人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较

背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系.目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09,2009-02在中国科学院昆明动物所完成.材料:清洁级孕12.5～13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供.方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×10~4/cm~3接种在明胶包被的6孔板中.取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子.主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间.结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Sct-4,但不表达SSEA-1.与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P<0.05),倍增时间明显延长(P<0.05).结论:人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异.     

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道.目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成.材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司.方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7 d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1:3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2 mmol/L glutamine、1%非必需氨基酸、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、ITS(×1)、10~6 U/L青霉素、100 mg/L 链霉素、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12 μg/L转化生长因子β1组成.②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层.将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养.主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率.结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20 d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY).与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P＜0.05),集落分化率明显升高(P＜0.05).结论:实验初步建立了入胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新.     

利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系

背景：目前人胚胎干细胞建系的技术路线主要有囊胚法、核移植法和胚胎单卵裂球法，但由于破坏胚胎，涉及诸多伦理问题。目的：探讨利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系的可行性。设计、时间及地点：细胞学体内外实验，于200501／200608在沈阳市妇婴医院生殖中心完成。材料：妊娠13．5d的ICR鼠20只用于制各小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，10周龄SICD鼠2只用于人胚胎干细胞体内分化实验。行IVF／ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎，由沈阳市妇婴医院生殖中心提供。方法：复苏冷冻的胚胎，采用序贯培养法进行囊胚培养，用免疫外科方法去除滋养细胞，将得到的胚胎内细胞团接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养并传代。主要观察指标：取不同代次的培养细胞，分别进行生长特性、碱性磷酸酶染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内分化全能性鉴定。结果：20个解冻卵裂期胚胎，获得9个囊胚，分离完整的内细胞团共7个，从7个内细胞团培养出2个人胚胎干细咆系，其中一个细胞系连续培养76代（20个月）。所培养的细胞具有人胚胎干细胞的共同生物学特性，即细胞呈扁平或圆形，可见1—3个核仁：碱性磷酸酶以及SSEA．3，SSEA．4，TRA-1．81，TRA-1-60，OCT-4均呈阳性表达，而SSEA-1呈阴性：核型正常，为46，XX核型；将细胞注射入SCID鼠皮下形成肿瘤，病理切片显示为成熟畸胎瘤：短串联重复分型结果显示所形成的畸胎瘤与人胚胎干细胞为相同的遗传背景。结论：实施体外受精-胚胎移植的夫妇怀孕后，多余的冷冻保存胚胎所分离培养的细胞具备人胚胎干细胞的所有特性，是建立人胚胎干细胞系很好的材料来源。     

染色体16三体人胚胎干细胞系的建立

背景:研究显示部分人胚胎干细胞系存建系或体外培养过程中出现染色体异常的现象,建立染色体异常的人胚胎干细胞系.可分析染色体对人胚胎干细胞特性的影响.目的:拟建立染色体异常的人胚胎干细胞系.设计、时间及地点:细胞学体内外观察.于2006-10/2008-02在南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心完成.材料:冷冻人胚胎由南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心提供,4周龄NOD-scid鼠1只及ICR胎鼠成纤维细胞由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供.方法:将人冷冻胚胎解冻后,置于囊胚培养基中微滴培养,胚胎发育至扩张囊胚期时分离囊胚中的内细胞团,以ICR胎鼠成纤维细胞作为饲养层,机械法传代,建立的人胚胎干细胞系命名为NJGLChES2.主要观察指标:对10代以后的细胞进行核型分析,选择核型异常的人胚胎干细胞系鉴定其碱性磷酸酶和特异性标记物的表达.通过体外类胚体形成实验及体内畸胎瘤成瘤实验观察其分化能力.结果:NJGLChES2人胚胎干细胞系核型分析结果呈16号染色体三体(47,XX,+16),呈人胚胎干细胞克隆样生长,碱性磷酸酶和胚胎特异性标记物OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的表达均为阳性.体外悬浮培养的NJGLChES2人胚胎干细胞可形成囊状拟胚体,体内接种至NOD-scid鼠腹股沟皮下后在接种部位可形成畸胎瘤,肿瘤组织含有来源于鳞状上皮、横纹肌和呼吸道黏膜上皮3个胚层的多种细胞类型.结论:成功建立16号染色体三体人胚胎干细胞系NJGLChES2,可长期稳定增殖并保持未分化状态,且在体内外具有多向分化潜能.     

