小鼠骨髓来源树突状细胞对T细胞的活化作用

目的 从小鼠骨髓中体外诱导、扩增树突状细胞(DCs),检测DCs对T细胞的活化作用.方法 从小鼠骨髓中分离单个核细胞(MNCs),在重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落因子(rmGM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导下培养扩增DCs.光学显微镜观察其形态特征,流式细胞仪分析其表型特征,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果 MNCs经过rmGM-CSF、IL-4和TNF-α诱导培养12 d后,具有典型的DCs形态,高表达MHCⅡ类分子、CD11c、CD80、和CD86抗原.具有极强的激发刺激同种异体T细胞增殖的能力.结论 体外诱导、扩增DCs具有极强的激发刺激同种异体T细胞增殖的能力.     

利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞的初步研究

目的 利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞.方法 利用非整合型载体,将四个转录因子:Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc导入脐血来源的造血干/祖细胞(CD34+细胞)重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs),再利用与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养法将其定向分化成CD34+造血干/祖细胞.借助iPSCs可以在体外无限传代、大量扩增的特点,实现体外保存及大量扩增造血干/祖细胞的目的.结果 脐血CD34+细胞可以在体外重编程为非整合型iPSCs,并能够高效定向分化成为CD34+细胞,其分化效率比胚胎干细胞(ESCs)有显著提高.结论 利用诱导性多能干细胞技术体外大量扩增脐血造血干/祖细胞是一个可行的方案,具有良好的应用前景.     

核因子-κB信号通路在尼古丁影响哮喘大鼠树突状细胞表达白细胞介素-12的作用研究

目的研究核因子-κB信号通路在尼古丁影响支气管哮喘大鼠树突状细胞(DCs)表达(IL)-12中的作用,探讨吸烟加重哮喘的病理学机制。方法建立支气管哮喘大鼠模型,体外培养骨髓来源的DCs,采用不同实验条件尼古丁进行干预,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中IL-12蛋白的浓度,观察尼古丁作用的最佳浓度和时间。进一步用NF-κB抑制剂二硫基氨基甲酸吡咯烷(PDTC)干预DCs,免疫细胞化学法测定各组细胞NF-κB的表达,ELISA法测定各组细胞上清液中IL-12蛋白的表达水平,同时进行混合淋巴细胞反应,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测淋巴细胞的增殖活性。结果 (1)与对照组相比,200μg/ml尼古丁组DCs IL-12蛋白表达增加,400μg/ml尼古丁组DCs IL-12蛋白表达减少,差异均具有统计学意义(均P<0.01);(2)以200μg/ml尼古丁分别与DCs孵育0、4、8、12、24及72 h,IL-12蛋白表达在12 h达到高峰,72 h降低,差异均具有统计学意义(均P<0.01);(3)与对照组相比,尼古丁组DCs IL-12蛋白表达增加,PDTC组DCs IL-12蛋白表达减少,差异均具有统计学意义(均P<0.01);与尼古丁组相比,尼古丁+PDTC组DCs IL-12蛋白表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05);(4)与对照组相比,尼古丁组DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力升高,PDTC组DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力降低,差异均具有统计学意义(均P<0.01);与尼古丁组相比,尼古丁+PDTC组DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 NF-κB信号通路在尼古丁诱导DCs表达IL-12中发挥一定作用,这可能是烟雾暴露恶化哮喘气道免疫平衡的机制之一。     

人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题

目的通过细胞形态学观察以及计数法对分离得到的脐血CD34+造血干细胞进行研究,掌握脐血CD34+造血干细胞的生长规律和体外培养方法。方法采用Isolex50免疫磁珠法分离纯化脐血CD34+造血干细胞。在体外扩增培养中,将细胞因子SCF、IL-3、IL-6、G-CSF、EPO组合成不同实验组进行诱导,以检测单个核细胞数和集落形成单位(CFU)的形成率来找到细胞培养较好的细胞因子组合。结果本研究中使用细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子的细胞培养孔,使用此5种细胞因子联合对脐带造血干细胞培养效果最好。结论研究结果表明,不同的细胞生长因子组合会对培养CD34+造血干细胞产生不同的作用效果,对单个核细胞的增殖与扩增有明显的促进作用。     

