Tet-on基因表达系统反应质粒P~(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板，进行RT-巢式PCR，获得HIF-1α的cDNA，克隆人Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE2hyg，酶切重组子鉴定。将构建好的P^TRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2^Tet-on细胞，在强力霉素的作用下，用RT-PCR及Western blot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的eDNA测序结果与Genbank记载完全一致，并成功克隆人P^TRE2hyg，将反应质粒P^TRE-HIF-1α转入HepG2^Tet-on细胞，可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒P^TRE-HIF-1α，并证明其表达能在HepG2^Tet-on细胞中受强力霉素调控。     

受强力霉素调控表达的人肝癌HepG2细胞系的建立

目的建立受强力霉素 (doxycycline)调控表达的人肝癌HepG2细胞系。 方法用阳离子脂质体lipofectamine 2 0 0 0 0将pTet on质粒转染人肝癌HepG2细胞 ,通过G4 18筛选得到稳定转染的抗性克隆 ;将抗性克隆细胞分别培养扩增 ,通过 pTRE luc质粒瞬时转染 ,加入终浓度为 1μg/ml的doxycycline诱导剂培养 4 8h后 ,逐一检测每个细胞株的荧光素酶表达活性。 结果第 6号克隆的细胞诱导后荧光素酶的表达活性为 16 76 4 ,而非诱导状态下该细胞株的背景活性为 87,诱导后的活性增加 192倍。结论HepG2 /Tet on细胞株是可调控基因表达的人肝癌细胞株 ,为研究肝癌的发病和基因治疗提供了较为理想的研究工具。     

Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞增殖的影响

目的 探讨HIF-1α表达对肝癌细胞增殖和细胞周期的影响.方法 利用Tet-on基因表达系统调控肝癌细胞系HepG2中HIF-1α的表达,检测细胞周期和细胞增殖的变化.结果 酶切和DNA测序证实Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α构建成功.获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞.随着强力霉素浓度增加,hiF-1α基因表达增加,HIF-1α在体外明显增加HepG2细胞增殖活性;G0/G1期细胞指数减少,细胞增殖指数增多.RT-PCR检测结果表明,随着HIF-1α基因表达增加,Cyclin A mRNA表达增加(P＜0.001),Cyclin D1和Cyclin E mRNA表达水平无明显变化(P＞0.05).结论 HIF-1α基因在体外可以通过HIF-1α表达水平的增加而促进肝癌细胞增殖活性,通过CyclinA表达增加缩短了肝癌细胞增殖周期.     

EphA1基因可控性双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA的建立

目的建立可调控EphA1基因表达的内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA。方法将pWHE146质粒转染到内皮祖细胞系中,筛选出稳定表达的细胞克隆;扩增后瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒,强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶活性,挑选出高表达、低背景的受强力霉素调控的EPCsTet-On细胞株;再将重组质粒pTRE-EphA1SiRNA转染入EPCsTet-On细胞株,筛选出稳定表达细胞克隆EPCsTet-On-EphA1SiRNA;通过强力霉素诱导后,利用RT-PCR和Western blotting法检测EphA1基因mRNA与蛋白的表达。结果成功构建了受强力霉素调控的高表达低背景的EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株;强力霉素可诱导EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株中EphA1mRNA表达下调,较之未调控组其差异有统计学意义(P<0.05);强力霉素调控EphA1蛋白表达的能力在一定范围内呈剂量依赖性关系。结论成功建立强力霉素调控EphA1基因表达的大鼠双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA,为深入研究EphA1基因在内皮祖细胞参与肝癌血管生成过程中的作用提供了有效的实验手段。     

