大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及相关调控蛋白Caspase-3表达的时空分布

目的 观察大鼠脊髓损伤（SCI）后神经元细胞凋亡和相关调控蛋白Caspase-3表达的时间、空间分布规律。方法 SD大鼠50只,分为假手术组和SCI组,钳夹法建立SCI模型,用结晶紫（CV）染色法、TUNEL法和免疫组织化学方法观察SCI后6h、12h、24h、3d和7d损伤中心到头端0～5.00mm空间范围内脊髓神经细胞存活、凋亡以及相关调控蛋白Caspase-3的表达状况。 结果 CV染色发现,SCI后6h～7d在0～0.50mm空间范围内均未发现存活的神经细胞,在1.00～3.50mm距离内,存活的神经细胞数逐渐增加,4.00mm处达峰值;TUNEL结果发现,SCI后6h～7d在1.05～4.55mm范围内,神经细胞出现凋亡,3d时在2.55mm处,细胞凋亡达高峰,7d时显著减少;免疫组织化学结果发现,SCI后6h～7d在1.10～4.60mm范围内,神经元细胞出现Caspase-3阳性表达,3d在3.10mm处Caspase-3表达达到高峰,7d显著减少。 结论 SCI后,凋亡的神经细胞及其相关调控蛋白Caspase-3的表达有一定的时空分布规律。     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Caspase-1、Caspase-3的表达

目的观察大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Caspase-1、Caspase-3的表达。方法 48只成年健康Wistar大鼠,采用Naslund腹主动脉阻断法制作脊髓缺血再灌注损伤模型。随机分为空白对照组(n=6)、假手术组(n=6)和损伤组(n=36),观察脊髓缺血再灌注损伤后,脊髓的病理变化、细胞凋亡及Caspase-1、Caspase-3的表达变化的规律。结果观察脊髓缺血再灌注损伤后Caspase-1阳性细胞在损伤后12h表达明显,1d损伤区域及周边出现表达高峰。Caspase-3阳性细胞在损伤后12h表达明显,2d损伤区域及周边出现表达高峰。TUNEL阳性细胞也在脊髓损伤后12h表达明显,2d出现表达高峰。空白对照组、假手术组:Caspase-1、Caspase-3免疫组化少有表达,少见TUNEL阳性细胞。结论脊髓缺血再灌注损伤后存在神经细胞凋亡,Caspase-1、Caspase-3均参与损伤的调节。     

BYHWD对脊髓损伤大鼠脊髓组织Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察补阳还五汤(buyanghuanwu decoction,BYHWD)对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)模型大鼠脊髓神经细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表达的影响,初步探讨BYHWD抑制脊髓神经细胞凋亡的作用机制。方法:Wistar大鼠40只,随机分为四组:正常对照组、SCI模型组、BYHWD组和甲基强的松龙(MP)注射组,每组10只大鼠;后三组动物先建立SCI损伤模型,然后分别给予BYHWD组和MP组BYHWD和MP治疗。四组动物分别于术后1、7、14、21 d和28 d对大鼠后肢神经功能的恢复情况进行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)功能评分。第28 d处死各组大鼠,采用Real-time PCR法检测脊髓组织Bcl-2和Bax mRNA的表达情况,Western Blot法检测脊髓组织Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果:大鼠麻醉清醒后,SCI组大鼠损伤平面以下完全瘫痪。BBB评分结果显示:术后第7 d~28 d,与正常对照组相比,SCI组BBB评分明显降低(P0.05);与SCI组相比,BYHWD处理组和MP处理组大鼠BBB评分明显增高(P0.05),但BYHWD处理组和MP处理组大鼠相比,BBB评分无明显差异(P0.05)。Real-time PCR和Western Blot结果显示:与正常对照组相比,SCI组Bax蛋白及mRNA的表达明显升高(P0.05),而Bcl-2蛋白及mRNA的表达则明显有所降低(P0.05)。与SCI组相比,BYHWD处理组和MP处理组大鼠脊髓组织Bax蛋白及mRNA表达明显降低(P0.05),而Bcl-2蛋白及mRNA表达则明显有所升高(P0.05)。但BYHWD处理组和MP处理组大鼠脊髓组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达之间无明显差异(P0.05)。结论:BYHWD可以改善SCI大鼠后肢的运动功能,通过下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,从而抑制SCI大鼠脊髓神经细胞的凋亡,发挥其保护作用。     