成纤维细胞生长因子支持人胚胎干细胞在无饲养层中的生长(英文)

背景:人胚胎干细胞是一种全能型细胞,可以分化为3个胚层的组织,目前国内对其无饲养层生长的研究较少.成纤维细胞生长因子是维持胚胎干细胞不分化状态的重要因子.目的:探讨长期培养过程中不同质量浓度成纤维细胞生长因子对人胚胎干细胞未分化状态和全能性维持的影响.方法:两株人胚胎干细胞在鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养3代,分别转移到含100,160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中培养8代.从培养皿中移出胚胎干细胞,用IV胶原酶消化聚集成团的细胞,观察细胞分化状态和全能性情况.收集传8代后的胚胎干细胞,种植于SCID小鼠体内.对所得细胞做形态学评估,并进行碱性磷酸酶染色、表面标记免疫组化检测、RT-PCR检测OCT-4的表达、体内致瘤情况.结果与结论:在含160,250 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中,两株人胚胎干细胞可以保持原有性状,即细胞克隆呈圆形,核质比较高,中间大片区域为未分化细胞,周围为分化细胞;呈碱性磷酸酶强阳性表达;表达OCT-4转录因子蛋白;细胞表面标志SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81均呈阳性表达;聚集成团的胚胎干细胞培养10 d后形成拟胚体;种植于SCID小鼠体内可得含3个胚层组织的畸胎瘤.含100 μg/L成纤维细胞生长因子的鼠胚胎成纤维细胞条件培养基不足以维持人胚胎干细胞的长期增殖,4代以后大部分细胞分化死亡.提示成纤维细胞生长因子质量浓度达160 μg/L以上时,可以单独支持人胚胎干细胞的体外稳定增殖,且不影响细胞分化状态和全能性.     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提.目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系.方法:从孕12.5～14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3～5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达.结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长.染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性.实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养.     

胚胎干细胞与胚胎生殖细胞的生物学特性及应用前景

目的:分析胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的生物学特性、体外培养条件、周围微环境对其增殖分化的影响,了解胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的关系和应用前景。方法:应用计算机检索万方数据库2000/2007有关生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞的相关研究文章,检索词:生殖细胞,胚胎干细胞,胚胎生殖细胞,并限定文章语言种类为中文;同时应用计算机检索PUBMED2000/2006相关文章,检索词:Germ Cells,Primordial germ cells,Embryonic stem cells,Embryonic Germ Cells,限定文章语言种类为“English”。对资料进行初审,纳入标准为有关生殖细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞的生物学特性、体外培养及生长抑制因子的作用等相关文章,并查找全文。主要选择基础研究类文章,无论有无对照组均纳入。结果:共检索到相关文章59篇,排除比较陈旧的文章,最后纳入38篇进行总结分析。胚胎干细胞与胚胎生殖细胞分别从附置前早期胚胎内细胞团和早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞分离克隆出来,均具有自我更新、无限增殖能力及多向分化潜能,在体外培养条件下可保持稳定的二倍体核型,诱导分化后可形成3种胚胎生殖层。饲养层细胞是人胚胎生殖细胞体外培养的必要条件,常用饲养层细胞有鼠STO细胞系、鼠胚胎成纤维细胞,体外生长所需主要细胞因子包括干细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和白血病抑制因子,然而只要在培养基中加入鼠成纤维细胞的上清液和碱性成纤维细胞生长因子,胚胎干细胞可在无饲养层的条件下进行体外培养。结论:胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有相似的增殖特性,一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞,并可相互转变,在胚胎发育、基因治疗、药物筛选、新药开发、生殖医学及人类疾病的移植治疗中具有广泛的应用前景。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

体外培养人胚胎干细胞饲养层的研究进展

人胚胎干细胞在体外培养过程中始终保持未分化和持续增殖能力的首要条件是要有饲养层的支持。目前常用的饲养层有小鼠成纤维细胞、小鼠原代成纤维细胞、同源动物胚胎成纤维细胞、人包皮成纤维细胞等。饲养层细胞能分泌多种细胞因子、细胞问黏附分子及蛋白质,能有效抑制胚胎干细胞的分化并促进其增殖。现就胚胎干细胞培养过程中所需饲养层细胞的来源与筛选、分泌物及作用机制研究进展作一综述。     

小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态

目的:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题,观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态.方法:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.①对象:包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1, 1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.③实验评估:观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态.并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.结果:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1∶3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④体外分化实验:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.