K562细胞survivin基因表达对淋巴细胞增殖和功能的影响

目的探讨K562细胞中survivin基因的表达对淋巴细胞增殖和功能的影响。方法将融合重组质粒pEGFP-C1-survivin和靶向survivin基因的RNAi的重组质粒pTZU6^＋1-survivin分别转染K562细胞,得到K562/survivin^＋和K562/survivin^-2种细胞,用G418筛选K562/survivin^＋细胞,用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法及免疫细胞化学法检测K562/survivin^＋和K562/survivin^-2种细胞中survivinmRNA及蛋白水平的表达,并与K562细胞作对照。将这3种细胞与健康人外周血单个核细胞（PBMC）混合培养（MLTC）,检测混合培养体系中淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性及培养上清中IFN-γ水平。结果K562/survivin^＋组的淋巴细胞增殖指数明显低于其余两组。survivin基因的表达水平与NK细胞活性呈负相关。混合培养上清中分泌的IFN-γ,K562/survivin＋组是K562组的1/4.5,是K562/survivin^-组的1/8。结论高表达的survivin可以抑制淋巴细胞的增殖、NK细胞活性及IFN-γ的分泌。     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术，研究cyclin E基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclin E mRNA设计siRNA序列，经PCR方法体外扩增，得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物．以Lipofectamine^TM 42000脂质体法转染K562细胞，分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组，转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测，观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比，活细胞计数减少约80％，G1期细胞百分比增高30％，细胞基本停止增殖。干扰组cyclin E mRNA表达明显减弱，相对阴性对照组及空白对照组，干扰组mRNA表达下降70％。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclin E基因的表达，并进一步抑制细胞的生长，但对于干扰的长期有效性尚无实验结论，需通过长效表达载体实验验证．     

cyclin E基因siRNA抑制K562细胞生长的研究

目的 应用RNAi技术,研究cyclinE基因小干扰RNA(siRNA)对K562细胞生长的抑制作用。方法 针对cyclinEmRNA设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,以LipofectamineTM2000脂质体法转染K562细胞,分别设置为干扰组、阴性对照组以及空白对照组,转染48h后进行细胞计数、RT-PCR及通过PI染色进行流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 干扰组与阴性对照组和空白对照组相比,活细胞计数减少约80%,G₁期细胞百分比增高30%,细胞基本停止增殖。干扰组cyclinEmRNA表达明显减弱,相对阴性对照组及空白对照组,干扰组mRNA表达下降70%。阴性对照组与空白对照组无显著性差异。结论 应用RNAi技术可以有效地干扰cyclinE基因的表达,并进一步抑制细胞的生长,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需通过长效表达载体实验验证。     

Chk1基因沉默增强K562/A02细胞对阿霉素敏感性的实验研究

目的研究Chk1基因沉默对人红白血病耐药细胞株K562/A02(耐阿霉素)生长的影响,探讨Chk1在白血病细胞耐药中的作用。方法通过电穿孔转染法将特异性靶向Chk1的短发卡状RNA(shRNA)导入K562/A02细胞,应用RT-PCR、Weston-blot检测细胞内Chk1的表达,经阿霉素作用后,流式细胞术(FCM)检测其细胞周期分布及细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖。结果与对照组和空载体转染组相比,shRNA使细胞中Chk1 mRNA水平下降了66%,蛋白水平下降了60%。抑制Chk1的表达可解除阿霉素引起的G2/M期阻滞;使阿霉素诱导的细胞凋亡率由转染前的(5.67±0.78)%上升到(19.25±1.41)%;在阿霉素浓度为0.4 mg/L、4 mg/L时,细胞的增殖活性分别下降12%、20%。结论靶向Chk1 shRNA有效地抑制了Chk1的表达,阻断了细胞周期检测点信号传导通路,从而增强了K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,有可能为临床上克服白血病的化疗耐药提供新的作用靶点及治疗途径。     

RNA干扰survivin基因对Eca-109细胞体内增殖的影响

目的利用RNA干扰抑制Eca-109细胞survivin基因表达,观察survivin沉默后对食管癌细胞Eca-109体内增殖的影响。方法构建靶向survivin基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,利用LipofectamineTM2000脂质体转染Eca-109细胞,建立稳定转染干扰组细胞Eca-109/si-survivin;同法建立阴性对照组细胞Eca-109/si-control,并以Eca-109为空白对照组细胞;通过Western blot检测survivin基因沉默效果;借助裸鼠移植瘤模型分析survivin干扰前后裸鼠成瘤时间及瘤结节质量的改变,比较各组Eca-109细胞的体内增殖速度;通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术法检测移植瘤细胞凋亡的变化。结果干扰组细胞survivin蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组细胞survivin蛋白表达与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠平均瘤结节质量显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠的平均瘤结节质量差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤细胞凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达,诱导细胞凋亡,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的体内增殖。     