脐血浆培养的脐血树突状细胞对胃癌细胞的特异杀伤作用

目的尝试用脐血浆代替胎牛血清培养脐血树突状细胞（DCs）,并使之负载胃癌抗原,观察其对胃癌细胞的特异杀伤作用。方法分离脐血单个核细胞（CBMCs）并在含10％同源脐血浆的培养体系中诱导培养,部分细胞加入胃癌冻融抗原冲击。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD1a和CD83表达,MTT法检测DCs体外刺激淋巴细胞增殖活性,LDH法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTLs）对胃癌及肝癌细胞的细胞毒作用。结果CBMCs能分化为表型正常的未成熟DCs,并进而吞噬胃癌细胞冻融抗原成熟,刺激淋巴细胞增殖并诱导对胃癌细胞株特异的CTLs毒性。结论脐血浆培养的脐血DCs能有效捕获胃癌冻融抗原,激发针对胃癌细胞的特异杀伤效应。本实验采用的DCs制备方法具有方法简单、成本较低、瘤苗制备时间较短等优点。     

小鼠树突状细胞体外培养的实验研究

目的研究体外大量扩增小鼠树突状细胞(DCs)的实验方法。方法用细胞因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)]组合体外诱导培养DCs,混合淋巴细胞实验检测DCs的免疫刺激活性。结果培养6-8 d,细胞表面有大量毛刺状突起生长,即DCs;该DCs具有很强的刺激T淋巴细胞增殖的能力,且在T细胞与DCs比值为10∶1时最强。结论 TNF-α、IL-4、GM-CSF组合是诱导体外扩增DCs的较佳方法。     

基泰体外对慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能影响的初步研究

目的:探讨基泰对慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)患者(chronic hepatitis B,CHB)树突状细胞(dentritic cell,DC)生物学性状的影响.方法:分离慢乙肝患者外周血单核细胞,在含GM-CSF/IL-4及不同浓度的基泰培养条件下制备DC.观察DC形态学变化,流式细胞仪(FCM)测其细胞表型分子CD1a,CD83,CD80及HLA-DR的表达,MTT法测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力.结果:与对照组相比,实验组倒置显微镜观察显示出典型的DC形态.基泰(100 μg/mL)处理组的DC膜表面分子CD1a及CD80表达均增高(P<0.05);刺激同种异体淋巴细胞增殖能力(SI)增强(P<0.05).结论:基泰一定程度上可改善CHB的DC免疫学活性.     

系统性红斑狼疮患者外周血造血干细胞水平的改变

目的研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD34 细胞和造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells,HPC)水平与病情发展的关系.方法采用BD FACSAria流式细胞分选仪测定系统性红斑狼疮患者(患者组)外周血中CD34 细胞水平,采用Sysmex(R)XE-2100型血液细胞分析仪测定SLE患者外周血中HPC水平,并设健康体检者对照(对照组).结果患者组在活动期时,CD34 细胞水平(0.178±0.044)%高于稳定期时CD34 细胞水平(0.044±0.020)%,差别有统计学意义(P＜0.01),SLE患者稳定期CD34 细胞水平与对照组CD34 细胞水平(0.038±0.016)%间差异无统计学意义(P＞0.05).复发组CD34 细胞水平(0.210±0.052)%高于未复发组CD34 细胞水平(0.042±0.028)%,差别有统计学意义(P＜0.01).HPC测定显示同样的变化趋势.结论系统性红斑狼疮患者外周血CD34 细胞和HPC的水平变化与病情发展密切相关,监测外周血CD34 细胞和HPC水平可有效地评估SLE患者病情发展和疗效.     

