华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的 探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值。方法 以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No．AF093242，简称CysB)的部分基因片段，亚克隆到pTrcHis表达载体，转化入大肠埃希菌DH5α。表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清，评价其诊断应用价值。结果 成功克隆与表达CysB基因片段，纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96．0％(48／50)，与其他寄生虫病的总交叉反应为3．8％(1／26)，而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88．0％(44／50)．与其他寄生虫感染血清无交叉反应。结论 重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性，有希望成为可溶性粗抗原的替代之一。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA检测方法的建立及其应用效果评价

目的建立重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA检测方法,观察该方法检测华支睾吸虫病的现场应用效果。方法根据江苏省第二次重要人体寄生虫流行现状调查结果选取6个调查点,采用整群抽样的方法每个村调查不少于500人,应用重组华支睾吸虫半胱氨酸ELISA检测血清特异性抗体。采用系统抽样方法抽取的10％的阴性者和全部阳性者开展病原学检测。ELISA试验通过设立阴性血清、阳性血清和PBS对照及重复试验进行质量控制。结果ELISA检测3105人,血清特异性抗体阳性21人,阳性率为0．68％。对ELISA阳性者做病原学检查,阳性18人,一致率为99．10％。质量控制结果显示ELIsA试验,每批次阴性和阳性平行对照A。均值差异无统计学意义（P〉0．05）,重复试验一致率为99．43％。结论重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA法重复性好,敏感性高,具有较高的诊断价值和广阔的应用前景。     

华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶用于血清学调查的效果评价

目的 以华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶(CsCp)为ELISA包被抗原检测流行人群血清特异性抗体水平,与成虫粗抗原比较,评价其用于华支睾吸虫病血清学调查的价值. 方法 以佛山市南海区的1个行政村为调查点,用改良加藤厚涂片法检查粪便华支睾吸虫虫卵.同时采集血清,分别以rCsCP与成虫粗抗原(CsCAA)的ELISA方法检测血清特异性抗体水平,对粪检及两种抗原的ELISA结果进行统计学分析. 结果 接受血清检测的97人中,华支睾吸虫虫卵阳性率60.8%,CsCAA-ELISA阳性率75.3%,rCsCP-ELISA阳性率76.3%,特异性抗体阳性率高于虫卵阳性率(P<0.05),不同抗原ELISA阳性率差异无统计学意义(P>0.05);CsCAA-ELISA、rCsCP- ELISA结果与粪检结果的符合率分别为56.7%和55.7%,两种抗原ELISA结果的符合率为82.5%.59例粪检阳性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率均为76.3%,38例粪检阴性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率分别为73.7%和76.3%. 结论 以rCsCP为包被抗原,用ELISA检测华支睾吸虫病流行区人群血清特异性IgG抗体与使用CsCAA的检测结果有较高的符合率,但同样不能区分现症与既往感染.     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA检测方法的建立及其应用效果评价北大核心CSCD

目的建立重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA检测方法,观察该方法检测华支睾吸虫病的现场应用效果。方法根据江苏省第二次重要人体寄生虫流行现状调查结果选取6个调查点,采用整群抽样的方法每个村调查不少于500人,应用重组华支睾吸虫半胱氨酸ELISA检测血清特异性抗体。采用系统抽样方法抽取的10%的阴性者和全部阳性者开展病原学检测。ELISA试验通过设立阴性血清、阳性血清和PBS对照及重复试验进行质量控制。结果ELISA检测3 105人,血清特异性抗体阳性21人,阳性率为0.68%。对ELISA阳性者做病原学检查,阳性18人,一致率为99.10%。质量控制结果显示ELISA试验,每批次阴性和阳性平行对照A450均值差异无统计学意义(P>0.05),重复试验一致率为99.43%。结论重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶ELISA法重复性好,敏感性高,具有较高的诊断价值和广阔的应用前景。     