survivin反义寡核苷酸对K562细胞增殖的抑制作用

目的:采用反义寡核苷酸技术研究凋亡抑制基因survivin对白血病细胞增殖的影响.方法:1.细胞抑制率实验分5组:111nmol/L反义寡核苷酸组、333nmol/L反义寡核苷酸组、555nmol/L反义寡核苷酸组、777nmol/L反义寡核苷酸组、空白组.转染后24、48、72h收集细胞进行检测:用台盼蓝染色进行活细胞计数,计算细胞抑制率.2.细胞周期及survivin蛋白表达实验分4组:555 nmol/L寡核苷酸组、544nmol/L无义组、脂质体组、空白组,转染后24、48h流式细胞仪检测细胞周期;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平.结果:不同浓度的反义寡核苷酸对K562细胞的细胞抑制率均高于空白组(P<0.05),并随反义寡核苷酸的浓度增大抑制率增加;随作用时间延长,抑制作用越明显,抑制率与浓度及时间呈正相关;555nmol/L反义寡核苷酸作用后,K562细胞被阻滞在G0/G1期,细胞周期进程受到明显阻滞,而无义、脂质体、空白组细胞周期进程无明显变化(P<0.05);反义寡核苷酸作用48h后survivin蛋白表达水平明显降低,与各对照组比较有显著性差异(P<0.05).结论:survivin反义寡核苷酸能抑制K562细胞的增殖.     

CD40反义RNA对K562细胞的影响

目的 探讨ＣＤ４０反义ＲＮＡ对肿瘤传代细胞Ｋ５６２细胞株的影响。方法 用本室构建的ＣＤ４０反义ＲＮＡ转导Ｋ５６２细胞，结果 发现转导反义ＲＮＡ后Ｋ５６２细胞体积缩小，代谢变慢，光镜下见细胞核固缩或碎裂成块状，其ＤＮＡ电泳呈梯状断裂现象，用ＣＤ４０基因特异性引物和寡苷酸探针进行ＲＴ－ＰＣＲ和Ｓｌｏｔｂｌｏｔ方法检测，发现Ｋ５６２细胞为ＣＤ４０基因阳性。结论 Ｋ５６２细胞为ＣＤ４０基因阳性细胞，受ＣＤ     

小干扰RNA对白血病细胞K562的生长和蛋白表达的影响

目的:检测小干扰RNA对慢性粒细胞白血病细胞系K562的影响。方法:脂质体转染细胞,MTT实验检测转染后的细胞活性,并绘制生长曲线,用Western blot检测p210蛋白表达水平的变化,并用Annexin-V-FITC法检测细胞凋亡水平。结果:与对照组相比,有2条小干扰RNA序列可以有效地降低细胞活性,诱导细胞凋亡并降低p210蛋白的表达水平。结论:小干扰RNA可抑制K562细胞活性,降低融合蛋白表达水平并诱导细胞,有望成为治疗慢性粒细胞白血病的有效方法。     

微RNA对K562细胞基因表达谱的影响

目的 应用基因芯片技术,研究微RNA（miR-18la）对人白血病K562细胞基因表达谱的影响。方法 针对miR-18la成熟序列设计并合成miR-181a RNA duplexes,采用OligofectamineTM脂质体法转染K562细胞。应用Agilent HumanlA寡核苷酸基因芯片,检测和分析对照组与微RNA转染组间的基因表达谱差异。结果 从20173个候选基因中,筛选出228个差异表达基因。与对照组K562细胞比较,表达上调的基因有59个,主要有代谢相关基因、抑癌基因、信号转导相关基因、免疫防御相关基因等;表达下调的有169个,主要有原癌基因、DNA结合与转录因子、代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞周期及发育相关基因等。RT-PCR技术验证了CTCF、ZAP70、SEMA4C和RALA4个基因表达的变化。结论 微RNA转染K562细胞48h后,影响了细胞内一系列基因的表达。这些基因可能与微RNA的功能相关,同时也是转录后水平上抑制基因表达的调控方式实现的基础。这为进一步深入研究微RNA的功能及其具体的作用机制提供了重要的线索和依据。     

β-catenin特异的RNA干扰对Jurkat和K562细胞的作用

目的干扰β-catenin在Jurkat和K562细胞中的表达,探讨β-catenin对细胞生长、增殖和凋亡等方面的作用。方法设计合成β-catenin的siRNA干扰序列和对照序列,阳离子脂质体法介导转入Jurkat和K562细胞,分别用RT-PCR和Western blot方法检测β-catenin在干扰后mRNA水平和蛋白水平的表达变化。采用台盼兰拒染法计数,MTT比色法和集落形成能力检测细胞的生长增殖,AnnexinV/PI检测细胞凋亡以及PI染色检测细胞周期。结果与对照组相比,实验组细胞β-catenin的mRNA和蛋白水平的表达均降低。在Jurkat细胞,实验组和对照组的细胞增殖抑制率分别为(49.30±9.86)%和(15.10±6.55)%(P<0.05),而在K562细胞分别为(39.40±7.56)%和(10.10±6.89)%(P<0.05),实验组细胞生长明显受抑。在Jurkat细胞,实验组和对照组的集落形成率分别为(25.00±5.13)/104细胞和(31.90±5.55)/104细胞(P<0.05),而在K562细胞分别为(39.33±6.26)/104细胞和(47.33±8.52)/104细胞(P<0.05),实验组细胞集落形成能力明显减弱。在Jurkat细胞,实验组和对照组的细胞凋亡率分别为(55.90±2.22)%和(23.50±2.82)%(P<0.05),而在K562细胞分别为(27.90±15.30)%和(14.90±8.54)%(P>0.05),实验组细胞凋亡率有所增加。在这两种细胞系中均未发现细胞周期的改变。结论β-catenin基因有可能对Jur-kat和K562细胞具有促进细胞生长、增殖,抑制凋亡的作用。     