丹柴合剂对树突状细胞的诱导分化作用

目的 研究中药复方制剂丹柴合剂对树突状细胞（DCs）的诱导分化作用,并探讨其机制。方法 制备丹柴合剂的大鼠含药血清。分离人外周血单个核细胞,经磁珠筛选出CD14+单核细胞,培养5-7 d获得未成熟树突状细胞（imDCs）,分为空白血清对照组与含药血清组,空白血清组分别加入含或不含脂多糖（LPS）的大鼠空白血清,含药血清组分别加入含或不含LPS的大鼠含药血清,用流式细胞术检测DCs表面分子CD86、CD11b和HLA-DR的表达,用酶联免疫反应（ELISA）法检测DCs分泌IL-10的情况,用流式细胞术检测DCs对T细胞增殖能力的影响,用实时定量PCR检测吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）基因的表达。结果 经丹柴合剂作用后,DCs高表达CD11b,低表达CD86与HLA-DR,IL-10分泌增加。且该制剂通过促进DCs表达IDO进而抑制DCs介导的T细胞增殖能力。结论 丹柴合剂可将诱导DCs分化为DCregs并发挥免疫调节作用。     

刺梨提取物CL1对胃癌SGC-7901细胞增殖和人脐血CD34+造血干/祖细胞增殖分化能力的影响

目的观察刺梨提取物CL1对胃癌SGC-7901细胞增殖和人脐血CD34+造血干/祖细胞(HSPC)增殖分化能力的影响.方法采用MTT法测定活细胞OD值,计算CL1对胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率.免疫磁珠分选人脐血CD34+造血干/祖细胞,细胞记数、双色直接免疫荧光标记法和流式细胞仪分析细胞增殖分化能力变化.结果MTT检测法显示,0.01～10 μmol·L-1的CL1处理,剂量依赖性和时间依赖性地抑制胃癌SGC-7901细胞生长.经 14 d 的培养,与细胞对照组相比,10、1 μmol·L-1的CL1细胞数有下降趋势,但差异无显著性;表达粒系/单核巨噬系细胞表型CD15和CD11b的细胞百分数无显著差异.经 14 d 的培养,与培养 0 d 比较,CD15显著增高(P＜0.05),CD11b有增高趋势,但无显著性差异.结论CL1对胃癌SGC-7901细胞的体外生长具有抑制作用,但对人脐带血CD34+ HSPC的增殖、和向粒细胞、单核巨噬细胞分化无明显影响,表明CL1在抗肿瘤作用剂量下,不会明显抑制造血干/祖细胞向粒-单细胞的增殖分化,提示CL1可能不会引起明显的造血抑制.     

引流淋巴结树突状细胞对自身肿瘤细胞作用研究

目的　从胃癌患者引流淋巴结中分离和定向诱导培养扩增树突状细胞 (DC) ,观察其经自身肿瘤细胞抗原冲击后对自身细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK细胞 )杀伤活性的影响。方法　取手术切除肿瘤周围转移引流淋巴结 ,提取单个核细胞 ,将贴壁生长的细胞用细胞因子rhGM CSF、rhIL 4、rhTNF α联合诱导培养DC ,然后用自身肿瘤细胞抗原冲击DC并作用CIK细胞 ,最后检测CIK细胞杀伤三种靶细胞 (自身胃癌细胞、K5 6 2和SGC 790 1细胞 )的活性。结果　胃癌患者转移引流淋巴结中的贴壁细胞 ,经细胞因子联合诱导培养 ,DC含量可达 4 5 %。经自身肿瘤抗原冲击的引流淋巴结DC活化的CIK细胞 ,杀伤自身肿瘤细胞活性达 79 3% ,单纯CIK细胞为 33% ,两者比较差异有显著意义 (P <0 0 1) ;而对K5 6 2和SGC 790 1细胞杀伤活性无明显差异。结论　肿瘤周围转移引流淋巴结贴壁细胞在体外能定向诱导扩增出大量DC :DC经自身肿瘤抗原冲击后能明显提高CIK细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。此结果为肿瘤DC的免疫治疗应用奠定了理论基础     

