抑制素的研究进展

一、PHB基因抑制素(prohibitin,PHB),1989年由MeClung等[1,2]首先克隆出哺乳动物的PHB基因。PHB基因广泛存在于哺乳动物、植物、果蝇、酵母、原虫及细菌等各种生物中。基于与酵母抑制素序列的相似性,人抑制素被划分为两个家族,即PHB1和PHB2。在各种生物中至少有PHB1和PHB2的两个复制。PHB1是作为肿瘤抑制因子而被逐渐认识的,并且有抗细胞增殖活性[1]。然而进一步的研究[2]表明,这种抗肿     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

[目的]山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。[方法]利用PCR点突变方法改造山蛭素基因，将山蛭素基因克隆到pGEM-Teasy载体中，对重组质粒测序，构建了毕赤酵母表达载体pPIZB-Hs，然后转化有活性的GS115酵母菌株，筛选表达酵母菌株GS115，摇瓶发酵。[结果]改造的山蛭素基因在重组酵母中表达，重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。[结论]利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因，并能在毕赤酵母中表达。     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

【目的】山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。【方法】利用PCR点突变方法改造山蛭素基因 ,将山蛭素基因克隆到pGEM Teasy载体中。对重组质粒测序 ,构建了毕赤酵母表达载体 pPIZB Hs ,然后转化有活性的GS115酵母菌株 ,筛选表达酵母菌株GS115 ,摇瓶发酵。【结果】改造的山蛭素基因在重组酵母中表达 ,重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。【结论】利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因 ,并能在毕赤酵母中表达     

生存素与细胞周期和凋亡

在细胞凋亡调控中，IAPs家族越来越受到人们的关注。IAPs家族蛋白既可抑制caspases的活化，又可抑制caspases酶的活性。Survivin(生存素)是新近发现的哺乳动物IAP。1997年由耶鲁大学的Altieri等利用杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列-1(EPR-1)基因cDNA作为探针筛选人基因组文库，得到一个与其编码区序列高度互补的基因，这就是Survivin。它独     

人用植物疫苗的研究进展

目前基因重组疫苗产品的宿主载体通常为细菌、酵母和哺乳动物细胞。随着基因工程技术的快速发展，植物转基因技术的日趋成熟，植物已成为基因重组生物制品的重要表达载体。     

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。     

杆状病毒表达系统的发展

真核细胞表达系统包括昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞表达系统。而昆虫细胞表达系统，即杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector Systems，BEVS），以其表达量大、可携带较大的基因片段和表达产物功能活性好等方面的优越性而得到了广泛的应用。该系统以杆状病毒为载体，可以用于表达有应用价值的外源基因，也可利用基因工程技术将外源基因引入杆状病毒基因组，生产增强杀虫能力的杆状病毒杀虫剂，     

自噬基因Beclinl的研究现状

Beclin1基因也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。大量研究表明beclin1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对肿瘤发生、发展起着重要作用。目前，beclin1已被确定为一个新的候选抑癌基因。本文就beclin1基因研究的现状进行综述。     

Prohibitin蛋白与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的初步研究

目的:研究转染pshRNA/prohibitin (PHB)的RNA干扰对卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的生物学特性的影响.方法:采用Western印迹及实时PCR方法验证卵巢癌紫杉醇耐药细胞株(SKOV3/Taxol-25)和敏感细胞株(SKOV3)中PHB蛋白与mRNA的表达差异.以脂质体Lipofectamine2000为载体,将针对PHB基因设计的带有荧光蛋白的三靶特异性小发夹RNA干扰片段,即pshRNA/PHB427 (PHB1实验组)、pshRNA/PHB248 (PHB2实验组)、pshRNA/PHB136 (PHB3实验组)瞬时转染耐药细胞株,另设阴性对照组.转染48 h后,用Western印迹及实时PCR方法检测PHB蛋白与mRNA的表达情况,筛选出沉默效果明显的两个片段(PHB1及PHB3)为实验组,与阴性对照组进行后续实验.用MTT及流式细胞术检测实验组及对照组的细胞增殖、紫杉醇IC50及凋亡情况.结果:耐药细胞株中PHB蛋白相对表达量及mRNA相对表达量(2-ΔΔct)明显高于敏感细胞株(P＜0.05).PHB1和PHB3实验组的蛋白相对表达量及mRNA相对表达量(2-ΔΔct)较阴性对照组明显降低(P＜0.05).转染48 h及72 h后PHB1及PHB3实验组细胞的增殖较阴性对照组明显减慢(P＜0.05);干扰后72 h各实验组紫杉醇IC50较干扰前明显下降(p＜0.05);转染48 h后PHB1及PHB3实验组细胞凋亡率较阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论:针对PHB合成的shRNA能有效抑制耐药细胞株中PHB基因表达,沉默PHB基因后耐药细胞株的细胞增殖能力下降,凋亡率增加,对紫杉醇敏感性增加,提示PHB与卵巢癌紫杉醇耐药相关,干扰PHB基因的表达可能降低卵巢癌紫杉醇耐药性.     