四环素调控系统修饰永生化大鼠星形胶质细胞株的构建及鉴定

目的构建四环素及其衍生物强力霉素诱导表达目的基因的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法用脂质体法将逆转录病毒载体四环素调控系统中的质粒pRevTet-On转染病毒包装细胞 PT67,经筛选培养后获得病毒载体RevTet-On,采用RT-PCR进行鉴定,并应用NIH313细胞测定病毒滴度。将RevTet-On感染永生化大鼠星形胶质细胞,用有限稀释法挑选阳性细胞单克隆后扩大培养,每个克隆瞬时转染含萤光素酶报告基因的质粒pRevTRE-Lue,加入强力霉素48h后分别检测其萤光素酶活性值,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低的细胞株并检测其诱导表达的时效、量效关系。结果 RT-PCR结果显示逆转录病毒包装成功,病毒最高滴度为7．4×105CFU／ml。RevTet-On转染永生化大鼠星形胶质细胞后挑选出48个单克隆,瞬时转染pRevTER-Luc后筛选出1株高表达低背景细胞株, 其诱导表达值为876．1 RLU,背景表达值为42．5 RLU,诱导倍数为20．6。该细胞株在加入诱导因子强力霉素1 h后目的基因即开始表达,在24 h时达到高峰,在强力霉素浓度100-2 000 ng/ml的范围内, 其诱导表达活性与药物浓度呈剂量依赖性。结论含四环素调控系统的永生化大鼠星形胶质细胞株诱导活性可靠,可用于调控表达外源基因的研究。     

Tip30真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的：探讨人Tip30全长基因的真核表达载体pAAV-TIP30的构建,并观察其转染肝癌细胞株HepG2后的表达。方法：以正常人肝组织mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增Tip30,利用限制性内切酶BamH I和Xba I,将Tip30基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中,并经酶切和测序鉴定。重组质粒转染HepG2细胞,运用Western blot法检测Tip30蛋白表达。结果：RT-PCR方法正确地扩增出全长Tip30基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实Tip30基因克隆完全正确。重组质粒转染肝癌细胞系HepG2后,Western blot证实Tip30蛋白表达增高。结论：成功构建了真核表达重组质粒pAAV-TIP30并转染HepG2细胞,为进一步研究Tip30基因对肝癌的影响及其机制打下了基础。     

稳定表达线粒体融合素基因2肝癌细胞株的建立及其意义

目的探讨将线粒体融合素基因2（mfn2）转染培养人肝癌细胞株HepG2，建立长期表达mfn2的肝癌细胞模型的可行性。方法基因重组构建mfn2真核表达质粒pEGFPnffn2，用脂质体将质粒转染培养人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应检测转染后30d细胞mfn2 mRNA的表达水平；Western—blot检测线粒体融合蛋白的表达。结果（1）成功构建表达真核质粒pEGFPmfn2；（2）成功将质粒pEGFPmfn2转染肝癌细胞株HepG2，并获得阳性细胞克隆；（3）经脂质体转染的人肝癌细胞株HepG2可较稳定表达mfn2。结论成功地建立稳定表达mfn2的肝癌细胞株，为进一步研究mfn2在肝癌发生发展中的作用奠定了基础。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

Tet-on基因表达系统转染骨髓基质干细胞和诱导调控效应检测

目的 探讨利用Tet-on基因表达系统调控目的基因在骨髓基质干细胞中表达的可能性和量效关系，为利用该系统调控BMP基因在骨髓基质干细胞中的表达奠定基础。方法 以荧光素酶（luciferase)基因为目的基因，应用Lipofectamine介导的瞬间转染方法。将pTet-on调节质粒和pTRE-luciferase反应质粒共转染骨髓基质干细胞，加入系列浓度的强力霉素（doxycyline)后，观察doxy-cyline的诱导效应。结果 （1）pTet-on表达系统质粒DNA经HindⅢ单酶切，琼脂糖凝胶电泳后，可见6.02kb和1.38kb两个片段；pTRE-luciferase质粒经HindⅢ单酶切线性化，可见5.2kb的片段，均符合质粒图谱。（2）随着doxycyline浓度的增加，荧光素酶的活性也逐渐增加，未转染的骨髓基质干细胞虽经doxycyline诱导，但其RLU值与空白对照（蒸馏水）非常接近，说明未转染的骨髓基质干细胞不受doxy-cyline诱导，而转染的骨髓基质干细胞在未加入诱导剂量，其RLU（relative-luciferase-unit)值也接近空白对照值。结论 转染Tet-on基因表达控制系统的骨髓基质干细胞对doxycyline诱导具有较好的反应性，目的基因荧光素酶基因的表达效力对doxycyline具在严格的计量依赖关系。因此，利用Tet-on基因调控系统对目标基因在骨髓基质干细胞中的表达进行调控是可行的。     