依达拉奉联合甲强龙对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

目的探讨依达拉奉与甲强龙联合应用对大鼠急性脊髓损伤神经组织的保护作用。方法选取120只成年SD大鼠,随机分为5组(每组24只):假手术组、急性脊髓损伤组、依达拉奉治疗组(0.3mg/100g)、甲强龙治疗组(3mg/100g)和联合治疗组(依达拉奉0.3mg/100g+甲强龙1.5mg/100g)。采用改良Allen法制作大鼠T10节段急性脊髓损伤模型。应用后肢运动学评分标准(BBB评分)分别于术后1、2、7和14d对各组大鼠进行评分;采用TUNEL法检测各组脊髓损伤组织中神经细胞凋亡率的变化,Western blot法检测各组脊髓损伤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达水平变化。结果药物治疗各组大鼠的BBB评分均明显高于脊髓损伤组,且脊髓损伤组织中神经细胞的凋亡率以及Bax和Caspase-3的蛋白表达水平均显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平显著增高(P0.05);联合治疗组大鼠的BBB评分明显高于依达拉奉或甲强龙单独治疗组,且脊髓损伤组织中神经细胞的凋亡率以及Bax和Caspase-3的蛋白表达水平均显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平显著增高(P0.05)。结论依达拉奉联合甲强龙抑制大鼠急性脊髓损伤后神经细胞发生凋亡,发挥神经保护作用,同时能够减少甲强龙的使用剂量。     

p38有丝分裂原激酶活化参与继发性脊髓损伤后神经细胞凋亡的实验研究

探索脊髓损伤(SCI)后p38有丝分裂原激酶(p38MAPK)的表达及其与神经细胞凋亡的关系。采用Allen’s法建立大鼠急性SCI动物模型,用蛋白印迹法和免疫组织化学染色方法检测SCI后p38MAPK和caspase-3表达的变化;采用实时定量PCR法检测SCI后caspase-3 mRNA的表达;用原位末端标记法(TUNEL)检测SCI后神经细胞凋亡。结果表明SCI后总p38MAPK表达无变化,但p38MAPK磷酸化明显增多,于伤后6h达高峰;伤后24hcaspase-3表达明显增加。TUNEL检测显示,伤后6h受损伤的脊髓组织有少许凋亡细胞出现,24h细胞凋亡最明显。鞘内注射p38MAPK抑制剂SB203580,明显减少caspase-3的表达,并减少细胞凋亡。以上结果显示SCI后损伤局部p38MAPK激活诱导了caspase-3基因表达,导致神经细胞凋亡;抑制p38MAPK可以阻止SCI后继发的神经细胞凋亡。     

LY-294002对大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3表达的影响

目的研究LY-294002对急性脊髓损伤大鼠Caspase-3表达的变化。方法选取104只成年健康SD大鼠,按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8～9)急性压迫损伤模型,按随机数字表法分为假手术组8只、损伤组48只、LY-294002组48只。免疫组化和Western blot方法检测各组大鼠脊髓损伤部位Caspase-3的表达。结果免疫组化结果发现假手术组大鼠脊髓神经细胞中Caspase-3阳性细胞较少;在脊髓损伤后8 h时,Caspase-3阳性细胞数明显增多,3 d达高峰,7 d表达开始减弱。在经LY-294002处理后的各时间点大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3阳性细胞明显少于相同时间点的脊髓损伤组大鼠。Western blot方法发现假手术组大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3的表达量很少,而在脊髓损伤后8h时,Caspase-3蛋白表达量明显增多,3 d达高峰,7 d表达开始减弱,在经LY-294002处理后的各时间点大鼠脊髓损伤部位的Caspase-3蛋白表达则明显少于相同时间点的脊髓损伤组大鼠,与免疫组化结果一致。结论LY-294002能够下调急性脊髓损伤大鼠Caspase-3蛋白的表达。     

