人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。     

重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体的构建

目的构建重组人骨形态发生蛋白7(hBMP7)的腺相关病毒(AAV)载体。方法通过RT-PCR方法,从HEK293细胞中扩增hBMP7全长cDNA并亚克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV。将pSNAV-hBMP7质粒DNA转染BHK-21细胞,筛选出携带hBMP7的AAV载体细胞株—BHK-21细胞。用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2按MOI=0·1感染BHK-21载体细胞株后收获病毒液,通过氯仿—PEG/NaCl沉淀—氯仿抽提纯化病毒。结果所克隆的hBMP7全长cDNA经测序证实和已知hBMP7序列完全一致。通过用能表达Rap和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2感染携带hBMP7基因的AAV载体细胞株BHK-21细胞的方法获得了滴度为2×1012vg/ml、纯度达99%的重组人骨形态发生蛋白7的腺相关病毒载体(AAV-hBMP7)。结论RT-PCR方法从HEK293细胞中扩增克隆hBMP全长cDNA是一种有效可行的方法。成功地构建了高滴度、高纯度的AAV-hBMP7载体,为进一步体内及体外研究基因治疗促进骨愈合提供了有力的工具。     

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。     

表达脑啡肽基因的单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的构建、包装和扩增

目的对单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒装载脑啡肽基因,并进行包装和扩增后,评价其在疼痛的转基因治疗上的作用.方法将pCMVHPPE质粒中的人前脑啡肽原基因插入单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒pHSVIRESlacZ,再用单纯疱疹病毒温敏株辅助在BHK-21细胞中包装、扩增,通过检测lacZ的表达反映扩增子病毒滴度.结果酶切鉴定证实重组子构建成功,重组扩增子质粒的包装、扩增由BHK-2l细胞的形态变化和X-gal原位检测载体lacZ的表达证实,扩增子假型病毒滴度达1×106TU/ml.结论本研究构建、包装、扩增的携带外源脑啡肽基因的假型病毒有较高感染性,这种扩增子病毒可作为疼痛基因治疗的实验研究的有力工具.     

2型重组腺相关病毒/增强型绿色荧光蛋白转染胰腺癌细胞PANC-1的体外研究

基因治疗的关键是目的基因的高效转染和表达。我们采用2型重组腺相关病毒（rAAV2／EGFP）对人胰腺癌细胞PANC-1进行体外基因转移，观察EGFP基因能否在PANC-1中有效表达及其细胞毒性，探讨rAAV2介导目的基因转导胰腺癌细胞的效率。[第一段]     

腺相关病毒载体介导的TIMP1对人退变腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖的影响

目的:探讨腺相关病毒(Adeno-associated virus;AAV)载体介导的基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1;TIMP1)对人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法:单层培养并鉴定人退变腰椎间盘髓核细胞.采用绿色荧光蛋白标记的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)检测其对髓核细胞的转染效率.应用构建的rAAV2-TIMP1转染髓核细胞;通过细胞形态学观察、35S标记氨基酸整合法检测rAAV2-TIMP1对人退变腰椎问盘髓核细胞基质合成的影响.在35S检测中;以未转染的退变髓核细胞做为正常对照组.结果:光镜下观察所培养的细胞类型以成纤维样细胞为主;Ⅱ型胶原免疫组化和番红O染色鉴定培养细胞为髓核细胞.AAV转染人退变腰椎间盘髓核细胞的转染效率为12%.35S标记整合法检测rAAV2-TIMP1转染组每分钟计数值为341.43±42.85;正常对照组为224.20±29.26;两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:TIMP1能够促进退变椎间盘髓核细胞蛋白多糖的合成.     

重组腺病毒相关病毒作为肝癌基因治疗载体的初步研究

目的 探讨重组腺病毒相关病毒（rAAV）的制备以及作为肝癌基因治疗载体的可行性。方法 重组报告基因加强的绿色荧光蛋白（EGFP）基因至质粒载体pSub201,用双质粒共转染方法制备重组腺病毒相关病毒颗粒（rAAV/EGFP),观察其对肝癌细胞系的感染性。结果 用常规的双质粒共转染方法制备高产量的rAAV(10^7-10^8感染单位／10cm板）;当病毒感染多重性（MOI）＝100时,rAAV/EGFP对肝癌细胞HepG2的转染效率可达100％。结论 重组腺病毒相关病毒可有效地转导外源基因至肝癌细胞,其作为肝癌的基因治疗载体具有较好的研究前景。     

