变化。结果高糖可增加细胞膜上GLUT1的表达,同时伴有PMCs对葡萄糖的转运增加(P0.05)。Go6976明显抑制了高糖对GLUT1的诱导,且葡萄糖的转运亦下降。结论葡萄糖以浓度依赖方式上调PMCs细胞膜上GLUT1的蛋白表达,同时伴有PMCs对葡萄糖转运的增加。PKC通路在其中发挥重要作用,应用PKC抑制剂可拮抗高糖对GLUT1表达的诱导作用。     

高糖、尿毒症血清对人腹膜间皮细胞VEGF表达的影响

目的高糖、尿毒症血清对人腹膜间皮细胞VEGF表达的影响。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化方法来观察高糖、尿毒症血清对人腹膜间皮细胞VEGF表达的影响。结果高糖、尿毒症血清组VEGF表达明显高于正常对照组。结论高糖、尿毒症血清可促进人腹膜间皮细胞VEGF的表达,可能导致腹膜新生血管的形成,从而引起腹膜超滤衰竭。     

锌离子对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞凋亡的影响及机制

目的 研究锌离子对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）凋亡的影响及机制的探索,从而为锌离子在腹膜透析中的应用提供实验基础.方法 胰蛋白酶消化法培养原代大鼠腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：①对照组;②LPS组;③ZnSO4组;④ZnSO4/LPS组.应用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测RPMC凋亡率,并采用Westen Blot方法检测细胞外信号调节激酶（P-ERK）,BAX,凋亡诱导因子（AIF）,天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶3（caspase3）,天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶9 （caspase9）蛋白表达.应用流式细胞术,采用活性氧自由基（ROS）检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况.结果 与对照组相比,LPS组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白（BAX,AIF,caspase3,caspase9）表达升高（P＜0.01）.与LPS组相比,ZnSO4作用组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白表达明显降低（P＜0.01）.LPS组ROS显著高于对照组而ZnSO4作用组ROS显著低于LPS组（P＜0.01,P＜0.01）.与LPS组相比,ZnSO4作用组P-ERK的表达明显升高（P＜0.01）.结论 ZnSO4可能可以逆转LPS所致的RPMC凋亡,对腹膜透析相关腹膜炎过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过ERK通路而发挥作用.     

胰岛素对人腹膜间皮细胞增殖、损伤及凋亡的影响

目的明确胰岛素是否对人腹膜间皮细胞具有毒性或者保护作用。方法使用人腹膜间皮细胞细胞株，传代培养。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定HPMC的增殖程度。采用全自动生化分析仪测定培养液中乳酸脱氢酶LDH水平示细胞损伤，Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态学变化及计算凋亡细胞百分比。分为单纯培养基对照组，4．25％葡萄糖组，不同浓度胰岛素组和不同浓度的胰岛素加4．25％葡萄糖组。结果与对照组相比，4．25％葡萄糖致LDH水平明显增高，并显著降低NIT渗入量，明显增加凋亡细胞百分比；不同浓度的胰岛素对HPMC增殖无影响，不同浓度胰岛素24h后可明显升高LDH水平(P＜0．05)，不同浓度胰岛素作用12h均后导致凋亡细胞百分比显著升高(P＜0．05)；不同浓度葡萄糖胰岛素组12h、24hMMT渗入量较葡萄糖组明显升高(P＜0．05)，组间差异无显著性(P＞0．05)，浓度大于25U／L胰岛素加葡萄糖组作用24h后与葡萄糖组相比显著降低LDH水平(P＜0．05)；不同浓度胰岛素加葡萄糖组作用12h后与葡萄糖组相比凋亡细胞百分比明显下降(P＜0．05)。结论胰岛素能导致HPMC损伤、诱导凋亡，同时在一定范围内可缓解高糖对HPMC的毒性作用。     

肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞的增殖及其表达白细胞介素-1中的作用

目的 初步观察肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞(Rat pcritoneal mesothelial cells，BPMC)细胞增殖及其表达白细胞介素—1(Interleukin-1,IL-1)中的作用，从而为持续性非卧床腹膜透析(Continuous ambulatory pcritoncal dialysis，CAPD)中肝素的临床应用打下一定的理论基础。方法 建立BPMC的体外培养；并用四四氮唑蓝(MTT)细胞增殖实验和酶联免疫吸附方法(ELISA)，来分析肝素对高糖(3．86％葡萄糖)影响RPMC增殖及其分泌IL—1的作用。结果 3．86％葡萄糖能显抑制BPMC的增殖，而1．25U／ml肝素能部分逆转高糖对RPMC增殖的抑制作用(P＜0．01)；3．86％葡萄糖能显增加BPMC表达IL—1β，而1．25U／ml肝素能部分减少高糖增加BPMC表达IL-1β的作用(P＜0．01)。结论 本结果提示，肝素可能通过逆转高糖对BPMC的增殖抑制作用及减少高糖增加RPMC表达促炎细胞因子IL—1的作用，而延续CAPD相关性腹膜纤维化的发生，最终有益于CAPD进行。