阴道毛滴虫沉寂信息调节因子Sir2同源基因克隆和蛋白表达

目的克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)沉寂信息调节因子Sir2基因,构建原核表达重组载体,表达重组蛋白,并制备抗体进行相关功能的研究。方法从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离获得阴道毛滴虫Sir2同源基因的cDNA克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coliBL21,IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物并对表达产物进行SDS-PAGE鉴定之后,用纯化重组蛋白免疫豚鼠获得抗血清,对重组蛋白和滴虫总蛋白进行蛋白质印迹鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库中获得一株1034bp的cDNA克隆,序列分析表明,该序列开放阅读框有912bp,推测肽链具有304个氨基酸,等电点(PI)5.5。该肽链与酵母SIR2p蛋白及其同源物一致性高达30%～47%,并具有SIR2p及其同源蛋白的三个高度保守的特征性结构域。进化树结果显示,TvSIR2p接近线虫的SIR2蛋白,与同时克隆到的基因组TvSir2比较序列一致,证明该TvSir2基因组DNA不含内含子。PCR扩增出890bp片段,植入表达载体pET-41a;经酶切鉴定后取阳性克隆用IPTG诱导表达,产生融合蛋白产物经SDS-PAGE鉴定相对分子质量为62000,与预期分子质量相符。用该融合蛋白免疫豚鼠得到的抗体,经Westernblotting检测其与相应融合蛋白发生特异性反应,同时在33000处也能识别滴虫虫体全蛋白。结论推测该克隆是阴道毛滴虫Sir2的同源基因,该基因没有内含子,它可能参与阴道毛滴虫的组蛋白去乙酰化作用及调节衰老和寿命。阴道毛滴虫Sir2基因可以在大肠杆菌中得到表达,并获得了相应的抗血清,为进一步研究其功能奠定了基础。     

阴道毛滴虫衰老相关基因Tv-Sir2-like克隆与序列分析

目的：克隆单细胞模式生物阴道毛滴虫(Tv)Sir2基因，以便探讨其功能。方法：构建Tv cDNA表达文库，筛选出Tv-Sir2-like基因，并对该基因进行序列分析。结果：成功克隆Tv-Sir2-1ike基因。测序及序列分析显示，Tv-Sir2-1ike如基因开放读码框长1116bp，编码371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与SIR2的同源性最高，并具有SIR2 3个特征性的高度保守结构域。结论：推测Tv-Sir2-like是Sir2的同源基因，其表达产物可能参与Tv转录沉默，并调节Tv的细胞周期。     

阴道毛滴虫AP33基因克隆与序列分析

目的:阴道毛滴虫黏附蛋白AP33基因的克隆与序列分析.方法:提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其克隆到pUCm-T 载体进行PCR、酶切及测序分析,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927 bp.测序结果目的基因与阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-1、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP33-2分别具99%、97%和94%的同源性.结论:成功克隆出阴道毛滴虫AP33基因序列,与已公布的AP33序列有很高的同源性.这为今后该蛋白的原核表达和大量制备提供一定的基础.     

一个含有25 bp内含子的阴道毛滴虫Rab1-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rab1-like基因(TvRab1-like)及其内含子.方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析.结果 序列分析结果表明该cDNA克隆长705 bp,开放阅读框具603 bp,推测肽链含有200个氨基酸.序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rab1亚家族的亚型.进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rab1亚家族.基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25 bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5'GT-AG-3'和分支位点基序.RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在.结论 TvRab1-like基因属于阴道毛滴虫Rab1亚家族,该基因含有一个25 bp的内含子.该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子.对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化.     

阴道毛滴虫Rab1a基因的cDNA克隆及重组表达

目的克隆和分析阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a基因,构建Rab1a基因表达重组载体并表达其融合蛋白,以进一步探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫基因组DNA为模板,扩增TvRab1a基因,用pQE80L载体与TvRab1acDNA克隆构建原核表达重组体并表达融合蛋白,纯化表达产物并由SDS-PAGE鉴定。结果在阴道毛滴虫cDNA文库克隆中发现了Rab1a基因,序列分析显示Rab1a基因的基因组DNA序列含有一个25bp大小的内含子。成功构建了pQE/Rab1a原核表达重组体,并表达出预期大小的重组蛋白质。结论分析表明TvRab1a基因是阴道毛滴虫Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因,它含有一个25bp的内含子。获得了该基因的重组蛋白,将对TvRab1a基因的功能进行进一步研究。     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