华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段原核表达及其抗原性分析

目的 通过克隆和表达获得华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段重组蛋白并分析其抗原性。方法 以pET-28a-CsCP1-3重组质粒为模板进行目的片段CsCP1a-3a PCR扩增,构建pET28a-CsCP1a-3a表达载体,并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析;表达产物经变性、纯化及复性,与华支睾吸虫感染大鼠血清行Western blot分析。结果 成功构建pET28a-CsCP1a-3a重组质粒;SDS-PAGE分析显示,重组蛋白CsCP1a-3a以包涵体形式表达;重组蛋白CsCP1a-3a可被华支睾吸虫感染后第4、5周大鼠血清识别。结论 重组蛋白CsCP1a-3a具有较好抗原性,可作为华支睾吸虫感染诊断候选分子。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆表达和血清学诊断效果

目的克隆、表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（CSCP）,并评价其免疫学诊断效果。方法根据已知的CSCP（Gen Bank序列号：AF093242）基因序列设计引物,从华支睾吸虫成虫总cDNA中扩增该目的片段,克隆入真核表达载体pPIC9K,转化至巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,甲醇诱导表达、纯化;采用Westernblot技术鉴定该重组蛋白;用纯化的重组CSCP（rCSCP）免疫小鼠,ELISA法检测抗体效价;应用DotELISA法和Western blot法评估该重组蛋白的诊断效果。结果从华支睾吸虫成虫cDNA中扩增获得长度为927bp的CSCP基因,并成功进行了真核表达、纯化,纯化的rCSCP免疫小鼠后的血清能被华支睾吸虫成虫可溶性抗原识别,其血清抗体效价达1∶64000;采用该重组蛋白建立的DotELISA法检测华支睾吸虫病人的敏感性为91.7%（55/60）,检测正常人的特异性为97.6%（82/84）;Western blot分析显示,rCSCP与日本血吸虫病人血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病人交叉反应率为20.0%（2/10）。结论 rCSCP具有较好的诊断效果,是华支睾吸虫重组蛋白中一个有潜在诊断价值的抗原。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较

目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果。方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因, 与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a?CP和真核表达质粒pPIC9K?CP, 双酶切及测序鉴定后, 将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌（E. coli） BL21 （DE3） 和毕赤酵母GS115中诱导表达、 纯化; 将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清, 比较诊断效果。结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在, 表达量为6.84 mg/L; 真核表达系统表达量达到65.00 mg/L, 且为可溶性蛋白; 两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00%（57/60） 和 93.30% （56/60）, 特异性分别为91.67% （77/84） 和94.10% （79/84）, 差异均无统计学意义 （P均 > 0.05）。结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值。     

华支睾吸虫成虫全长基因表达文库的构建和基因表达谱的建立

目的 获得尽可能多的华支睾吸虫UNIGENE及全长基因，建立成虫基因表达谱，为华支睾吸虫发育过程中基因表达的规律和功能基因组学研究奠定基础。方法 构建pBlueseript Ⅱ SK全长cDNA质粒文库，先对5’端进行随机EST大量测序，生物信患分析后归并UNIGENE，并对归并的结果进行了3’端的序列测定，根据3’端测序结果，再次进行UNIGENRE归并，对能够拼按上的克隆进行了序列拼接。对预测为完整基因且未测通的序列，进行了引物设计，walking反应测序，将得到的UNIGENE用点样法制备基因芯片。结果 获得5’端有效EST序列4066个，测序结果UNIGENE分析，归并获得1775个UNIGENE，5’端预测的全长基因为377个。共获得测通的cDNA序列277个，其中全长基因198个。目前制备的华支睾成虫基因表达谱芯片含有1775个基因。结论 所构建的华支睾吸虫成虫全长cDNA文库质量较好，采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆和表达(英文)

