银杏二萜内酯葡胺注射液原料中5种微量银杏酸的LC-MS/MS含量测定研究

该实验建立了同时测定银杏二萜内酯葡胺注射液原料中5种微量银杏酸含量的LC-MS/MS方法。采用Agilent Zorbax Eclipse plus C₁₈色谱柱(3.0 mm×50 mm,1.8 μm);流动相甲醇-0.2%甲酸水(95 : 5),等度洗脱;流速0.5 mL·min^-1;质谱条件:采用ESI^-多反应监测(MRM)模式扫描。结果显示,5种银杏酸在0.2~36.0 μg·L^-1线性关系均良好(r≥0.999 5);银杏酸C13 : 0(白果新酸),C15 : 1,C17 : 2,C15 : 0,C17 : 1的最低定量限(LOQ)分别为0.18,0.18,0.21,0.10,0.20 μg·L^-1;平均回收率在73.28%~87.56%;3批样品中所含总银杏酸的质量分数为0.023~0.028 μg·g^-1,均远低于药品注册标准规定的限度(含总银杏酸以白果新酸计,不得过百万分之二)。该方法简便、快捷,灵敏度高,可用于银杏二萜内酯葡胺注射液原料中5种微量银杏酸的快速测定。     

抗银杏二萜内酯葡胺注射液蛋白的单克隆抗体制备

目的 制备抗银杏二萜内酯葡胺注射液蛋白的单克隆抗体。方法 将银杏叶总蛋白进行二维电泳,取蛋白点进行质谱分析并合成多肽。利用多肽作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选抗银杏二萜内酯葡胺注射液蛋白的单克隆抗体。结果 5株单克隆抗体亚类鉴定均为IgM,轻链为Kappa链。Western blotting实验证实单抗均能与银杏叶蛋白反应。结论 单克隆抗体的制备为快速检测银杏二萜内酯葡胺注射液蛋白的方法建立奠定了基础。     

银杏二萜内酯葡胺注射液的脑血管保护作用研究

采用颈内动脉插入尼龙线栓来制作大鼠左侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,检测给药14 d后的各组大鼠行为学评分、脑梗死面积、脑含水量、EB溢出量、凝血四项及脑组织occludin,MMP-9表达的差异,研究在前期实验中对脑缺血性损伤具有明显保护作用的银杏二萜内酯葡胺注射液的保护作用是否与降低血脑屏障通透性、降低出血风险有关,并探讨其可能的作用机制。实验发现银杏二萜内酯葡胺注射液在24 h能有效缓解MCAO引起的行为学病变,降低行为学评分,改善脑组织水肿,减少EB溢出率,降低长期给药可能造成的出血倾向,明显减少模型大鼠缺血侧脑组织occludin的缺失,下调MMP-9的表达。以上结果表明银杏二萜内酯葡胺注射液对抗脑缺血有明显效果,其治疗作用的发挥可能主要依赖于降低血脑屏障通透性从而改善脑水肿。     

银杏二萜内酯葡胺注射液活性炭吸附工艺的优选

以银杏内酯A,B,K转移率为综合评价指标,选取活性炭加入量、吸附时间、搅拌速度和吸附温度为影响因素,采用正交试验设计方法,同时采用基于信息熵的综合评价方法,筛选银杏二萜内酯葡胺注射液活性炭吸附工艺,确定最佳活性炭吸附工艺为活性炭加入量为0.2%,吸附温度为25℃,搅拌速度为40 r·min^-1,吸附时间为30 min,验证试验结果显示,优选得到的工艺稳定、可行,为银杏二萜内酯葡胺注射液的活性炭吸附工艺提供了依据。     

LC-MS结合HPLC-DAD对银杏二萜内酯葡胺注射液原料中黄酮类成分的限度检测方法研究

该实验采用LC-MS对银杏二萜内酯葡胺注射液原料中所含黄酮类成分的种类进行筛选,通过紫外-可见分光光度法(UV-Vis)和高效液相色谱法(HPLC-DAD)对银杏二萜内酯葡胺注射液原料中黄酮类成分限量检查灵敏度比较,发现HPLC-DAD的检测限约为UV-Vis的1/100,即HPLC-DAD检测灵敏度更高。基于LC-MS筛选结果选用槲皮素、山柰素和异鼠李素为对照品,采用Agilent Eclipse plus C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);0.4%磷酸-甲醇(50:50)为流动相,等度洗脱;流速1.0 mL·min^-1;检测波长360 nm。结果显示,此法专属性、精密度、重复性良好;槲皮素、山柰素和异鼠李素检测限分别为27.6,22.3,29.5 μg·L^-1;平均回收率在88.3%~91.7%;基于10批次样品检测结果和仪器灵敏度,最终确定银杏二萜内酯葡胺注射液原料中总黄酮醇苷的含量不得过2×10^-5。该方法简便、快捷,可操作性好,可用于银杏二萜内酯葡胺注射液原料中黄酮类成分的限度检测。     