Comparative effect of cadmium on osteoblastic cells and osteoclastic cells

Cadmium(Cd) has been thought to disturb the bone metabolism directly. The mechanism for the bone lesion is unknown, however. To examine the effects of cadmium on bone metabolism, we compared its effects on osteoblasts and osteoclasts in vitro. We used an established cell line, MC3T3-E₁, as osteoblasts and tartrate resistant acid phosphatase (TRACP)-positive multi-nucleated cells (MNC) formed by a bone marrow culture system as osteoclasts. Alkaline phosphatase (ALP) activity was decreased by 10^–7 M Cd and DNA content and hydroxyproline content of osteoblastic cells were decreased by 10^–5 M Cd. Cadmium at 10^–7 M inhibited the osteoclastic cell formation from mouse bone marrow in the presence of 10^–8 M 1,25(OH)₂ vitamin D₃. A 100-fold higher concentration of zinc(Zn) simultaneously added to the cadmium-containing medium prevented the toxicity of cadmium to osteoclastic cells as observed in the culture of osteoblastic cells. These results indicate that both bone formation and bone resorption are inhibited by cadmium. The responses of osteoclasts and osteoblasts to cadmium in this culture system were the same and the responses of cadmium-damaged osteoblasts and osteoclasts to zinc were also similar. These results suggest that another mechanism by which cadmium could cause bone damage should be considered in addition to the specific induction of osteoclastic cells by Cd.     

静脉血管平滑肌细胞中的多倍体细胞分析

目的探讨流式细胞术分析静脉血管平滑肌细胞多倍体细胞的方法和意义。方法选取普通级健康成年日本大耳白兔2只,雄性,8月龄,大约3 kg;普通级SD大鼠2只,雄性,8周龄,大约200 g。人大隐静脉为2例心脏冠状动脉旁路移植术中修补血管所得。在麻醉日本大耳白兔和大鼠后开腹腔获取下腔静脉,采用多种酶组合的消化液消化兔、大鼠以及人的静脉血管得到适合流式细胞检测的静脉血管平滑肌单细胞悬液,用碘化丙啶标记细胞,利用细胞流式仪分析兔、大鼠以及人的静脉血管平滑肌单细胞悬液各5 000个细胞,检测细胞DNA含量,DNA含量翻倍的细胞为多倍体细胞。并利用荧光原位杂交技术（FISH）验证阳性对照HEK293细胞系中的多倍体的存在。结果流式结果显示分析的5 000个细胞中,阳性对照HEK293细胞的多倍体细胞为1 355个（27.1%）,从2例患者中取得的大隐静脉多倍体细胞为310个（6.2%）和250个（5.0%）;2只大鼠的下腔静脉平滑肌细胞中多倍体细胞为360个（7.2%）和450个（9%）;2只兔的下腔静脉平滑肌细胞中多倍体细胞分别为270个（5.4%）和305个（6.1%）。结论成年的静脉血管包括人大隐静脉的平滑肌细胞中普遍存在一定比例的多倍体细胞。     

Reprogramming of B cells into regulatory cells with engineered fusokines

B cells play a pivotal role in host adaptive immunity against pathogenic microorganisms, but may also maladaptively contribute to the pathogenesis of autoimmune diseases. In contrast, distinct B cell subsets have the capacity to regulate host immune response, and suppress inflammation. B regulatory cells are a rare population of endogenous Blymphocytes defined in part by production of the anti-inflammatory cytokine IL-10. Although "natural" B regulatory cells exist in vivo, the low frequency of B regulatory cells may be a limiting factor on their impact in autoimmune ailments. In answer to this unmet need, we have developed a novel strategy for alternate lymphoid activation: fusokines. These wholly engineered chimeric leukines fuse two functionally unrelated cytokines for the purpose of alternate immune modulation. The GM-CSF- and IL-15-derived fusokine: GIFT15, possesses entirely novel and unheralded immune modulating properties mediated through the IL15 receptor which reprograms naive B cells into B regulatory cells (Bregs). In this article, we review the current approaches to generate Bregs in vitro, and highlight gain-of-function mechanisms by which GIFT15- induced Bregs abrogate pathogenic autoimmunity in mice. We also demonstrate that the human equivalent of inducible Bregs may also serve as a new potent therapeutic tool for treatment of autoimmune disease.     

Dendritic cells and T cells in immunotherapy

Autologous cellular immunotherapies have been used experimentally in humans to treat many types of cancer. These therapies are divided into two principal types: active cellular immunotherapies that rely on autologous dendritic cells or other antigen presenting cells; and adoptive T-cell therapies, in which large numbers of antigen-specific T lymphocytes are propagated ex vivo and then infused back into the patient. With the FDA approval of the antigen presenting cell vaccine sipuleucel-T for prostate cancer, active immunization has become an accepted approach for the treatment of established cancer.     