华支睾吸虫病严重危害着人们的身体健康 ,研制快速诊断试剂盒对于华支睾吸虫病的防治显得非常重要。目前 ,市场上销售的快速诊断试剂盒 ,其诊断抗原主要来自华支睾吸虫成虫的粗抗原 ,抗原敏感性高 ,特异性却不高 ,所以寻找并生产基因工程重组抗原有着非常重要的意义。半胱氨酸蛋白酶是一类含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶 ,多种寄生虫都能产生或分泌半胱氨酸蛋白酶 ,它对寄生虫的生存、发育以及在寄生虫与宿主的相互关系上均有着极其重要的作用。越来越多的科研工作者开始重视它的免疫诊断价值 ,本文研究的目的是为华支睾吸虫快速诊断试剂盒寻找基因工程重组抗原。我们根据已知华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因序列设计一对引物 ,用文库构建试剂盒提取总RNA ,并反转录成cDNA ,以cDNA为模板 ,通过PCR技术从cDNA中扩增出目的基因。PCR产物通过测序鉴定 ,用工具酶BamHI和XholI同时消化目的基因和pGEX - 4T - 1原核表达载体 ,消化后的产物用连接酶连接 ,构建成 pGEX - 4T - 1-CP重组体 ,并将其转入Jm10 9大肠杆菌中。用PCR初步筛选阳性克隆 ,共获得阳性克隆 8个 ,再用双酶切和测序进一步鉴定初步筛选的阳性克隆。挑取阳性克隆 ,37℃条件下用IPTG诱导重组体表达 ,表达产物通过SDS -PAGE电泳鉴定。通过上述实验 ,获     

华支睾吸虫的组织化学研究

用组织化学方法观察华支睾吸虫成虫各种物质的分布和定位。结果其糖原、蛋白质、脂肪、核酸ACP、酚酶的分布与文献记载基本一致,但ACP的分布较为局限,活性低下。虫体的SDH,MDH、MAO、G-6-P、G-ATP等五种酶系首次记载,前三者的分布以皮层、皮下,睾丸、卵巢与吸盘为主,SDH和MDH的活性较MAO强,G-6-P与糖原的分布颇为一致,主要在虫体的实质组织和皮下肌层,在皮层与皮下肌层的Ca-ATP活性较强。     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶(mGST)新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a(+)-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶（mGST）新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA（质粒）文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a（＋）,在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a（＋）-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.     

酶联免疫吸附试验诊断华支睾吸虫病初步观察

实验感染兔取成虫制成1％华支睾吸虫成虫可溶性抗原。以1:1500包被ELISA板诊断华支睾吸虫病人血清,与粪检阳性符合率88.1％,健康人血清阴性符合率97.1％。用滤纸干血代替血清阳性符合率为87.0％,阴性符合率为85.4％,而在非流行区人群采滤纸干血阴性符合率则为95.1％。与丝虫病人血清未见交叉反应;与疟疾的交叉反应为3％;与血吸虫病的交叉反应为6.66％。结果表明应用ELISA诊断华支睾吸虫病是一种敏感性高、特异性强、重现性良好的免疫诊断方法,现场应用滤纸干血方法简便、微量,值得推广。     

生物素——亲和素系统检测华支睾吸虫特异性抗体的研究

用ABC-ELISA检测华支睾吸虫粪检阳性病人130例,粪检阴性受试者101例及其它疾病82例,并与粪检及另外两种血清学方法(SPA-ELISA、常规ELISA)比较。粪检阳性符合率93.08％,阴性符合率63.37％。ABC-ELISA的阳性反应强度是常规ELISA的1.31倍(P<0.05),其平均几何滴度是SPA-ELISA的1.77倍(P<0.05)。特别在轻度感染病人,ABC-ELISA的平均几何滴度明显高于后两种血清学方法,而且非特异性反应较低。     