LC-MS/MS分析银杏二萜内酯葡胺注射液在人尿液中的代谢产物

目的:研究银杏二萜内酯葡胺注射液在人尿液中的主要代谢产物及其代谢途径。方法:3名受试者静脉滴注银杏二萜内酯葡胺注射液后收集0~6 h的尿样,分别按酸化和不酸化样品处理后,以液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对样品进行分析。采用ACE C_(18)-AR色谱柱(4.6 mm×150 mm,3μm),酸性HPLC条件流动相Ⅰ为乙腈-0.4%甲酸铵水溶液(p H3.2)梯度洗脱,中性HPLC条件流动相Ⅱ为乙腈-水梯度洗脱,流速0.7 m L·min~(-1)。通过比较空白尿样和给药后尿样的总离子流和提取离子流色谱图以及各个色谱峰的保留时间、准分子离子和二级碎片离子,分析银杏内酯A(GA),银杏内酯B(GB)和银杏内酯K(GK)在人体内可能的代谢产物。结果:除原型药外,共鉴定了12个代谢产物,其中GA相关的代谢产物有6个,包括5个Ⅰ相和1个Ⅱ相代谢产物;GB相关的有4个,包括1个Ⅰ相和3个Ⅱ相代谢产物;GK相关的有2个,包括1个Ⅰ相和1个Ⅱ相代谢产物。结论:GA在人体内主要的代谢途径为羟基化和内酯环水解,并可进一步共价结合成硫酸酯;GB主要的代谢途径为羟基化和内酯环水解,并可进一步共价结合成硫酸酯、葡萄糖醛酸苷或谷胱甘肽结合物;GK在人体内主要的代谢途径为甲基化葡萄糖醛酸结合反应。     

银杏二萜内酯葡胺注射液治疗 急性脑梗死疗效观察

目的:观察银杏二萜内酯葡胺注射液治疗急性脑梗死的临床效果。方法:将急性脑梗死患者112例随机分为研究组和对照组,对照组采用舒血宁注射液治疗,研究组采用银杏二萜内酯葡胺注射液治疗,比较2组患者治疗前后血清神经烯醇化酶(NSE)及超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平、生活质量、智能、日常生活能力及临床疗效。结果:治疗后,研究组患者血清NSE、hs-CRP浓度低于对照组(P0.01),生活质量、MMSE评分及总有效率高于对照组(P0.01),ADL评分较对照组降幅更大(P0.01)。结论:银杏二萜内酯葡胺注射液可有效促进神经功能恢复,总有效率优于舒血宁注射液。     

银杏二萜内酯葡胺注射液治疗卒中恢复期的临床研究

目的 探究银杏二萜内酯葡胺注射液对卒中恢复期血管内皮功能、血液流变学、神经功能缺损及中医证候积分的影响.方法 对2017年6月-2018年6月在该院神经内科收治的100例脑卒中患者,分别将患者随机分为对照组(n=50)和观察组(n=50).对照组给予西医进行常规治疗;观察组在西医常规治疗的基础上加用银杏二萜内酯葡胺注射...     

评价银杏二萜内酯葡胺注射液联合针灸治疗脑卒中偏瘫的效果观察

目的：观察银杏二萜内酯葡胺注射液联合针灸治疗脑卒中偏瘫的效果。方法：选取2020年10月—2021年12月我院收治的90例脑卒中偏瘫患者作为研究对象,随机分为常规治疗组和联合治疗组,每组45例。比较两组治疗后的中医证候积分（头晕头痛、口眼歪斜、肢体麻木）、干预后的BI评分和FMA评分以及对医疗工作的满意率。结果：治疗后,联合治疗组头晕头痛、口眼歪斜、肢体麻木积分均出现明显下降且低于常规治疗组;该组BI评分和FMA评分均高于常规治疗组,对于医疗工作的满意率更高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：相比仅接受常规的对症治疗,采取银杏二萜内酯葡胺注射液联合针灸的方法对脑卒中偏瘫进行治疗能够在一定程度上提高治疗效果,改善各项中医证候积分,同时能够提高生活能力,对于治疗工作的满意率更高,获得广泛好评。可见该联合治疗方案的临床优势更高。     

平衡透析法、超滤法结合液质联用技术比较测定注射用复方荭草中黄酮类成分的血浆蛋白结合率

目的:测定注射用复方荭草中黄酮类成分的人血浆蛋白结合率,为临床安全用药及血浆蛋白测试方法研究提供依据。方法:以超高效液相色谱-质谱联用为检测手段,采用平衡透析法、超滤法考察荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮苷等黄酮类成分与血浆蛋白的结合情况,并比较二者的差异。结果:注射用复方荭草在人血浆中质量浓度为5～100 mg.L-1时,荭草素、牡荆素、木犀草苷、槲皮苷等黄酮的结合率较强且无浓度依赖性,两种测定方法牡荆素和木犀草苷存在统计学差异(P<0.01)。结论:建立的平衡透析法、超滤法均能够满足血浆蛋白结合率测定的要求,两种方法所测定的部分指标存在差异。     