肝癌特异性p53基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建一种肝癌细胞靶向性的腺相关病毒载体以用于肝癌的促凋亡基因治疗的研究。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物,选择地从人基因组中出入甲胎蛋白（α－fe-toprotein,AFP）启动子序列并克隆以真核表达载体pTR－UF5上;再通过平端连接的方法,构建成含甲胎蛋白启动子和人野生型p53基因的重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）质粒rAAV－AFP－53和绿色荧光蛋白基因GFP（green fluorescence protein）的质粒rAAV－AFP－GFP。结果 成功地构建了以腺相关病毒为载体、受人甲胎蛋白启动子调控表达人野生型p53基因的质粒系统。结论 从理论上说,我们构建的重组腺相关病毒质粒rAAV－AFP－p53,可以特异性地转染到肝癌细胞中从而为肝癌基因治疗提供一种有效手段。     

携带Vasohibin基因的8型重组腺相关病毒的制备及在肌肉组织中的表达

目的克隆Vasohibin基因，包装制备成8型重组腺相关病毒，感染肌肉组织，并观察其在肌肉组织中的表达。方法以Vasohibin基因全长cDNA为模板，应用聚合酶链反应（PCR）方法扩增出Vasohibin基因，采用三质粒磷酸钙共转染HEK293细胞，包装制备成8型重组腺相关病毒，感染小鼠（6只）肌肉组织，免疫组织化学方法检测Vasohibin基因的表达，肌肉组织内染有棕色信号者为阳性。结果成功克隆Vasohibin基因，并制备成8型重组腺相关病毒，感染肌肉组织后实验组小鼠肌肉组织切片呈现广泛棕黄色阳性信号，阳性率为100％（6／6），对照组呈阴性（0／6），未见有阳性表达。结论8型重组腺相关病毒能够有效介导Vasohibin基因在小鼠肌肉组织中的表达。     

rAAV2-CTGF和TIMP1双基因联合转染恒河猴退变腰椎间盘的生物学效应

目的 研究腺相关病毒(adeno-associated virus 2,AAV2)介导的结缔组织生长因子(con-nective tissue growth factor,CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinas-es 1,TIMPl)双基因体内转染退变的恒河猴腰椎间盘的生物学效应.方法 恒河猴9只,雌性4只,雄性5只;年龄4～7岁,体重4.5～7 kg.CT引导下经皮穿刺纤维环诱导恒河猴腰椎间盘退变,微创经皮注入携带CTGF和TIMP1双基因腺相关病毒颗粒.应用RT-PCR测定细胞因子的表达,RT-PCR、35S整合法观察双基因联合转染对退变椎间盘的生物学作用.结果 双基因转染后8、16、24周时CTGF mRNA表达量分别为PBS对照组的10.02、2.39、0.91倍;TIMP1 mRNA表达量分别为PBS对照组的6.08、3.81、2.67倍;Ⅱ型胶mRNA表达量分别为PBS对照组的145.51%、174.72%、113.73%;蛋白多糖mRNA表达量分别为PBS对照组的461.19%、191.46%、301.39%;蛋白多糖合成效率为分别PBS对照组的455.06%、285.97%、165.58%.结论 CTGF和TIMP1双基因联合转染后可以在体内较长期表达,并能促进体内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,延缓椎间盘的退变.     

Recombinant adeno-associated virus vector for gene transfer to the transplanted rat heart

Efficient durable viral vector transduction of the transplanted heart remains elusive. This study assesses the potential of recombinant adeno-associated virus (rAAV) mediated gene delivery to the transplanted rat heart. rAAV serotype 1, 2 and 5 vectors encoding the green fluorescent protein (GFP) gene (1 x 10(11) viral particles/ml) were diluted in cold University of Wisconsin solution and circulated through the coronary vasculature of the donor organs for 30 min before syngeneic rat heterotopic heart transplantation was performed. Study 1: animals (n = 5 each serotype) were killed at 21 days post-transplant to evaluate the efficiency of GFP transduction using RT-PCR and expression by fluorescence microscopy. Study 2: using rAAV-1, animals (n = 5 each group) were killed at 7, 21 and 84 days to evaluate the durability of GFP expression. The maximum cardiac GFP expression at 21 days was observed in rAAV-1. GFP expression by rAAV-1 was detectable at 7 days, improved at 21 days, and was still evident at 84 days. This study demonstrates cardiac rAAV gene transduction with a cold perfusion preservation system of the donor heart. These data show that AAV-1 is superior to AAV-2 and AAV-5 for this purpose and that durable expression is achievable.     