体外原代培养大鼠胚胎脊髓神经细胞机械损伤后的凋亡与caspase-3的表达

为了研究体外培养大鼠胚胎脊髓神经细胞损伤前后的凋亡变化及caspase-3的表达情况,本实验建立了一个模拟脊髓横断损伤后脊髓组分-原代培养的脊髓神经细胞机械损伤模型,并用Hoechst33342/PI双染法检测脊髓神经细胞的凋亡变化,用免疫荧光染色方法检测caspase-3的表达。结果显示:(1)损伤前几乎未见凋亡的神经细胞,损伤后6 h凋亡细胞开始出现,损伤后12 h明显增多,1 d时达高峰,但损伤后3 d凋亡细胞开始呈明显下降的趋势,至损伤后7 d又开始增加,一直持续到损伤后14d;(2)相应时刻caspase-3表达趋势的改变与脊髓神经细胞凋亡趋势的变化基本相同;(3)经过caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO干预后,凋亡细胞的数量与caspase-3的表达均减少,并呈剂量依赖性。以上结果提示,机械损伤可以诱发体外培养的脊髓神经细胞凋亡,且此凋亡的发生可能与caspase-3的表达有关。     

乙酰左旋肉碱对大鼠脊髓损伤的保护作用

目的:研究乙酰左旋肉碱(Acetyl-1-carnitine,ALC)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用,并探讨其作用机制。方法:成年雄性SD大鼠36只,体重200~250 g,随机分为三组:假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、乙酰左旋肉碱组(ALC组)每组12只。Sham组只暴露脊髓,不打击;SCI组采用Allen's重物打击法制备脊髓损伤模型;ALC组在打击脊髓后15 min腹腔注射剂量为300 mg/kg的乙酰左旋肉碱。Sham组和SCI组均腹腔注射相同体积的生理盐水。24 h后取出各组大鼠脊髓组织进行检测。用分光光度法检测各组脊髓组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,用Western Blot检测凋亡蛋白caspase-3的表达量,用TUNEL法观测神经细胞的凋亡状况。结果:与Sham组相比,SCI组脊髓组织中MDA含量明显升高,SOD活性明显降低,凋亡蛋白caspase-3表达量明显增加,神经细胞的凋亡比例明显增加(P0.01);与SCI组相比,ALC组脊髓组织中MDA含量明显降低,SOD活性明显增加,凋亡蛋白caspase-3表达量明显降低,神经细胞的凋亡比例明显减少(P0.01)。结论:乙酰左旋肉碱可以减轻氧化损伤,抑制神经细胞凋亡,对脊髓损伤有保护作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对脊髓损伤(SCI)大鼠神经元凋亡和凋亡调控蛋白Caspase-3时间、空间表达的影响,探讨其脊髓损伤保护机制。方法 SD大鼠75只,分为假手术组、SCI组、EGCG组(n=25只);钳夹法制作脊髓损伤模型,EGCG组和SCI组损伤后即刻和1h后腹腔注射EGCG(50 mg/kg)和等量生理盐水;用结晶紫(CV)染色法、TUNEL和免疫组织化学方法,观察SCI后6h、12h、24h、3d和7d时间范围内,从损伤中心到头端0~5.00mm空间范围内,EGCG对脊髓神经元存活、凋亡以及相关调控蛋白Caspase-3表达的影响。结果 CV染色发现,SCI后6h~7d,在0~0.50mm空间范围内均未发现存活的神经元,在1.00~4.60mm范围内,EGCG和SCI组相比存活的神经元数明显增加(P0.01);TUNEL结果发现,SCI后6h~7d,在1.05~3.05mm范围内,EGCG与SCI组相比凋亡神经元数明显减少(P0.01);免疫组织化学发现,SCI后6h~7d,在1.10~3.10mm范围内,EGCG与SCI组相比Caspase-3阳性表达的神经元数明显减少(P0.01)。结论 EGCG在一定时间、空间范围内能下调Caspase-3表达,减少神经元凋亡,对继发性SCI有拮抗作用。     