HPLC-ELSD 法测定注射用银杏二萜内酯中甘露醇和葡甲胺的含量

目的：建立注射用银杏二萜内酯中甘露醇和葡甲胺含量测定方法。方法：采用HPLC-ELSD法,以乙腈-50 mmol·mL-1 乙酸铵为流动相,色谱柱Waters XBridge Amide（4.6 mmx150 mm,3.5 μm）;梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1;柱温30℃;漂移管温度90℃,氮气流速2.0 L·min-1。结果：甘露醇在1.966 5~19.665 μg 范围内呈良好线性关系,平均回收率为100.57%（RSD=0.92%,n=9）;葡甲胺在0.483 8~4.638 μg 范围内呈良好线性关系,平均回收率为100.67%（RSD=0.72%,n=9）。结论：该方法简便准确,重复性好,可作为测定注射用银杏二萜内酯中甘露醇和葡甲胺的含量测定方法。     

超滤法测定丹酚酸A的血浆蛋白结合率

目的:建立血浆样品中丹酚酸A浓度的分析方法,并测定丹酚酸A的血浆蛋白结合率,为进一步展开丹酚酸A的代谢和药动学研究及指导临床用药提供参考。方法:采用超滤法和HPLC测定丹酚酸A在牛血清白蛋白(BSA),大鼠血浆,新西兰兔血浆和比格犬血浆中的蛋白结合率。结果:丹酚酸A在0.01～2.5 mg.L-1线性良好,标准曲线方程为Y=0.807 3X+0.013 2(r=0.999 4)。丹酚酸A与BSA,大鼠血浆,新西兰兔血浆和比格犬血浆在5.0,50.0,100.0 mg.L-1的含药血浆中其平均蛋白结合率分别为(99.79±0.02)%,(99.79±0.03)%,(99.73±0.06)%,(99.81±0.03)%。结论:所建立的方法灵敏度高,专属性和重复性好,操作简单,能够满足定量分析测试要求。丹酚酸A与血浆蛋白有很强的结合,且在已考察的血药浓度范围内其血浆蛋白结合率无明显浓度依赖性和种属差异性。     

超滤法测定表没食子儿茶素没食子酸酯人血浆蛋白结合率

 目的测定表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)的人血浆蛋白结合率。方法采用超滤法对EGCG的血浆蛋白结合率进行测定。结果当质量浓度为5.0,10.0,20.0 mg·L^-1时,EGCG平均血浆蛋白结合率分别为86.1%,91.4%,94.9%。结论EGCG与人血浆蛋白具有较强的结合。     

大鼠血浆中的银杏内酯B的液相色谱-电喷雾串联质谱法测定

目的 建立快速、灵敏、简单的液相色谱-串联质谱( LC-MS/MS)法测定大鼠血浆中的银杏内酯B.方法 血浆样品经乙酸乙酯液-液萃取后,采用Symmetry C18(3.9 mm×150 mmID,5μm)柱分离,以甲醇-乙酸铵溶液(10 mmol·L-1) (85:15,V/V)为流动相,流速为0.8 ml·min-1.采用电喷雾离子化源(ESI)三重四级杆串联质谱,在负离子多反应监测(MRM)模式下进行检测.结果 血浆中银杏内酯B的线性浓度范围为1.0～200 ng·ml-1,定量下限为1.0ng·m1-1,日内、日间精密度(RSD)均小于4.88％,准确度(RE)在±2.61％范围内.未观察到GB明显的基质效应.结论 该方法操作简便、快速、灵敏度高,分析时间短,适用于银杏内酯B的大鼠药代动力学研究.     

白头翁皂苷D与不同血浆蛋白的结合率测定

目的：研究白头翁皂苷D与不同血浆蛋白的结合率。方法：采用HPLC与平衡透析法相结合的方法测定白头翁皂苷D与牛血清、人血浆及大鼠血浆中蛋白的结合率,COSMOSIL 5C₁₈-MS-Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相甲醇-水-甲酸（80：20：0.02）,检测波长203 nm。结果：白头翁皂苷D质量浓度为0.06,0.11,0.25 g·L^-1时与牛血清白蛋白的结合率分别为（78.45±0.89）%,（77.61±1.14）%,（77.16±0.29）%,与人血浆蛋白的结合率分别为（68.91±0.54）%,（67.68±0.87）%,（67.88±0.71）%,与大鼠血浆蛋白的结合率分别为（78.15±0.76）%,（78.61±0.97）%,（78.24±0.93）%。结论：建立的白头翁皂苷D蛋白结合率测定方法简便、稳定、可靠。白头翁皂苷D是一种中等程度的蛋白结合药物,结合率不具有质量浓度依赖性。     