重组腺相关病毒介导的血红素加氧酶1基因和绿色荧光蛋白基因在肝移植大鼠肝脏中的表达

目的 构建提纯重组腺相关病毒介导的血红素加氧酶1基因(HO-1)和绿色荧光蛋白基因(GFP),并探讨其在肝移植大鼠肝脏中的表达情况.方法 克隆大鼠HO-1,构建重组腺相关病毒-HO-1(rAAV-HO-1)载体,酶切鉴定并进行测序,氯化钙共沉淀法与辅助质粒Virus helper、AAV-cap-rep转染包装细胞,应用肝素层析柱法纯化浓缩病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度.应用二套管法建立Wistar→Wistar大鼠原位肝移植模型.将提纯的重组腺相关病毒-GFP(rAAV-GFP)在供肝冷保存阶段经门静脉靶向转染并孵育2 h后行大鼠原位肝移植,分别于术后1、3个月处死大鼠取材,冰冻切片荧光显微镜下观察不同组织GFP的表达情况及转染效率.结果 rAAV-HO-1重组子经酶切电泳检测表明插入片段大小正确,测序结果与Genbank一致.rAAV-GFP靶向转染供肝1、3个月冰冻切片荧光显微镜下观察,移植肝GFP表达效率均＞80%,且在心、肺、脾、肾、肠等组织中未见报告基因的表达.结论 成功构建并提纯了携带HO-1、GFP基因的高滴度的腺相关病毒,验证了腺相关病毒介导的GFP在肝移植大鼠肝脏中稳定高效的表达.     

重组腺相关病毒载体表达抗表皮生长因子受体抗体对胰腺癌细胞株抑制作用的研究

目的 构建能在体内长期表达抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体的重组腺相关病毒(rAAV)载体,观察其对人胰腺癌细胞株的抑制作用.方法 将抗人EGFR单链抗体可变区(SCFV)基因插入腺相关病毒载体的Kpn Ⅰ和BglⅡ位点,构建成含抗EGFR单链抗体基因的重组腺相关病毒载体(rAAV-anfiEGFR).设立对照组(rAAV1-EGFP组)和实验组(rAAV1-anti EGFR组),观察抗EGFR单链抗体蛋白的表达情况.采用Western blot检测抗体蛋白的表达、CCK-8法和流式细胞仪检测6种人胰腺癌细胞株(PCT-3、SW1990、Capan-1、ASPC-1、MiaPaCa-2及PANC-1细胞)的抑制率和凋亡率.两组比较采用t检验.结果 抗EGFR单链抗体蛋白能在6种人胰腺癌细胞株中表达,对照组和实验组胰腺癌ASPC-1细胞抑制率分别为1.1%±2.4%和15.1%±3.5%,两组比较,差异有统计学意义(t=6.598,P＜0.05).对照组和实验组PANC-1细胞凋亡率分别为7.0%±3.0%和11.4%±2.5%,两组比较,差异无统计学意义(t=1.952,P＞0.05);对照组和实验组SW1990、ASPC-1、Capan-1、PCT-3、MiaPaCa-2细胞凋亡率分别为1.1%±0.8%、1.5%±0.7%、1.7%±1.2%、1.1%±0.7%、2.2%±1.1%和17.6%±2.2%、46.9%±3.9%、20.0%±2.8%、12.1%±1.6%、31.1%±2.5%,两组比较,差异均有统计学意义(t=12.208,19.846,10.405,10.909,18.327,P＜0.05).结论 成功构建了携带抗EGFR单链抗体基因的rAAV载体,其表达的抗EGFR单链抗体蛋白对人胰腺癌细胞株有明显的抑制作用.     