人骨形态蛋白-2可调控系统在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(h BMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞。方法设计目的基因h BMP-2引物,将扩增纯化的目的基因h BMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物。h BMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液。用h BMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到h BMP-2阳性表达细胞,探索转染最佳感染复数(MOI)。用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素(DOX)诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况。结果 PCR后得到目的基因h BMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的h BMP-2-GV347质粒。h BMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得h BMP-2-GV347慢病毒浓缩液。在DOX诱导下,h BMP-2-GV347慢病毒载体在293T细胞内表达BMP-2蛋白。h BMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA。结论本研究成功构建携带Tet-on系统调控h BMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白。     

反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞MBD1基因表达的影响

目的：探讨反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因表达的影响，为进一步研究该基因的作用提供依据。方法：构建反义MBD1基因真核表达载体，通过脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC 939中，以G418进行筛选得到稳定转染细胞株，用PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染成功。半定量RT PCR观察转染前后MBD1基因mRNA水平的变化，流式细胞术检测转染前后MBD1蛋白的变化。 结果：人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的mRNA水平从0.912±0.022降低至0.215±0.017，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)；MBD1蛋白水平从(80.19±5.05)％降低到(35.11±4.05)％，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)。 结论：反义MBD1基因转染能降低人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的表达水平，提示MBD1基因在胆管癌的发生发展中具有重要作用，反义MBD1基因转染有可能成为胆管癌治疗的一种新方法。     

重组人DNMT1真核表达质粒对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA水平及细胞生长曲线的影响

目的 观察重组人DNMT1真核表达质粒转染对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA表达水平和细胞生长曲线的影响。方法 将构建好的正义和反义DNMT1真核表达质粒用脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC-939,然后用G418进行筛选,得到阳性克隆细胞株后,用半定量RT-PCR检测DNMT1基因的mRNA水平的变化,用MIT法观察细胞生长曲线。结果 正义DNMT1真核表达质粒能使QBC-939细胞中的DNMT1基因的mRNA水平增加,而反义DNMT1真核表达质粒则使其mRNA水平降低;正义质粒可使QBC-939细胞增殖速度加快,反义质粒使其增殖速度减慢。结论 重组人DNMT1真核表达质粒转染能影响胆管癌细胞DNMT1基因的mRNA表达水平和细胞生长曲线。     

稳定表达PTEN抑癌基因的炎性乳腺癌细胞系MDA-MB-468的建立和鉴定

目的建立稳定表达外源性PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedfromchromosometen)基因的人炎性乳腺癌MDA MB 468细胞系。方法用脂质体lipofectamine2000转染法,将野生型PTEN基因导入高转移性炎性乳腺癌细胞系MDA MB 468,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,应用RT PCR、免疫组化方法及Westernblot分析目的基因及其蛋白表达。结果野生型PTEN基因成功地导入炎性乳腺癌细胞系MDA MB 468,转染细胞稳定表达PTEN蛋白,PTEN蛋白分布于细胞质。结论MDA MB 468炎性乳腺癌细胞株能稳定表达外源性PTEN基因。     

稳定高表达Uroplakin Ⅱ基因人膀胱癌细胞株的建立及其意义

目的　建立稳定高表达UroplakinII(UPII)基因的人膀胱癌细胞株。方法　采用分子克隆技术构建含全长UPII结构基因的真核表达载体 ,进行酶切鉴定、核酸序列分析 ,并将其在阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0的介导下转染UPII基因缺陷型膀胱移行细胞癌 (TCC)细胞株EJ ,经G418筛选获得抗性亚克隆细胞株 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblotting方法对亚克隆细胞株进行UPII基因表达鉴定。结果　所获UPII基因真核表达载体pcDNA3 UPII转染EJ细胞后 ,通过G418持续压力筛选 4周获得亚克隆细胞株EJ/UPII ;RT PCR、Westernblotting均未检测到EJ细胞的UPII基因表达 ,而EJ/UPII细胞中UPIImRNA和蛋白表达水平显著增高 (P <0 .0 1)。结论　通过基因转染方法建立了稳定高表达UPII基因的膀胱TCC细胞株 ,为进一步探讨UPII基因在膀胱TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

