乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的影响

目的　研究电离辐射对p16基因转录及蛋白表达的影响。方法　采用Northernblot检测p16mRNA水平的变化 ;采用单克隆抗体免疫荧光标记及流式细胞术检测p16蛋白表达的变化。结果　研究证实 ,2 0Gy照射后 2～ 2 4h ,胸腺细胞p16mRNA水平明显增高 ,8～ 4 8hp16蛋白表达显著增高 (P <0 0 5～P <0 0 1) ;照射后 2～ 8h脾细胞p16mRNA水平明显增高 ,2 4hp16蛋白表达显著增高 (P <0 0 5 )。研究还证实 ,0 5～ 6 0Gy照射后 ,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高 ,p16蛋白表达在 1 0～ 4 0Gy组显著增高 (P <0 0 5～P <0 0 1) ;脾细胞p16mRNA水平亦增高 ,但增幅远低于胸腺细胞 ,p16蛋白表达在 1 0～ 4 0Gy组显著增高 (P <0 0 5～P <0 0 1)。结论　电离辐射可诱导p16基因转录及蛋白表达增高 ,其增高幅度表现出一定的细胞异质性。     

电离辐射对胸腺细胞p16/CyclinD/CDK4基因转录和蛋白表达的影响

电离辐射可诱导细胞发生G1期阻滞，其意义在于使受损伤的DNA得以修复，维持细胞基因组稳定性。目前研究发现主要有两条负向调控通路：p53-p21／pRb通路和p16-CyclinD／CDK4-pRb通路在G1→S期转换中起重要作用。以往的实验结果证实p53-p21通路在中等剂量电离辐射诱导的G1期阻滞中起重要作用。然而，电离辐射对体内细胞     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因,克隆至真核表达载体pVR1012中,构建HBV X基因重组表达载体pVR102-X;以该质粒转染HepG2细胞,酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞X蛋白的瞬时表达,与报告质粒pSV-lacZ共转染H G2爱细胞,用试剂盒法检测β-半乳糖苷酶表达活性。结果质粒pVR102-X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白,共转染实验中pVR102-X组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的3．2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活基因2(FTP2)的原核表达载体并诱导其表达,制备多克隆抗体并探讨其在临床病理组织中表达的意义。方法通过PCR获得HCVFTP2基因,将其克隆至原核表达载体pET32a( )上,构建重组表达载体,在大肠埃希菌BL21中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blotting验证后进行大量表达并纯化。将纯化的重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,并将此抗体作为诊断试剂观察其在正常肝组织和临床病理组织中的表达情况。结果以pET32a( )-FTP2表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得大量重组蛋白,分子量约为25kD。将此重组蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,经抗体间接ELISA检测证明,多克隆抗体效价>1:128000,免疫组化显示多克隆抗体能够与丙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌等临床病理组织产生FTP2抗原反应。结论成功表达了HCV的FTP2蛋白并制备了其多克隆抗体,证实FTP2与丙型肝炎、肝硬化的发病机制密切相关。     

骨基质蛋白基因在骨折愈合过程中的表达

骨基质蛋白基因在骨折愈合过程中的表达史炜镔柴本甫在整个骨折愈合过程中，不断有新的细胞外基质蛋白合成，这些蛋白被认为对骨折愈合具有重要的调控作用。现就目前骨折愈合过程中有关细胞外基质蛋白ｍＲＮＡ表达变化方面的研究作一综述，通过对这种骨（软骨）源系细胞表...     

G-CSF受体和EPO受体胞内区蛋白在酵母细胞中的转录激活功能的比较研究

目的 探索应用酵母双杂交系统筛选造血因子受体胞内区结合蛋白的可行性。方法 利用RT-PCR从小鼠NFS-60和BET-2细胞中扩增G-CSF受体和EPO受体胞内区全长序列,并连接至酵母表达载体pGBKT7,转化酵母菌株AH109,提取蛋白进行Western blotting分析,进一步用β-半乳糖苷酶方法检测蛋白转录激活活性。结果 Western blotting结果显示,G-CSF受体和EPO受体在酵母细胞中均可以正常表达。β-半乳糖苷酶检测结果发现,G-CSF受体在酵母细胞中不呈现转录激活功能,然而EPO受体则出现转录激活功能。结论 应用酵母双杂交系统筛选造血因子受体胞内区结合蛋白可适用G-CSF受体研究,但不适用EPO受体,该筛选蛋白的方法并非适用于所有的造血因子受体。     

