应用P_RP_L串联启动子表达HIV-2gag蛋白

目的 :探讨HIV 2gag非融合蛋白的表达。方法 :应用DNA重组技术 ,将HIVgag基因全序列 (gag)和部分 (gag’)cDNA片段克隆到pBV2 2 0载体PRPL 串联启动子下游 ,构建成HIV 2gag重组表达载体pBV gag和pBV gag’ ,在大肠杆菌中表达。结果 :SDS PAGE显示pBV gag’在 2 1kD处可见一明显的额外蛋白带 ,经薄层扫描分析占菌体总蛋白的 6 .1% ,蛋白印迹结果证明 ,表达出的特异蛋白分子量pBV gag为 5 7kD和 47kD ;pBV gag’为 47kD和 2 1kD。经提取包涵体证明 ,表达的蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。结论 :HIV 2gag非融合蛋白可在大肠杆菌中获得表达并主要以包涵体形式存在     

新型人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达及生物活性分析

目的 :在大肠杆菌中表达人白细胞介素 13的新型拼接体蛋白。方法 :用植物凝集素 (PHA)和刀豆凝集素 (ConA)共刺激人Jurkat细胞 ,通过半巢式RT PCR扩增在 98位缺失Gln、不含信号肽的人IL 13新拼接体基因 ,并克隆入 pBV2 2 0 ,构建 pBVIL 13表达载体 ,经温度诱导后在大肠杆菌DH5α中表达新型人IL 13蛋白。表达产物经S 2 0 0纯化、复性后 ,用TF 1细胞进行MTT比色测定其活性。结果 :成功地分离了人IL 13新拼接体基因 ,并在大肠杆菌中表达。分离纯化的新型IL 13蛋白 ,其比活性为 1.6× 10 6U/mg。结论 :获得具有生物学活性的新型人IL 13细胞因子 ,为用其治疗肿瘤和脓毒症提供了新的手段     

组织外植块对培养的鸡胚背根节神经突起生长的影响

为了解神经元的发育和周围组织的关系,本文分别用了:(1)10天鸡胚背根节与10天鸡胚心脏、皮肤、角膜、骨骼肌、肠、大脑、脊髓外植块联合培养;(2)不同时期的鸡角膜与不同胚龄的鸡胚背根节联合培养;(3)10天鸡胚背根节与雏鸡角膜内、外层联合培养。实验结果表明鸡胚心脏、皮肤和角膜外植块对背根节神经突起生长具较强的促进作用且对生长方向有明显诱导作用;骨骼肌、肠和大脑对神经突起生长也有不同程度促进作用,但脊髓却无明显作用。14、16、18天鸡胚角膜对8、10、12、14天鸡胚背根节神经突起生长有明显促进作用;12、14天鸡胚背根节在各时期角膜作用下神经突起生长都较丰富。含上皮层的雏鸡角膜外植块促进背根节神经突起生长的作用比含内皮层的角膜外植块强。     

LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的　克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法　从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果　RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论　本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 ,这为进一步的LIGHT基因的功能研究打下了基础     

血管形成抑制因子tumstatin45-132的基因克隆、表达和生物学活性

目的: 克隆人tumstatin全长编码区基因及编码tum statin45-132的基因, 在大肠杆菌中表达。方法: 采用RT PCR从人胚肾细胞系 293细胞中克隆人的tumstatin全长编码基因, 继以PCR扩增tumstatin45-132 (45 -132位氨基酸 )编码基因, PCR产物克隆到pBV220载体中, 测序证实后, 转化E.coliBL21, 于 42℃进行热诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物, 对重组蛋白纯化后用内皮细胞增殖试验测定其生物学活性。结果: RT- PCR扩增出tumstatin全长编码基因, 以PCR扩增出tumstatin45-132的编码基因, 经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致。以含有tumstatin45-132编码基因的表达载体转化E.coliBL21后, 可表达出相对分子质量(Mr)为 9 600的重组蛋白。表达产物的蛋白量占菌体蛋白量的 10%, 纯化后能抑制内皮细胞的增殖。结论: 成功克隆全长tumstatincDNA, 并在大肠杆菌中表达重组tumstatin45-132蛋白, 证实其具有抑制内皮细胞增殖的活性。     