酮体代谢对大鼠急性脊髓损伤神经保护作用的实验研究

目的已有研究证实脊髓损伤后的生酮饮食(ketogenic diet,KD)具有神经保护作用,本文进一步探讨损伤前酮体代谢对于大鼠急性颈脊髓挫伤的氧化应激和细胞凋亡的抑制作用。方法 48只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为KD组和标准饮食组(SD),喂养2周后检测血酮体含量。在电磁伺服材料试验机上行C5脊髓挫伤,其挫伤位移为1.5 mm,挫伤速度达500 mm/s。挫伤后3 h和24 h采集颈脊髓组织。采用免疫荧光双标检测与凋亡和炎症相关的Bax,caspase-3和Bcl-2,CD68等的蛋白表达,ELASA检测挫伤部位反映氧化应激程度的SOD和MDA含量。结果 KD组酮体水平为1.32 mmol/L,明显高于SD组(0.38 mmol/L)(P<0.05)。Bax,Bcl-2,caspase-3以及CD68的蛋白表达在损伤后均呈阳性,其中KD组表达量在两个时间点上均与SD组的差异有显著性(P<0.05)。KD组SOD值在损伤后3h高于SD组,且两组间差异在伤后24 h有显著性(540 pg/ml与281 pg/ml)(P<0.05)。MDA的变化趋势与SOD相反,伤后24 h KD组MDA值为509 pg/ml,明显低于SD组(855 pg/ml)(P<0.05)。结论本研究结果证明SCI前的高酮体水平减少了急性SCI的氧化应激程度、抑制细胞凋亡,为其在SCI神经保护作用提供了实验证据。     

17-β雌二醇提高巯醇抗氧化物(酶)治疗脊髓损伤的作用

目的探讨17-β雌二醇治疗脊髓损伤的分子机制,为临床应用雌激素治疗脊髓损伤提供理论依据。方法成年雄性SD大鼠180只,采用改良的Allen法构建大鼠急性脊髓挫伤模型后经17-β雌二醇治疗,采用化学比色法测定脊髓组织中丙二醛(MDA)和内源性巯醇抗氧化物(酶):还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;免疫组织化学分析凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达变化。结果17-β雌二醇治疗组与脊髓损伤组比较,BBB评分明显增加;在多个时间点MDA含量明显降低;巯醇抗氧化物(酶)GSH、SOD和GSH-Px含量显著增加;Caspase-3和Bax表达的阳性细胞数明显减少;Bcl-2表达的阳性细胞数明显增加(P0.05)。结论大剂量的17-β雌二醇治疗可能通过调控内源性巯醇抗氧化物(酶),提高肢体运动功能,抑制细胞凋亡,从而减轻脊髓损伤程度。     