HBV X蛋白在细胞信号转导中的作用

乙型肝炎病毒 (HBV) X蛋白 (HBx)是 HBV4个开放读框 (ORF)中的 x- ORF编码的一种病毒蛋白 ,为 1 5 4个氨基酸的多肽 ,分子量为 1 7k D。 HBx是一种多功能蛋白 ,虽然HBx发挥其多种功能的机制多数还不是很明确 ,但其对HBV在宿主肝细胞中的复制和诱导细胞的转录、增生以及与肝细胞癌的发生、发展关系非常密切 〔1〕。同时 HBx作为一种转式激活因子 ,在多种顺式作用元件的控制下 ,激活许多病毒和细胞启动子〔2〕,这一点已为多数人所接受。现已明确HBx并不与双链 DNA直接结合 ,其引起的诸多功能均是通过蛋白与蛋白的相互作用实现的。…     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

大鼠糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及功能研究

目的：构建大鼠糖皮质激素受体变异体表达载体，研究其表达和功能。方法：运用RT—nested PCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD结构域的cDNA序列，将PCR产物定向克隆至pEGFP—N2质粒载体，测序筛选重组质粒；荧光显微镜观察重组质粒转染后的表达情况；相对荧光素酶法检测转录激活活性。结果：扩增出长1612bp的cDNA序列，测序证实：克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100％；重组质粒表达产物定位于细胞核；转染组细胞转录激活活性增强。结论：成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体，该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。     

MRE11参与炎症小体信号通路激活的初步研究

目的：探究减数分裂重组蛋白11同系物A（MRE11）在不同刺激物诱导下炎症小体激活中的作用和地位。方法利用不同刺激物,如Poly（I∶C）、Poly（dA∶dT）、E．coli gDNA、293T gDNA和CPPD以及生殖疱疹病毒（HSV）等处理单核巨噬细胞THP-1,通过IL-1β酶联免疫吸附试剂盒（ ELISA）筛选出诱导激活炎症小体的有效刺激物;合成siMRE11干扰小RNA,转染THP-1细胞,免疫印迹检测MRE11干扰下调效率;利用筛选到的阳性刺激物处理MRE11干扰下调的细胞,采用ELISA和免疫印迹方法检测MRE11对细胞分泌炎性因子IL-1β水平和前胱天蛋白酶（pro-caspase）-1切割的影响。结果在MRE11干扰下调的THP-1细胞中,Poly（I∶C）、Poly（dA∶dT）、E．coli gD-NA和293 T gDNA 刺激激活细胞分泌的IL-1β水平以及前胱天蛋白酶-1切割的水平均有不同程度降低。结论MRE11参与由DNA以及RNA刺激激活的炎症小体信号通路。     

CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

目的：热休克蛋白70羧基端作用蛋白（CHIP）是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子。但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达栽体。并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达栽体，以实现这些基因在真核细胞中的高效表达，为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法：从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA，以此为模板，采用逆转录巢式PCR（RT-nested-PCR）获得CHIP全长编码基因，经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tagl中，并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box（-）。结果：钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致，瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论：成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体，为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。     

不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein,HBx）对乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA（pgRNA）和总RNA（pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA）的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。     

电离辐射对T淋巴细胞激活增殖能力的影响

用重组白介素－２、抗淋巴细胞分化抗原决定簇－３、分化决定抗原簇－２单克隆抗体及同种异体单个核细胞作为刺激原，经不同Ｔ细胞激活途径，对急性放射病恢复期患者和体外不同剂量γ射线照射的正常人外周血Ｔ细胞进行特异刺激，以Ｈ３－ＴｄＲ掺入量表示Ｔ细胞激活增殖的程度，发现受照Ｔ细胞的激活增殖能力呈辐射剂量依赖性下降，下降程度依细胞表面接受刺激的位点不同而异，与介导Ｔ细胞激活、增殖的抗原受体、分化抗原决定簇－３、分化抗原决定簇－２及白细胞介素－２受体的辐射敏感性及其质和量的变化有关．     