无血清条件下Vero细胞流感病毒的大规模培养

目的 探索在无血清条件下Vero细胞和流感病毒在反应器中的培养条件.方法 采用5 L反应器,接种经无血清适应的不同代次Vero细胞,观察细胞生长情况.以不同感染复数接种流感病毒,观察病毒的生长情况.结果 细胞在反应器中生长繁殖成功,4 d左右达到平台期,增殖倍数为5～16.接种甲型流感病毒后72 h,病毒血凝滴度达到高峰(1/64～1/128).结论 在无血清条件下,细胞和流感病毒都能在反应器中成功培养.     

D609 induces vascular endothelial cells and marrow stromal cells differentiation into neuron-like cells

AIM: To investigate the effect of tricyclodecane-9-yl-xanthogenate (D609) on cell differentiation in vascular endo- thelial cells (VECs) and marrow stromal cells (MSCs). METHODS: Morphological changes were observed under phase contrast microscope. Electron microscope and immunostaining were used for VECs identification. The expressions of neuron-specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) were examined by immunohistochemistry. RESULTS: After 6 h of induc…     

大鼠胰腺干细胞转分化成胰岛细胞的研究

目的 本研究将大鼠胰腺干细胞诱导分化成胰岛细胞,为胰岛移植的临床应用提供可替代资源。方法 大鼠胰腺干细胞经体外培养,免疫组化鉴定CK-19,无血清培养基培养,使其转分化成胰岛,双硫棕染色鉴定。对诱导后胰岛细胞行葡萄糖刺激试验,用RIA法测其胰岛素、C肽的分泌功能并与天然胰岛相比较。结果 胰腺干细胞在体外大量增生,免疫组化显示CK-19阳性,诱导4周后得到胰岛样细胞团,双硫棕染色阳性。检测上清,诱导的胰岛在高糖刺激下胰岛素的分泌量为低糖的5倍;在葡萄糖低浓度（3.8mM）和高浓度（16.5mM）时,诱导的胰岛胰岛素分泌量分别约为天然胰岛的1/28和1/35,C肽分泌量分别为天然胰岛的1/29和1/22。结论 大鼠胰腺干细胞在体外可有效扩增,可转分化为胰岛团,该胰岛团随葡萄糖浓度的高低调节胰岛素。     

华蟾素增强细胞因子诱导的杀伤细胞对肝癌细胞的杀伤活性

目的观察华蟾素对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIKC)的表型变化及其对肝癌的细胞毒作用。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(MNC)培养,收集非贴壁细胞并加入白细胞介素2(IL-2)诱导培养CIKC,将华蟾素加入CIKC,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测CIKC杀伤BEL7402肝癌细胞株的活性。结果CIKC经华蟾素加入培养后,CIKC细胞群的CD3+CD8+,CD3+CD56+细胞比例和杀伤活性较单纯的CIKC更高。结论华蟾素有助于CIKC的细胞毒活性。     

肥大细胞对前列腺癌细胞上皮间质转化的作用

目的利用体外细胞共培养模型,探讨肥大细胞对前列腺癌细胞增殖及侵袭、转移的作用。方法选取肥大细胞瘤P815细胞系及前列腺癌LNCa P细胞,使用24孔Transwell小室构建2种细胞体外共培养模型。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验检测前列腺癌LNCa P细胞的增殖,反转录定量聚合酶链反应(q RT-PCR)方法和蛋白印迹法检测前列腺癌LNCa P细胞E-cad、N-cad、Vimentin的表达。结果前列腺癌LNCa P细胞与不同浓度肥大细胞共同培养12 h后吸光度(A)值变化与对照组差异无统计学意义(P>0.05),共同培养24 h及48h后A值显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,实验组E-cad表达明显减弱;N-cad、Vimentin表达增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肥大细胞可促进前列腺癌细胞的增殖并促进前列腺癌细胞的上皮间质转化,可能促进前列腺癌细胞侵袭、转移。