Ames波动试验和GADD45a-GFP GreenScreen两种快速筛选方法评价大黄素和芫花素的遗传毒性

目的 使用Ames波动试验和GADD45a-GFP GreenScreen两种快速筛选方法,对有毒中药芫花和了哥王的主要单体成分大黄素和芫花素的遗传毒性进行评价。方法 （1）Ames波动试验：在非代谢活化（-S9）和代谢活化（+S9）条件下使用鼠伤寒沙门菌TA100开展基于96孔液态培养法的细菌回复性突变试验,大黄素和芫花素（终质量浓度范围均为0.1~10 μg/mL）与菌液充分混合后在37℃下培养72 h。（2）GADD45a GreenScreen高通量筛选试验：在非代谢活化（-S9）和代谢活化条件下（+S9）将表达GADD45a基因的TK细胞（GenM-T01和GenM-C01）与大黄素（0.13~32.0 μg/mL）和芫花素（0.07~16.0 μg/mL）分别作用48 h（-S9）和3 h（+S9）,之后通过酶标仪和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的荧光强度。结果 有无代谢活化条件下,10 μg/mL大黄素均可诱导TA100的回复性突变率显著性升高（P<0.05、P<0.001）;代谢活化条件下,10 μg/mL芫花素可诱导TA100的回复性突变率显著性升高（P<0.001）,16.0 μg/mL芫花素诱导TK6细胞表达的GADD45a-EGFP荧光强度也超过了遗传毒性阈值（1.3倍）。结论 当前研究提示大黄素和芫花素为可疑遗传毒性,需要开展深入研究明确其遗传毒性及机制。Ames波动试验和GADD45a GreenScreen是良好的高通量筛选备选试验,可极大优化浩繁的药物的毒性筛选工作,尤其适宜诸如中药等成分和配伍复杂的药物。     

DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白的构建表达及特异性细胞毒性研究*

目的构建重组毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,探讨其对过度表达αMSH受体的几种癌细胞的特异杀伤作用.方法利用含有His·Tag和白喉毒素的基因序列作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2的互补序列基因作下游引物,以pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板,PCR扩增得到DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段,插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH.用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白,用结晶紫法检测重组蛋白对几种癌细胞和正常细胞的毒性作用.结果构建了含有His·Tag重组表达质粒pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH;SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45.32×103,其表达量占菌体蛋白总量的29.2%;Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合;细胞活性检测表明重组蛋白对SP2/0,HeLa,A549,A375这4种癌细胞有明显的杀伤作用,4种癌细胞的IC50值分别是3.138,2.736,7.243和4.672 μg·mL-1.结论成功构建了具有生物学活性的重组蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,为进一步的靶向性药物研究奠定了基础.     

GSTM1、GSTT1及GSTP1(rs1695)基因多态性与乳腺癌蒽环和（或）紫杉类药物化疗血液毒性关系的研究

【摘要】目的 研究乳腺癌外周血中谷胱甘肽转硫酶（GST）M1、GSTT1和GSTP1（rs1695）基因多态性与乳腺癌患者采用蒽环类和（或）紫杉类药物化疗发生血液毒性的关系。方法 应用多重PCR技术（M-PCR）和高分辨熔解曲线技术（HRM）检测3个基因在252例女性乳腺癌患者外周血中的基因多态性。结果 采用紫杉类、蒽环联合紫杉类药物化疗,携带GSTP1(rs1695)AG/GG的患者是发生Ⅲ~Ⅳ度中性粒细胞减低的危险因素(OR=6.111, 95%CI1.526~24.469, P＜0.05和OR=9.257, 95%CI2.903~29.522, P<0.01),而GSTM1(+)与GSTM1(-)、GSTT1(+)与GSTT1(-)患者Ⅲ~Ⅳ度血液毒性的发生率差异均无统计学意义;采用蒽环类药物化疗,GSTM1(+)和GSTM1(-)、GSTT1(+)和GSTT1(-)、GSTP1AA和GSTP1AG/GG患者Ⅲ~Ⅳ度血液毒性发生率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 GSTP1(rs1695)基因多态性可作为预测乳腺癌患者采用紫杉类药物化疗发生中性粒细胞毒性的标志。