人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测

为了获取神经营养素 -3 (NT-3 )将之用于神经系统疾病的治疗 ,采用 RT-PCR技术 ,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人 NT-3全长以及成熟蛋白编码基因 ,将其分别克隆至表达载体 pc DNA3 .1与 p ET2 8a,构建了重组真核表达载体 pc DNA3 .1-NT3和重组原核表达载体 p ET2 8-NT3 s。 pc DNA3 .1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞 ,以 G418筛选出抗性阳性克隆 ,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养 5 d,MAP-2 (微管相关蛋白 2 )免疫细胞化学反应结果显示 ,转染细胞株所表达的 NT-3蛋白具有生物学活性 ,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长。将 p ET2 8-NT3 s转化大肠杆菌 ,以 IPTG诱导 ,获得了相对分子质量约 18k D的 6XHis-NT3融合蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %左右。经镍柱亲和纯化 ,得到纯度达 95 %的 rh NT-3蛋白 ,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性     

鸡胚发育过程中音猬因子超表达对Pax家族基因表达的影响

目的 探讨鸡胚发育过程中,音猬因子（Shh）基因在脊髓中超表达后对配对框（Pax）基因家族Pax3、Pax6以及Pax7蛋白表达的影响。 方法 在鸡胚龄2.5～3.0d（E2.5～E3）时,实验组利用鸡胚脊髓活体电转基因技术将携带Shh基因的质粒和携带有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的质粒共转入鸡胚脊髓,对照组则只转入报告基因质粒。E4时取材,每组至少取3例,冷冻切片后采用原位杂交技术检测Shh基因的mRNA表达水平,利用荧光免疫技术检测Shh在鸡胚脊髓中超表达后对Pax3,Pax6以及Pax7蛋白表达水平的影响,并将对照组及实验组中3种基因在脊髓两侧的表达量进行统计学分析。 结果 原位杂交结果表明,E4时Shh的mRNA主要表达在脊髓底板和脊索,实验组结果显示,利用鸡胚脊髓活体电转技术成功建立了Shh超表达模型。对照组中荧光免疫结果表明,Pax3主要表达于脊髓翼板、生肌节、背根以及背根神经节;Pax6主要表达于跨越翼板和基板的脊髓中间部位;Pax7则主要均匀表达于翼板、顶板和生肌节。Shh超表达后,脊髓转染侧与未转染侧相比Pax3、Pax6以及Pax7的表达量差异极显著（P<0.01）,这3种基因在脊髓中的表达均被抑制。 结论 在鸡胚发育过程中,Pax家族Pax3、Pax6以及Pax7 3种基因在鸡胚脊髓中具有不同的表达模式,Shh超表达后对其均具有明显的抑制作用,显示这3种Pax基因受Shh信号通路调控。     

恙虫病东方体Karp株47kD蛋白基因的表达及DNA免疫初步研究

目的　观察恙虫病东方体Karp株相对分子质量 (Mr)为 47× 10 3 蛋白基因的DNA免疫效果。方法　将恙虫病东方体Karp株Mr 为 47× 10 3 的蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1( +) ,构建重组质粒pcDNA3.1 47。在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上 ,单独和将其与Mr 为 40× 10 3 重组蛋白联合免疫小鼠。在每次加强免疫之后 10d ,检测小鼠体液和细胞免疫反应。结果　质粒DNA和蛋白联合免疫组所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖反应均高于重组质粒DNA和蛋白单独免疫组 ,而第二次加强免疫后重组质粒诱导脾淋巴细胞的增殖情况则显著弱于其它免疫组 (P <0 .0 5 )。结论　重组质粒pcDNA3 .1 47和重组Mr 为 47× 10 3 蛋白在刺激小鼠免疫反应上具有相互加强作用。     

背侧抑制性轴突导向蛋白抑制鸡胚脊髓神经嵴细胞的迁移

目的:初步探讨背侧抑制性轴突导向蛋白(draxin)在鸡胚脊髓神经嵴细胞迁移过程中的作用。方法:应用神经嵴细胞特异性标记物HNK-1免疫组化染色检测不同发育阶段正常鸡全胚脊髓神经嵴细胞迁移特性;鸡draxin表达载体质粒转染COS7细胞株,收集上清作为条件培养液。分别用含draxin的条件培养液处理体外培养的鸡全胚和鸡胚脊髓神经管,观察在体和离体条件下draxin对脊髓神经嵴细胞迁移特性的影响。结果:HH12-13到HH18-19阶段正常鸡胚脊髓发育过程中,神经嵴形成明显的从头侧到尾侧的渐进性、节段性迁移特性;draxin对体外培养的全胚和神经管内神经嵴细胞的迁移均具有明显抑制性调控作用。结论:Draxin抑制早期鸡胚脊髓神经嵴细胞的迁移。     