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??Construction and expression of enhanced green fluorescent protein and HSV1-TK co-expression vector TANG Yong , LIU Zuo-jin, ZHOU Shi-ji ,et al. Department of Hepatobiliary Surgery, the Second Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Scienses, Chongqing 400010??China Corresponding author: LIU Chang-an, E-mail??liuchanganyisheng@sina.com Abstract Objective To construct EGFP and HSV1-TK co-expression vector and to detect its expression level in hepatoma carcinoma cell line HepG2, and thus to provide experimented bases for the target gene therapy of liver cancer. Methods HSV1-TK gene was isolated from pORF-HSV1TK plasmids and cloned into eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP??The recombinant plasmid pIRES2-EGFP-TK was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Then recombinant plasmid was transfected into hepatoma carcinoma cell line HepG2 by liposome reagent??and the expression of EFGP in cell were observed by fluorescence microscopy , TK protein and mRNA was analyzed by Western blotting and RT-PCR respectively?? Results The sequence of the cloned DNA fragment was identical to HSV1-TK that was reported on Gene bank??The recombinant expression plasmid was successfully transfected into HepG2 cell line, and green fluorescent was observed under fluorescent microscope, positive clones were picked out by G418 screening. The optimal G418 screening concentration was 600g/L.The mRNA expression level of TK was high and its protein expression was found. Conclusion The recombinant eukaryotic co-expression vector of EGFP and HSV1-TK was successfully constructed and effectively expressed in HepG2 cell line.     

VEGF-C基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的影响

目的探讨将真核表达载体pcDNA3．1-VEGF—C重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞后VEGF-C表达的变化。方法通过脂质体介导方法，将构建好含有VEGF—C的重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中，新霉素（G418）筛选得到稳定转染细胞系，RT—PCR和Western blot方法检测稳定转染后细胞中VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果成功转染并获得稳定高表达VEGF—C的乳腺癌MCF-7细胞系，其转染组VEGF—C mRNA相对吸光度值（12．382&#177;2．183）较空载组（6．039&#177;1．950）显著上调（P〈0．01）。Western blot检测转染组VEGF-C蛋白相对灰度值（0．971&#177;0．186）较空载组（0．594&#177;0．196）明显上调（P〈0．05）。结论脂质体介导重组质粒pcDNA3．1-VEGF-C转染入人乳腺癌MCF7细胞中可显著增加VEGF—C表达水平。     

反转录病毒载体介导猪MHCⅡ分子在猪骨髓细胞中的表达

目的构建猪MHC Ⅱ分子的反转录病毒表达载体，建立产生病毒颗粒的包装细胞株，体外转导小型猪骨髓细胞并观察目的基因的表达情况，为研究小型猪转导同种异体MHC Ⅱ分子对于肝脏移植特异性免疫耐受的诱导提供实验基础和实验材料。方法利用基因重组技术将目的基因SLA-DRB^dd、SLA-DQA^dd和SLA-DQB^dd克隆到反转录病毒载体pLNCX2上，通过脂质体转染包装细胞AmphoPack^TM-293细胞，从G418筛选阳性克隆细胞培养上清中获得了有感染性的病毒颗粒；并对体外培养的猪骨髓细胞进行了感染，采用Nothern杂交和逆转录．聚合酶链反应（RTPCR）等方法检测了目的基因在骨髓细胞中的表达。结果经过酶切和测序验证已成功构建了MHC Ⅱ分子的反转录病毒表达载体，在转染AmphoPack^TM-293细胞后可以产生有感染性的重组病毒颗粒，稳定的CFM-GFG418抗性率为6％～11％，RT结果显示抗性细胞中有目的基因的RNA转录产物存在，而转染空载体的对照组没有。结论重组有目的基因的逆转录病毒载体pLNCX2经过包装细胞AmphoPack^TM-293产生的病毒颗粒可以有效地将猪MHC Ⅱ分子转导入猪的骨髓细胞并获得长期稳定的表达。