丹参素、丹酚酸B与不同血浆蛋白结合率的测定

目的:建立测定丹酚酸B和丹参素与大鼠、牛血清白蛋白(BSA)、人血浆蛋白结合率的方法,比较丹酚酸B和丹参与不同血浆蛋白结合率的差异。方法:采用UPLC测定丹酚酸B和丹参素含量,流动相乙腈(A)-1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0~2 min,18%A;2~3 min,18%~30%A;3~6 min,30%A),检测波长280 nm。通过平衡透析法考察丹酚酸B和丹参素与不同血浆的蛋白结合率。结果:丹酚酸B和丹参素在3种不同血浆中线性范围均为2~200 mg·L-1,透析外液均为0.5~20 mg·L-1。丹酚酸B在大鼠、人血浆和BSA中的平均血浆蛋白结合率分别为90.60%,92.25%,87.55%;丹参素在大鼠、人血浆及BSA中的平均血浆蛋白结合率分别为35.44%,37.71%,33.49%。结论:不同质量浓度的丹酚酸B和丹参素在同一种血浆中的蛋白结合率无显著性差异,丹酚酸B与3种血浆蛋白结合率较丹参素高。     

液质联用超滤法测定注射用复方荭草中原儿茶酸、异荭草素及野黄芩苷的血浆蛋白结合率

 目的 测定注射用复方荭草中原儿茶酸、异荭草素及野黄芩苷的血浆蛋白结合率,为临床安全用药提供参考。方法 以超高效液相色谱-质谱联用为检测手段,结合超滤离心法,由于基质背景的差异分别建立血浆样本及超滤液中的含量测定方法考察原儿茶酸、异荭草素及野黄芩苷与血浆蛋白的结合情况。结果 注射用复方荭草在人血浆中浓度为5~100 μg·mL-1时,原儿茶酸、异荭草素及野黄芩苷与血浆蛋白的平均结合率分别为（65.33±0.61）%,（85.97±0.43）%,（90.09±0.28）%。结论 原儿茶酸与血浆具有中等强度的结合,异荭草素及野黄芩苷与血浆结合力较强,它们与血浆蛋白结合能力在考察的浓度范围内无浓度依赖性。建立的方法灵敏度高,重现性好,操作简单,能够满足定量分析测试要求。     

银杏二萜内酯葡胺注射液对缺血性脑卒中小鼠黑质脑区的调控机制研究

目的 研究银杏二萜内酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection,DGMI）在C57BL/6J小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型黑质脑区中抗脑缺血再灌注损伤的潜在作用通路。方法 C57BL/6J小鼠按随机数字表分为假手术组、模型组、DGMI（25 mg/kg）组及银杏叶提取物761（Ginkgo biloba extract-761,EGb-761,100 mg/kg）组,构建MCAO模型,通过测定各组小鼠术后24 h的改良版神经功能缺损评分和脑梗死率,评价DGMI相较于EGb-761治疗缺血性脑卒中的疗效。进一步利用Illumina二代测序平台对各组小鼠脑组织黑质样本进行高通量转录组测序,并结合基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的基因本体（gene ontology,GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析等生物信息学分析方法,评价DGMI抗脑缺血再灌注损伤作用及潜在作用机制。采用qRT-PCR验证转录组测序中关键基因表达。结果 与假手术组比较,模型组改良版神经功能缺损评分和脑梗死率显著升高（P＜0.001）;与模型组比较,DGMI组治疗效果与EGb-761接近,可显著改善改良版神经功能缺损评分和脑梗死率（P＜0.01、0.001）。转录组的数据降维分析显示,模型组与假手术组样本显著分离。GSEA结果显示,模型组与假手术组对比显著富集35条通路,DGMI组相较于模型组可有效逆转7条通路。与假手术组相比,模型组共筛选出88个DEGs,将其与他人发现的大小鼠MCAO模型组共同差异基因比较（15个）,有10个基因相同。模型组GO功能分析主要富集在炎症和细胞趋化等过程,KEGG通路分析主要富集在细胞因子互作、肿瘤坏死因子等信号通路。与模型组相比,DGMI组DEGs的GO功能分析主要富集在神经信号传导过程,KEGG通路分析主要富集在多巴胺能信号通路、神经活性受体配体作用等。qRT-PCR验证与转录组结果基本一致。结论 DGMI可有效抵抗脑缺血再灌注损伤,发挥作用的关键基因及信号通路主要集中于抗炎、调节神经突触等生物学过程,可能通过改善多巴胺能通路治疗损伤。