一种新的阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因

目的 铁氧还蛋白系铁硫蛋白，在多种反应体系中起着传递电子的作用，也参与抗滴虫药物甲硝咪唑杀虫作用的激活。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因，以便进一步探讨其生理功能。方法 构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，分离cDNA进行克隆、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个新的铁氧还蛋白基因。该基因读码框全长312bp，相应蛋白质序列具103个氨基酸；在该蛋白质前体的N端带有10个氨基酸残基的氢酶体靶片段(MLSQCSPLRF)。序列分析显示该铁氧还蛋白(TvFd2)与已报道的阴道毛滴虫铁氧还蛋白(TvFd)有高度同源性(69％)；TvFd2与铁氧还蛋白(2Fe-2S)的两大亚类(氧化酶铁氧还蛋白和光合铁氧还蛋白)均具较低的同源性；可与(2Fe-2S)结合的4个半胱氨酸排列成典型的铁氧还蛋白保守序列(-C-X5-C-X2-C-Xn-C-)。结论 分析表明TvFd2是一新的阴道毛滴虫铁氧还蛋白，其功能有待进一步研究。     

阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶cDNA克隆和序列分析

目的近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是,对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶基因,以便进一步探讨其功能。方法使用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库,用生物信息学进行TvRab11同源分析,鉴定TvRab11基因,用PCR方法扩增基因组DNA,TA克隆TvRab11cDNA、测序及序列分析。结果在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp,读码框含636bp,推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因,其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性最高(一致性60%,相似性79%),与人类Rab11b次之(一致性58%,相似性78%)。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域(RabF1-5)。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因,其功能有待进一步研究。     

阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

一个含有25bp内含子的阴道毛滴虫Rabl-like新基因

目的 克隆和鉴定一个新的阴道毛滴虫Rabl-like基因（TvRabl-like）及其内含子。方法 我们从一阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出一个cDNA克隆,它与各物种的Rab家族蛋白有较高的同源性,因此我们进一步用BLASTP、RPS-BLAST、ClustalW和MEGA3等分析软件对该cDNA克隆进行了序列分析和进化树分析;用PCR和RT-PCR等技术分别对该基因组和mRNA进行了扩增和测序分析。结果 序列分析结果表明该eDNA克隆长705bp,开放阅读框具603bp,推测肽链含有200个氨基酸。序列比较分析结果提示该cDNA克隆所推测的蛋白质是一个Rabl亚家族的亚型。进化树分析也表明它属于阴道毛滴虫Rabl亚家族。基因组PCR扩增和测序分析表明该基因包含一个25bp的内含子,该内含子具有阴道毛滴虫和其它真核生物较大内含子所具备的典型的5’GT-AG-3’和分支位点基序。RT-PCR产物及其测序分析表明在该基因的转录本中存在着未剪切和剪切后的mRNA,说明确实有内含子的存在。结论 TvRabl-like基因属于阴道毛滴虫Rabl亚家族,该基因含有一个25bp的内含子。该内含子是至今发现的最小的阴道毛滴虫基因内含子之一,很可能也是真核生物中最小的内含子。对诸类最低等真核生物内含子的研究将有助于我们理解真核生物内含子的起源和进化。     

树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

Characterization of cDNA from the miracidial antigen family of Schistosoma japonicum (Chinese strain)

Objective To identify the egg antigens related to the formation of hepatic granulomas and fibrosis of Schistosomiasis japonica.Methods The egg cDNA library of Schistosoma japonicum (S. japonicum) was constructed and screened by immunological methods with the pooled sera of advanced schistosomiasis patients. The inserted foreign DNA fragments of positive clones were sequenced. The sequence data were analyzed using Wdnasis 2.5 and compared with Genebank data using blast software.Results Eighty-one clones containing recombinant DNA fragments were obtained from the egg cDNA library of S. japonicum by immunological screening. The DNA sequences of all clones belonged to the miracidial antigen family. The longest cDNA fragment was 1604 bp, which contained an open reading frame of 351 bp, which encoded a protein of 1 2913.35 daltons.Conclusion The cDNA sequence of the miracidial antigen of S. japonicum (Chinese strain) was obtained for the first time.     

树Ju载脂蛋白AIcDNA的克隆及其组织表达

克隆不易感动脉粥样硬化动物树Ｊｕ（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白Ａ－Ｉ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点,方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序,序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。     

幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的：克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）4种黏附素（BabA、AlpA、AlpB和HopZ）的保守区，并对其进行序列及生物信息学分析，为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法：利用ANTHEPROTV4.3c软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列，发现共同保守区（命名为CB），推导出其DNA序列，设计CB特异引物，将PCR产物定向插入pET-22b（ ）载体，构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定，生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果：构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒，测序显示CB基因长588bp，该基因编码195个氨基酸，与4种黏附素保守区的同源性均达50％以上，ANTHEPROTV4.3软件预测其蛋白质相对分子质量约为22500，并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836767个序列，与其同源性达40％的均为Hp序列。结论：Hp4种黏附素存在同源怀接近的保守区，表明其黏附作用可能有相似的分子基础，生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。