控制转基因表达的细胞香序专一性

应用双重系统能够控制细胞和动物体内转基因表达的时空专一性，有利于分析基因功能和表达调节。病毒、细菌和酵母的调节系统可能用以控制哺乳动物细胞的基因表达。由此 双重率过外源激活物结合专一位置，刺激增强子／启动子，抑或经过外源重组酶识别和工除含位置和介入顺序，由此激活原来静止靶基因，引导 组织细胞和发育时期专一表达。这种方法能克服导入毒性基因致使小鼠患病早死等困难。     

BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用

目的：应用酵母双杂交方法筛选BRCA2相互作用蛋白编码基因，验证其相互作用并研究其功能联系。方法：以BRCA2基因3′端片段构建酵母双杂交质粒，筛选正常人乳腺上皮细胞cDNA库，获得编码相互作用蛋白的基因，采用免疫共沉淀、哺乳细胞双杂交和荧光酶测定等方法进一步验证蛋白间相互作用和功能联系．结果：采用酵母双杂交系统筛选，获得了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因，其中包括已知的FHL2蛋白；免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交试验显示BRCA2和FHL2在体内特异性结合，并证实FHL2在体内形成同源二聚体；转录活性分析发现BRCA2与FHL2有协同转录激活作用。结论：发现BRCA2与FHL2蛋白间相互作用和功能联系，为BRCA2功能研究提供了新的方向。     

水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的:构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得重组水蛭素蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础. 方法:根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子,设计HV1编码基因,分为8条寡核苷酸片段进行DNA合成,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,得到pPIC9K-HV1,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1168,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合. 结果:获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K-HV1,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中. 结论:成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化HV1蛋白及其临床应用奠定了基础.     

乙型肝炎病毒PreS1蛋白与初期多肽相关复合体α亚单位特异性结合的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreSl蛋白与人类初期多肽相关复合体α亚单位(nascent-polypeptide-asso-ciated complex alpha polypeptide,NACA)之间的结合作用.方法 采用交合实验验证PreS1蛋白和NACA在酵母细胞内的结合作用,利用离体结合实验证实二者在体外的结合作用,免疫共沉淀实验证实二者在哺乳动物细胞中的特异性结合.结果 携带NACA基因的酵母同携带preS1基因的酵母交合后发生反应,LacZ活性检测菌落旱现蓝色,离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带,提示PreS1蛋白和NACA在体外存在直接相互作用,免疫共沉淀实验在13×lO~3处出现蛋白条带,提示在哺乳动物细胞水平仍能榆测到PreS1蛋白和NACA的特异结合.结论 NACA与PreS1蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合,推测NACA可能通过与PreS1蛋白的结合影响病毒黏附及反式激活等过程.     

乙型肝炎病毒PreSl蛋白与初期多肽相关复合体α亚单位特异性结合的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreSl蛋白与人类初期多肽相关复合体α亚单位(nascent-polypeptide-asso-ciated complex alpha polypeptide,NACA)之间的结合作用.方法 采用交合实验验证PreS1蛋白和NACA在酵母细胞内的结合作用,利用离体结合实验证实二者在体外的结合作用,免疫共沉淀实验证实二者在哺乳动物细胞中的特异性结合.结果 携带NACA基因的酵母同携带preS1基因的酵母交合后发生反应,LacZ活性检测菌落旱现蓝色,离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带,提示PreS1蛋白和NACA在体外存在直接相互作用,免疫共沉淀实验在13×lO~3处出现蛋白条带,提示在哺乳动物细胞水平仍能榆测到PreS1蛋白和NACA的特异结合.结论 NACA与PreS1蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合,推测NACA可能通过与PreS1蛋白的结合影响病毒黏附及反式激活等过程.     

甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素Ⅱ的影响

目的：考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素Ⅱ表达的影响。方法：在摇瓶和IOL发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母，测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素Ⅱ的表达。结果：发酵培养基中初始甘油浓度为5g／L时，毕赤酵母生长速度明显加快；补料过程中甘油浓度大于70g／L时，毕赤酵母生长受到抑制。与不加甘油相比较，诱导表达期维持培养基中甘油浓度在5g/L以下，重组水蛭素表达可提前4h，诱导30h其活性达13000 ATU／ml，比仅用甲醇诱导时效价提高了7．7％。结论：降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长，补料过程中培养基甘油浓度应维持在押制毕赤酵母生长的浓度之下，诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达.     