滤纸干血ELISA在华支睾吸虫病流行病学调查中的应用

两种华支睾吸虫成虫可溶性抗原作ELISA与粪检的阳性符合率均接近90％。现场调查结果表明,粪检与ELISA的阳性检出率无显著差异。检查村民2309人,阳性符合率为89.3％,阴性符合率为92.8％。患者的感染度和血清抗体滴度与阳性符合率有密切关系。重度感染者阳性符合率高达97.9％,而轻度感染者阳性符合率仅为60.60％。感染度越重血清抗体滴度越高。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的　通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX 4T 1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。　方法　用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA 质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI 和ExPasy 网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据 pGEX 4T 1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA 编码序列设计引物,进行PCR 扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1 上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳鉴定。　结果　发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1 017 个碱基对,编码339 个氨基酸,理论分子质量单位为37.024 09 ku ,理论pI为6.66 。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS PAGE电泳显示表达产物在63 ku处有1条特异性条带。　结论　发现华支睾吸虫 GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫感染与急性胆囊炎的关系-流行区调查与临床资料分析

在广东顺德市调查５２３０人的华支睾吸虫感染率２５．１％（１３１５／５２３０），１３１５例华支睾吸虫感染者的胆囊炎发生率为６．０％，３９１５例非华支睾吸虫感染者则为０．８％，差异非常显著（Ｐ＜０．０１）。在６４例急性胆囊炎住院患者中，５７例（８９．１％）合并华支睾吸虫感染，未合并华支睾吸虫感染者仅为７例（１０．９％），前者为后者的８倍多。说明华支睾吸虫感染与急性胆囊炎的发生有密切关系。在急性胆囊炎合并华支睾吸虫患者中，驱虫治疗对防止急性胆囊炎反复发作有积极作用。     

华支睾吸虫病金标诊断试剂盒的研制和现场初步实验

目的　研制华支睾吸虫病金标快速免疫诊断试剂盒 ,评价其敏感性、特异性和现场试用效果。　方法　以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶 (PGK)作为诊断试剂 ,制备胶体金免疫层析检测 (Im-munochromatography test,ICT)试剂盒 ,检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫 Ig G,并与常规 EL ISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。　结果　实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的 Ig G,3种抗原的敏感性均为10 0 %。天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外 ,与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。重组PGK抗原同慢性血吸虫病人血清也没有交叉反应。用分泌排泄抗原制备的 ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液 ,总符合率为 92 .31% ;ICT与 EL ISA血清检测的总符合率为 81.5 4 %。现场获取了 9人的粪便样本 ,其中 4人检出华支睾吸虫卵 ,其血清 ICT和 EL ISA检测均呈强阳性 ,另外未检出虫卵的 5人中 ,1人血清 ICT和 EL ISA均呈阳性 ,另 1人仅血清 EL ISA呈弱阳性。　结论　诊断华支睾吸虫感染的 ICT抗体检测技术 ,尤其是无创性唾液检测技术 ,简便、快速、准确、安全 ,优于血清 EL ISA检测和粪便虫卵检测 ,适用于临床检验和现场大规模流行病     

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

广西人体华支睾吸虫感染现状调查分析

目的了解广西人群华支睾吸虫病流行现状和态势。方法按流行程度和水系流域进行分层整群随机抽样。用改良加藤厚涂片法粪检虫卵并计数。结果调查了9个县(市)27个点13990人,华支睾吸虫平均感染率为9.76%,平均EPG为1083,有6个县(市)查出感染者,其中3个县感染率超过20%。男性平均感染率和EPG分别为13.09%和1320;女性分别为5.89%和658,差异均有显著性。各年龄组人群均有感染,以成人感染为重。蒙古族居民感染率最高,为16.67%;汉族感染率为11.56%,高于壮族的8.17%;壮族感染者EPG最高,为1470。职业分布以医生、教师、农民和行政干部感染为重。结论1989年以来广西华支睾吸虫感染率显著上升,疫情快速蔓延,已经成为一个严重的公共卫生问题,应积极开展综合性防治工作。