含中国流行株HIV—1Gag—gp120融合蛋白的重组鸡痘病毒的构建

目的用重组鸡痘病毒表达中国流行株HIV-1Gag-gp120融合蛋白.方法在以鸡痘病毒282E4株为基础构建的重组表达质粒pUTAL的ATI-P7.5复合启动子下游,插入编码中国流行株HIV-1Gag-gp120嵌合基因,构建了重组表达质粒pUTALGP.重组质粒与FPV共转染CEF细胞,进行了同源重组.通过PUdR加压筛选,X-gal染色,获得重组鸡痘病毒vUTALGP.结果经Westernblot检测表明,重组病毒表达了Gap-gp120融合蛋白,其分子量分别为110×103、69×103、48×103、24×103.电镜观察可见Gag蛋白在CEF细胞中形成的反转录病毒样粒子.重组病毒免疫小鼠,能够诱导HIV-1特异的血清抗体反应.结论重组鸡痘病毒成功的表达了Gag-gp120融合蛋白,并进行了正确的加工.     

异基因嵌合体与移植耐受关系的研究Ⅱ成年小鼠联体共生诱导耐受的机制

将BALB/c(H 2 d)小鼠及C5 7BL/ 6 (H 2 b,B6 )小鼠的脾细胞分别经尾静脉注射给对方 ,2d后再分别腹腔注射环磷酰胺 (CY ) 15 0mg/kg ,CY注射后 1d对BALB/c及B6小鼠进行联体 (parabiosis) ,1周后分开并进行相互间的植皮。发现BALB/c小鼠对B6小鼠的皮肤耐受期明显延长 (MST =2 5 7d ) ,但是B6对BALB/c小鼠的皮肤耐受期无明显延长 (MST =11 9d )。利用流式细胞仪分析技术 (FACS )分别对上述处理的BALB/c及B6小鼠在联体分开后的第 1天和第 30天进行胸腺及脾脏嵌合程度的检查 ,发现皮肤耐受期与嵌合程度不呈正相关。对联体后耐受的BALB/c小鼠进行体内和体外细胞转移实验 ,均未显示耐受小鼠脾细胞中存在抑制细胞活性。在耐受BALB/c→B6小鼠的单向混合淋巴细胞反应 (MLR )体系中加入外源IL 2可以部分反转耐受BALB/c小鼠脾细胞的增殖反应 ,表明本实验诱导耐受的机制可能与克隆不应答 (clonalanergy )有关。     

Heymann肾炎受体相关蛋白融合蛋白的实验研究

通过Heymann肾炎受体相关蛋白的研究 ,探讨Heymann肾炎的分子发病机制。运用基因重组技术 ,将编码受体相关蛋白羧基端 10 8个氨基酸多肽 (RAP3 2 4 )的cDNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pGEX。通过异丙基硫代 β D半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,表达了分子量为 44× 10 3 的融合蛋白。经GST Sepharose4B亲和层析柱 ,纯化了融合蛋白。表达产物经Westernblot分析。羧基端受体相关蛋白融合蛋白在pGEX中得到高效表达 ,其分子量为 44× 10 3 。每升培养液纯化到 2 0～ 30mg的融合蛋白。Westernblot分析表明抗RAP3 2 4 融合蛋白的抗血清识别天然肾小管刷状缘膜抗原FXIA中分子量约 44× 10 3 的带。间接免疫荧光显示该融合蛋白抗体结合于肾小管刷状缘。表明受体相关蛋白羧基端 10 8氨基酸多肽链上存在致肾炎的病理性表型。     