水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究

目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达,以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列,选择酿酒酵母偏爱的密码子,设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段,进行人工合成,并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后,将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连,并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ,经鉴定表明,获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中,检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。     

血管生成抑制素治疗血管瘤的研究

目的：观察血管生成抑制素治疗血管瘤的效果。方法发酵毕赤酵母工程菌组成型表达重组血管生成抑制素,用SP-Sepharose Fast Flow (阳离子交换剂)柱进行蛋白纯化;通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成试验和诱发血管内皮细胞凋亡试验,分析重组血管生成抑制素的生物学活性,在血管瘤模型(公鸡肉垂)中注射血管生成抑制素,分析血管生成抑制素对血管瘤的药效。结果血管生成抑制素在毕赤酵母中高效表达,经过纯化,收获达98%的重组血管生成抑制素;重组血管生成抑制素具有抑制CAM血管生成和诱发血管内皮细胞凋亡的活性;重组血管生成抑制素与血管瘤模型作用14 d后,瘤体血管生长抑制率为51%(P<0.01),血管瘤增殖抑制率为39%(P<0.05)。结论成功制备重组血管生成抑制素药物,血管生成抑制素对于血管瘤模型具有显著的药效。     

控制转基因表达的细胞和时序专一性

应用双重系统能够控制细胞和动物体内转基因表达的时空专一性，有利于分析基因功能和表达调节。病毒、细菌和酵母的调节系统可能用以控制哺乳动物细胞的基因表达．由此建立的双重系统经过外源激活物结合专一位置，刺激增强子／启动子，抑或经过外源重组酶识别和切除含重组位置的介入顺序，由此激活原来静止靶基因，引导组织细胞和发育时期专一表达．这种方法能克服导入毒性基因致使小鼠患病早死等困难。     

LPIN 1基因的最新研究进展

磷脂酸磷酸水解酶（Lipid phosphate phosphohydrolase）基因，也称为脂素基因（LPIN），是新近发现的一个可以双向调控机体脂肪代谢的一个基因家族。这个基因家族包括LPIN 1、LPIN 2、LPIN 3（哺乳动物），其中LPIN 1基因是调控脂肪组织形成与分化的关键基因，LPIN 1基因表达具有影响脂肪沉积的效应，LPIN 1基因的不表达、正常表达、过量表达均能引起脂肪沉积的剧烈变化。本文主要从LPIN 1基因的结构和功能等方面对LPIN 1基因的最新研究进展进行了简要综述。     

抗增殖蛋白抑制转化生长因子-β1诱导的肾脏成纤维细胞增殖和表型改变

目的 研究抗增殖蛋白（prohibitin,PHB）在肾间质纤维化发生中的作用。方法（1）检测48例原发性肾小球肾炎患儿肾组织中PHB蛋白表达,并比较其与肾小管间质损伤程度的相关性。（2）观察PHB在大鼠肾脏成纤维细胞（NRK-49F）中亚细胞定位,以Western印迹和RT-PCR测定NRK-49F受到转化生长因子B1（TGF-β1）刺激后PHB表达的变化。（3）构建PHB表达质粒并转染,观察PHB对NRK-49F细胞周期以及表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白质和mRNA的影响。结果 （1）PHB蛋白主要表达于肾间质细胞和肾小管上皮细胞的胞质,随肾小管间质损伤程度加重而逐渐减弱（组间比较,均P〈0．01）,PHB表达量与肾小管间质损伤程度显著负相关（r=-0．802,P〈0．01）。（2）激光共焦显微镜下见PHB主要分布于NRK49F的细胞质,细胞核亦有较弱表达。TGF-β1刺激后PHB蛋白和mRNA表达均下调,呈现时间和剂量依赖关系（组间比较,P〈0．01）。（3）成功构建PHB真核表达质粒,转染48h细胞中PHB蛋白量升高约2．54倍（与未转染组比较,P〈0．01）。（4）转染PHB基因明显抑制TGF—β1所诱导的细胞增殖,使更多的细胞处于G0／G1期（与TGF-β1组比较,P〈0．01）,而对未受刺激的细胞无影响（P〉0．05）。（5）转染PHB基因明显抑制TGF—β1所诱导的α-SMA蛋白质和mRNA表达（与TGF-β1组比较,P〈0．01）,而对α-SMA基础表达无影响（与TGF-β1组比较,P〉0．05）。结论 PHB在肾组织中的表达水平可以反映肾小管间质损伤程度．外源性PHB显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和表型改变。