增强绿色荧光蛋白标记比较腺病毒、腺相关病毒体外转染兔软骨细胞的效果

目的 通过增强绿色荧光蛋白(eGFP)标记,比较腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)对体外培养软骨细胞的转染效果.方法 体外培养正常3月龄新西兰兔关节软骨细胞,以rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP分别转染原代关节软骨细胞,计算最佳传染复数.之后以最佳传染复数的病毒重组体转染软骨细胞,分别应用流式细胞仪检测绘制转染率的时间一反应曲线,倒置荧光显微镜下观察转染后细胞的大体形态、绿色荧光的表达情况并应用荧光定量PCR检测转染前后软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平的变化.结果 rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP的最佳传染复数分别为1×103 vp/cell和1×105 vg/cell.分别应用最佳传染复数体外转染原代培养的软骨细胞后,rAd5-eGFP在转染后1～2 d荧光表达即可达到高峰,但之后迅速衰减,在转染后第28天基本检测不到荧光表达.rAAV2-eGFP在转染第7天荧光表达达高峰,随之缓慢衰减,在转染后第56天仍可检测到绿色荧光表达.荧光定量PCR检测显示,rAd5-eGFP在转染软骨细胞后,软骨细胞合成Ⅱ型胶原mRNA的水平明显下降,而rAAV2-eGFP则影响不显著.结论 Ad转染体外培养的关节软骨细胞后,目的基因的表达迅速,但维持时间短,对软骨细胞表型的影响较明显;AAV转染软骨细胞后,目的基因的表达缓慢,但维持时间长,且对软骨细胞表型的影响较小.AAV更适于作为软骨细胞的体外转染载体.     

血管组织工程种子细胞的建立及意义

目的：利用人Nanog基因转染血管组织工程的种子细胞（血管内皮细胞ECV304）,提高其增殖能力,以在较短时间内获得大量种子细胞,从而为克服血管组织工程种子细胞来源的匮乏及组织工程血管的快速构建提供新途径。方法：制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog,用rAAV2-hNanog转染ECV304细胞,然后采用RT-PCR检测hNanog基因在转染的ECV304细胞中的表达,再用MTT、免疫荧光及激光共聚焦技术检测hNanog基因对血管内皮细胞ECV304生长的影响。结果：（1）rAAV2-hNanog转染ECV304细胞后,RT-PCR检测表明hNanog基因能在血管内皮细胞ECV304中稳定表达;同时,血管内皮细胞在转染后的增殖能力也显著增强（P〈0.05）。光镜下观察发现,转染的血管内皮细胞的形态无明显改变。结论：转染hNanog基因后,血管内皮细胞的形态无显著变化,但其增殖能力明显增强。利用hNanog基因提高血管内皮细胞的增殖能力,能够克服血管组织工程种子细胞来源不足的瓶颈,为组织工程血管的快速构建及应用提供一种新的方法。     

Transduction of pancreatic islets with pseudotyped adeno-associated virus: effect of viral capsid and genome conversion

BACKGROUND: Recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors currently show promise for islet gene therapy. In the presence of complementing AAV2 Rep proteins, AAV2 genomes can be packaged with other serotype capsids to assemble infectious virions. During transduction, the ssDNA to dsDNA conversion is one of the major rate-limiting steps that contribute to the slow onset of transgene expression. METHODS: Using pseudotyping strategy, we produced double-stranded (dsAAV) and single-stranded (ssAAV) rAAV2 genomes carrying the GFP reporter gene packaged into AAV1, AAV2, and AAV5 capsids. The ability of cross-packaged AAV1, AAV2, and AAV5 at the same genome containing particle (gcp) concentration to transduce murine and human pancreatic islets was evaluated by GFP positive cell percentage. Transgenic expression was also determined by transplant transduced human islet into SCID mice. RESULTS: Pseudotyped rAAV2/1 based vectors transduced murine islets at greater efficiency than either rAAV2/2 or rAAV2/5 vectors. For human islets transduction, the rAAV2/2 vector was more efficient than rAAV2/1 or rAAV2/5 vectors. rAAV2/2 transduced human islets more efficiently than murine islets, while rAAV2/1 transducted murine islets more efficiently than human islets. dsAAV, which do not require second strand synthesis and thus are potentially more efficient, evidenced 5 fold higher transduction ability than ssAAV vectors. Pseudotyped rAAV transduced islet grafts maintained normal function, expressed transgenic product persistently in vivo, and reversed diabetes. CONCLUSIONS: The transduction efficiency of rAAV vectors was dependent on the cross-packaged capsid. The vector capsids permit species-specific transduction. For human islets, dsAAV2/2 vectors may be the most efficient vector for clinical development.