人受精相关抗原-1的基因克隆及原核表达

目的为了阐明免疫性不孕不育的原因,检测血清中存在的抗精子抗体的种类,构建重组人受精相关抗原-1（recombinant human Fertilization antigen-1,rhFA-1）的原核表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。方法采用RT-PCR法,从人睾丸组织总RNA中扩增获得人FA-1的cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建人源性FA-1的重组原核表达质粒pBV220/FA-1。重组质粒经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌JM109并在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白。结果测序表明重组基因序列与人FA-1基因完全一致。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的相对分子量为14.6KDa与预期结果相符。结论获得了人FA-1的编码基因,并在大肠杆菌中表达了人的FA-1蛋白。     

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础     

日本血吸虫铁蛋白基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

目的：构建、表达、纯化日本血吸虫铁蛋白基因的原核表达重组蛋白，并初步观察其免疫诊断价值。方法：将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆于pGMC载体，转化重组体到大肠杆菌E．coli 2566进行表达；采用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白；用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达纯化产物；用Dot-ELISA分别检测了血吸虫病人及正常人的血清。结果：重组的日本血吸虫铁蛋白以GMC(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)．日本血吸虫铁蛋白融合蛋白的形式在细菌中得到高效表达，分子量为40kD，能被日本血吸虫感染兔血清识别。用重组铁蛋白检测30例日本血吸虫病人血清和30例正常人血清，阳性率和假阳性率分别为93．3％和3．3％。结论：成功地表达纯化日本血吸虫重组铁蛋白．且该蛋白具有一定的免疫诊断价值．     

HIV-1核心蛋白p24在大肠杆菌中的表达与纯化

探索进一步提高ＨＩＶ－１Ｐ２４ｇａｇ蛋白在大肠杆菌中的表达效率,增加产物的纯化手段。方法：通过改造原核表达载体ＰＢＶ２２０和ｐＥＴ２８,构建了一种通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５,将ＨＩＶ－１ｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列,插入到ｐＶＶ５ｂ和ｐＥＴ２８ｂ的相应位点中,构建了重组表达质粒,ｐＥＧ１ｂ和ｐＥＧ７ｂ,转化到大肠杆菌中进行表达,产物利用ＩＭＡＣ金属螯合层析柱进行纯经,纯化的表达产物用     

新型重组人IFN-λ2的高效表达、纯化与抗病毒活性研究

目的在大肠埃希菌中高效表达重组人干扰素λ2(rhIFNλ2),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌的偏爱密码子人工设计合成人干扰素λ2(hIFNλ2)的高表达基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌中进行表达,表达产物经变性、复性、阳离子交换层析及分子筛层析纯化,测定其抗病毒活性、种属特异性及抗HBV活性。结果在大肠埃希菌表达的目的蛋白占细胞总蛋白量的15%左右,纯化后的纯度达到90%以上,在WISH细胞上抗VSV活性约为1.5×106IU/mg。与rhIFNα2b比较,表达产物在非灵长类细胞上的抗病毒活性较在灵长类细胞上弱,目的蛋白在HepG2.2.15细胞上表现有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性。结论hIFNλ2可以在大肠埃希菌内实现高效表达,表达产物具有抗病毒活性,有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性,本型IFN有较严格的种属特异性。     

hIL-1Ra基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 :克隆hIL 1Ra基因并在大肠杆菌中高效表达。方法 :从人外周血中分离白细胞并提取其总RNA。用RT PCR获得hIL 1RacDNA ,克隆入pBV2 2 0表达载体进行诱导表达。对表达产物进行复性和纯化。结果 :成功地构建了pBV2 2 0 IL 1Ra表达载体 ,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,表达量占全菌的 4 0 %。对表达产物进行分离纯化及活性分析表明 ,获得纯度大于98%的样品。该样品具有明显抑制IL 1刺激EL 4细胞分泌IL 2的作用。结论 :在大肠杆菌中成功地表达有活性的hIL 1Ra基因 ,为进一步的开发利用奠定了实验基础。     

HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达

目的 克隆HER—2／neu配体结合区基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。方法 用PCR技术扩增HER—2／neu脑外配体结合区的cDNA片段，并将该片段插入pET-28a(t)原核表达载体中，实现插入基因的融合表达；用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果 构建的重组质粒在大肠杆菌中获得高效稳定的表达，表达产物的相对分子质量与预期值一致，且所表达蛋白可被抗HER—2/neu的特异性抗体识别。结论 获得了HER—2／neu脑外配体结合区基因在原核系统中的表达，为HER—2／neu高表达肿瘤的疫苗研究奠定了基础。