17-β雌二醇提高巯醇抗氧化物（酶）治疗脊髓损伤的作用 

目的 探讨17-β雌二醇治疗脊髓损伤的分子机制,为临床应用雌激素治疗脊髓损伤提供理论依据。 方法 成年雄性SD大鼠180只,采用改良的Allen法构建大鼠急性脊髓挫伤模型后经17-β雌二醇治疗,采用化学比色法测定脊髓组织中丙二醛（MDA）和内源性巯醇抗氧化物（酶）：还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量;免疫组织化学分析凋亡相关因子Caspase-3、Bcl2和Bax蛋白的表达变化。 结果 17-β雌二醇治疗组与脊髓损伤组比较,BBB评分明显增加;在多个时间点MDA含量明显降低;巯醇抗氧化物（酶）GSH、SOD和GSH-Px含量显著增加;Caspase-3和Bax表达的阳性细胞数明显减少;Bcl2表达的阳性细胞数明显增加（P<0.05）。 结论 大剂量的17-β雌二醇治疗可能通过调控内源性巯醇抗氧化物（酶）,提高肢体运动功能,抑制细胞凋亡,从而减轻脊髓损伤程度。     

急性马尾神经压迫后脊髓前角运动神经元细胞凋亡相关蛋白的表达规律

BACKGROUND: Cauda equina syndrome often induces skin hypoesthesia in the perineal area, poor urine-stool control, and impairs male function. After peripheral nerve fiber injury, apoptosis of neurons appeared. This is associated with the nature of the injury, the types of neurons, the species of animals, the age, and the distance between neurons. OBJECTIVE: To explore the motor neuron apoptosis and expression of apoptosis-associated protein in the anterior horn of the spinal cord after acute cauda equina compression.  METHODS: A total of 27 canines were randomly divided into three groups. In the compression and control groups, models of cauda equina compression were established. In the normal group, no models were established. Compression group received water sac compression for 4, 8, 12, 24, 48, 72 and 168 hours, with three models in each group. In the control group, only water sac was implanted, but water was not injected. Terminal deoxynucleotidyl transferase TdT-mediated biotin dUTP nick end-labeling assay was used to detect the apoptosis of neurons in the anterior horn of the spinal cord. Bcl-2, Bax and Caspase-3 protein expressions were measured by immunohistochemical staining (strept avidin-biotin complex). Gray values of positive cells of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 protein expressions were detected using Qwin550Cw image collection and analysis system. RESULTS AND CONCLUSION: The apoptosis of motor neuron occurred in the compression groups. At 12 hours of compression, positive cells were detected, and the number of positive cells reached a peak at 72 hours. Bax and Bcl-2 protein expression was small in the normal group. Caspase-3 protein expression was not detected in the normal and control groups. Bax and Bcl-2 protein expression was significantly increased at 8 hours, peaked at 72 hours and reduced to a normal level at 168 hours. The increased range of Bax protein expression was bigger than that of Bcl-2. Caspase-3 protein began to express at 12 hours, peaked at 72 hours and reduced to a low level at 168 hours. Bax and Caspase-3 protein expression peaked at 72 hours, and Bcl-2 protein expression was not obviously increased. These findings verified that after acute cauda equina compression, the apoptosis of neurons occurred in the anterior horn of the spinal cord. Bax and Bcl-2 protein expression showed an antagonistic action. In the Bax/Bcl-2 complex, Bax protein in a high expression promoted apoptosis, induced Caspase-3 protein expression, and neuronal apoptosis.      

Endogenous neural stem cells in central canal of adult rats acquired limited ability to differentiate into neurons following mild spinal cord injury

Endogenous neural stem cells in central canal of adult mammalian spinal cord exhibit stem cell properties following injury. In the present study, the endogenous neural stem cells were labeled with Dil to track the differentiation of cells after mild spinal cord injury (SCI). Compared with 1 and 14 days post mild injury, the number of endogenous neural stem cells significantly increased at the injured site of spinal cord on 3 and 7 days post-injury. Dil-labeled βIII-tublin and GFAP expressing cells could be detected on 7 days post-injury, which indicated that the endogenous neural stem cells in central canal of spinal cord differentiated into different type of neural cells, but there were more differentiated astrocytes than the neurons after injury. Furthermore, after injury the expression of inhibitory Notch1 and Hes1 mRNA began to increase at 6 hours and was evident at 12 and 24 hours, which maintained high levels up to 7 days post-injury. These results indicated that a mild SCI in rat is sufficient to induce endogenous neural stem cells proliferation and differentiation. However, the ability to differentiate into neurons is limited, which may be, at least in part, due to high expression of inhibitory Notch1 and Hes1 genes after injury.     