siRNA对人红白血病细胞株（K562／ADM）阿霉素耐药性的影响

目的：研究小分子干扰RNA片段（small interfering RNA，siRNA）对人红白血病细胞株（K562／ADM）细胞mdr1基因表达及功能的影响，探索一新的耐药的逆转途径。方法：siRNA根椐GeneBank已知序列设计，在脂质体介导下转染K562／ADM细胞：用流式细胞仪检测K562／ADM细胞Pgp的表达及细胞周期的改变；用TUNEL法检测其凋亡；用MTTT检测其对阿霉素ADM的敏感性。结果：siRNA转染后K562／ADM细胞Pgp的表达明显下降，凋亡率明显提高，对阿霉素ADM的敏感性明显提高。结论：siRNA有效逆转了mdr1介导的耐药性，不失为一种新型、有效的肿瘤耐药逆转途径。     

RNAi重组体抑制白血病K562细胞系中NPM1基因的表达

目的 构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用.方法 采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1 mRNA水平.设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链.再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组.采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平.结果 白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA.针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1 mRNA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达.结论 白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调.     

STAT3基因沉默抑制人白血病细胞体外生长的实验研究

目的:构建人STAT3 shRNA(short hairpin RNA)慢病毒载体,研究慢病毒介导的STAT3 SiRNA(small interferenceRNA)对人慢性粒细胞白血病K562细胞体外生长特性的影响。方法:针对STAT3基因RNAi有效靶点构建STAT3 shRNA慢病毒载体,293T细胞内包装产生STAT3 SiRNA慢病毒,感染K562细胞后RT-PCR和Western-blot方法验证STAT3基因的敲减效率;细胞生长曲线和MTT法观察STAT3敲减后K562细胞体外生长和增殖情况;流式细胞术和Annexin V-FITC/PI法检测细胞周期改变和早期凋亡。结果:成功得到STAT3 SiRNA慢病毒,RT-PCR和Western-blot实验证实,针对其中两个靶点的STAT3 SiRNA对STAT3基因的敲减效率均在70%以上(P<0.05)。STAT3敲减后,K562细胞生长变慢,细胞增殖活性降低40%(P<0.05);细胞阻滞于G1→S期,并出现早期凋亡。结论:STAT3 SiRNA慢病毒可有效抑制K562细胞内STAT3基因表达,使细胞生长增殖受抑,细胞周期阻滞,细胞出现早期凋...     

K_（562）细胞及K_（562）／ADM耐药细胞内cAMP及cGMP含量的测定

测定正常人淋巴细胞内环磷腺苷（ｃＡＭＰ）、环磷鸟苷（ｃＧＭＰ）含量和人红白血病细胞株（Ｋ５６２）及其耐阿霉素细胞株（Ｋ５６２／ＡＤＭ）的增殖状况和细胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ含量。结果Ｋ５６２与Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞内ｃＡＭＰ含量均低于正常人淋巴细胞内ｃＡＭＰ，但无显著差异，Ｋ５６２与Ｋ５６２／ＡＤＭ之间细胞内ｃＡＭＰ的含量有显著差异，ｃＧＭＰ含量均未见差异。Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞的增殖状况与ｃＡＭＰ含量呈负相关（ｒ＝－０．５８２３，Ｐ＜０．０５），加入逆转耐药的药物潘生丁、维拉帕米后，其增殖速度下降且差异显著（Ｐ＜０．０５），ｃＡＭＰ含量呈上升趋势；Ｋ５６２细胞也有此改变，但两种药物对两种细胞的影响程度不同。     

Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.     

小檗碱对K562细胞生长的抑制作用

目的探讨小檗碱对Ｋ５６２细胞生长的抑制作用及对阿霉素（ＡＤＭ）耐药株Ｋ５６２／ＡＤＭ的影响。方法细胞抑制率和细胞生长曲线测定采用台盼蓝排染法，克隆形成实验采用半固体培养基培养，镜下计数。结果Ｋ５６２细胞经小檗碱处理后生长明显受抑，呈作用时间和剂量依赖性，ＩＣ５０为２７．２（２４ｈ），４．６９（４８ｈ），１．２２（７２ｈ）ｍｇ／Ｌ。细胞增殖速度显著降低，２０ｍｇ／Ｌ达完全抑制。克隆原细胞存活曲线呈指数型，可超过２个指数杀灭。小檗碱对Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞有较强耐药性。结论小檗碱对Ｋ５６２细胞生长具有明显抑制作用，提示其可能作为抗肿瘤药。