靶向成纤维细胞活化蛋白PET显像剂的研究进展

成纤维细胞活化蛋白（FAP）在90%上皮肿瘤的肿瘤相关成纤维细胞中过表达,而在正常组织中几乎不表达,因此FAP是肿瘤诊疗的重要靶标。一系列靶向FAP的显像剂在临床前研究PET显像中展现出良好的成像结果,其表现为特异性高摄取和非靶向性低摄取。与氟脱氧葡萄糖显像相比,FAP显像在大多数恶性肿瘤中显示出更高的摄取值和灵敏性。大量的临床研究也逐步开展。靶向FAP的显像剂在多种恶性肿瘤的研究中取得了一定的进展,且有研究证实FAP在部分非肿瘤性疾病（如心肌梗死、免疫球蛋白G亚型4、结核等）中也会有高表达,因此靶向FAP的显像剂也可用于非肿瘤性疾病的诊断。笔者就靶向FAP的PET新型分子探针及其临床转化的研究进展进行综述。     

胰蛋白酶原激活肽和 C-反应蛋白对大鼠急性胰腺炎的诊断价值

目的：探讨血清胰蛋白酶原激活肽（ trypsinogen activation peptide , TAP）和C-反应蛋白（ C-reactive protein , CRP）在大鼠急性胰腺炎（ acute pancreatitis ,AP）发生、发展中的作用。方法将96只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组和AP组,每组48只。假手术组仅打开腹腔翻动胰腺数次后关腹,AP组建立急性胰腺炎动物模型,两组在造模后3、6、12、24 h四个时点分批处死。每只大鼠处死前腹主动脉采血5 ml,取胰腺组织进行HE染色并做病理评分。应用ELISA法定量检测各组大鼠血清TAP和CRP的含量。结果（1）AP组胰腺组织病理评分随造模时间延长明显增高,差异有统计学意义（P＜0．05）。（2）假手术组与AP组造模后同时点比较,TAP水平差异均有统计学意义（P＜0．05）,假手术组各时点间比较,TAP水平均无统计学差异（P＞0．05）,AP组造模后3 h（1．41±0．19）、6 h（2．09±0．33）、12 h（3．16±0．23）、24 h（4．53±0．28）四个时点比较,TAP水平均有统计学差异（P＜0．05）。（3）AP组造模后各时点间比较,CRP 水平均有统计学差异（P＜0．05）。（4）血清TAP（r＝0．942）、CRP（r＝0．926）含量均与胰腺组织病理评分呈高度正相关（r＞0．7,P＜0．05）。结论血清TAP可作为早期诊断急性胰腺炎的可靠指标;对TAP和CRP动态检测可判断AP的严重程度。     

登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的高效表达

目的：在大肠杆菌中对登革2型病毒包膜蛋白B区进行表达，为观察其抗原性和免疫原性奠定基础。方法：将通过PCR扩增的登革2型病毒包膜蛋白B区插入高效原核表达栽体pBAD／Topo ThioFusion，然后在大肠杆菌中利用阿拉伯糖进行诱导表达。时表达产物以免疲印迹和ELISA法进行检测。结果和结论：登革2型病毒包膜蛋白B区在大肠杆菌中的表达产物以可溶性形式存在，表达量约占细菌可溶性总蛋白的62％。表达产物可与登革2型病毒的特异多抗反应，但与登革1、3和4型病毒的特异多抗无交叉反应。登革2型病毒包膜蛋白B区可在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。     

p53凋亡刺激蛋白2在HepG2215细胞中通过抑制自噬来发挥抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)对乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）和乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen,HBeAg）表达的影响。方法 HepG2.215细胞用3-甲基腺嘌呤处理来抑制自噬,或用人ASPP2重组腺病毒感染来诱导ASPP2过表达,或转染GFP-LC3质粒后观察绿色LC3-Ⅱ颗粒（自噬标志物）的变化。酶联免疫吸附测定检测培养上清和胞内HBsAg和HBeAg的水平、免疫荧光检测LC3-Ⅱ颗粒的水平、免疫印记检测自噬相关蛋白的水平、免疫沉淀检测ASPP2与自噬相关蛋白的结合。结果 ASPP2过表达明显下调了绿色LC3-Ⅱ颗粒的水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比例、以及明显上调p62的水平,说明ASPP2过表达可抑制HepG2.215细胞的自噬。但是ASPP2并非通过抑制Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相关基因的表达来抑制自噬,而是通过与Atg14结合来抑制Atg14与Beclin-1的结合,阻断自噬体膜的形成,从而抑制自噬。抑制自噬和ASPP2过表达均导致培养上清和细胞内的HBsAg和HBeAg水平明显下调,表明在Hep2.215中,ASPP2通过抑制自噬来抑制HBsAg和HBeAg的产生。结论 ASPP2通过抑制自噬的作用具有抗乙型肝炎病毒感染的潜力。