Shh/Gli1信号参与小鼠脊髓损伤后血-脊髓屏障渗透性改变及运动功能恢复

目的:探讨sonic hedgehog/Gli1(Shh/Gli1)信号在小鼠脊髓损伤后病理变化及运动功能恢复中的作用。方法:成年雄性C57野生型、Gli1lz和Gli1lz/lz小鼠行T8节段脊髓夹伤及假手术。Gli1lz小鼠脊髓损伤及假手术后3 d行X-gal染色;7 d行Shh/PDGFr-α、Shh/GFAP、LacZ/GFAP染色,观察Shh/Gli1信号在小鼠脊髓损伤后的激活。C57野生型和Gli1lz/lz小鼠脊髓夹伤后7 d行GFAP染色和实时定量RT-PCR,观察星形胶质细胞反应;术后14 d尾静脉注射伊文氏兰观察血-脊髓屏障改变;术后1、3、5 d和7 d行BMS评分评价小鼠后肢运动功能。结果:脊髓损伤7 d后,损伤区Shh表达升高;Shh/Gli1信号报告基因LacZ表达升高,主要表达于反应性星形胶质细胞;免疫组织化学及实时定量RT-PCR结果显示Gli1基因敲除不影响脊髓损伤后GFAP表达;伊文氏兰染色及其定量分析显示Gli1lz/lz小鼠脊髓损伤后脊髓组织伊文氏兰外渗增加。BMS评分显示Gli1lz/lz小鼠运动功能恢复显著差于野生型小鼠。结论:Shh/Gli1信号在小鼠脊髓损伤后激活,可能参与脊髓损伤后血-脊髓屏障渗透性的改变,并影响脊髓损伤后的运动功能恢复。     

丙戊酸钠联合甲强龙对大鼠脊髓损伤的影响及其机制

目的:探讨丙戊酸钠(VAP)联合甲强龙(MP)在大鼠脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复中的作用及其机制。方法:选取8～10周龄雄性健康SD大鼠60只,按照数字表法随机分为假手术组、SCI组、VAP组、MP组和VAP+MP组,每组12只;各组大鼠再按照数字表法随机分为A组、B组2个亚组,每组6只。假手术组仅暴露脊髓、不做S...     

α-硫辛酸对大鼠全横断脊髓损伤后GAP-43和Caspase-3表达的影响

目的:研究α-硫辛酸对脊髓全横断损伤(SCI)大鼠损伤部位神经生长相关蛋白(GAP-43)、神经细胞凋亡相关蛋白(Caspase-3)的表达,探讨α-硫辛酸对大鼠脊髓全横断损伤功能恢复的作用。方法:制作并评价SD大鼠SCI模型后,64只大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组(SCI组)、SCI+游泳训练组(游泳组)和SCI+α-硫辛酸组(硫辛酸组)。各组按手术后7、14、21、28 d等4个时间点收集标本,每个时间点大鼠均为4只。各组大鼠进行BBB评分。各组4个时间点的GAP-43和Caspase-3表达用免疫组化测定,同时用Western Blot检测GAP-43表达。结果:游泳训练和用硫辛酸均能提高脊髓损伤大鼠的BBB评分(P0.05)。与SCI组比较,游泳组和硫辛酸组GAP-43表达显著增加,Caspase-3表达则明显降低(P0.05),且硫辛酸组比游泳组的GAP-43表达增加和Caspase-3表达降低更为明显(P0.05)。结论:游泳训练和α-硫辛酸可以上调脊髓损伤大鼠GAP-43表达和抑制Caspase-3表达促进损伤神经修复,对改善大鼠运动功能有一定疗效。