Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞

目的建立科学有效的大鼠成骨细胞体外培养模式,建立成熟合理的体外培养大鼠成骨细胞鉴定程序。方法采用I型胶原酶阶段消化法来消化新生大鼠乳鼠颅骨,来获得成骨细胞进行体外培养、扩增和鉴定。通过绘制成骨细胞生长曲线,倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,基质钙结节形成观察;进行钙-钴法碱性磷酸酶(ALP)染色;I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞。结果Ⅰ型胶原酶改良阶段消化法获得的大鼠成骨细胞纯度较高,增殖较快;ALP染色可见体外培养成骨细胞胞浆内棕褐色阳性颗粒;免疫组化法检测I型胶原可见成骨细胞胞浆呈棕黄色阳性着色,显微镜计数阳性细胞比例为87.3%;体外培养超过3w的成骨细胞可见基质钙结节形成。结论Ⅰ型胶原酶阶段消化法原代培养大鼠成骨细胞是一种科学有效的成骨细胞原代培养方法。     

体外培养人骨髓基质细胞表面抗原检测及分化能力观察

目的检测体外培养人骨髓基质细胞（BMSCs）表面抗原,并观察其分化能力。方法取人颅骨板骨髓组织,以BMSCs专用培养基接种培养,经多次换液得到较纯的BMSCs;在倒置显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞仪对细胞表面抗原进行检测;体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导,分别进行油红0染色及yonKossa染色。结果培养细胞表面抗原检测显示,CD14阴性、CD45阴性、CD29阳性、CD90阳性、CD105。阳性;脂肪细胞定向诱导后,油红0染色见胞质内有红色脂肪颗粒;成骨细胞定向诱导后,yonKossa染色见有钙结节形成。结论培养细胞表型特征符合BMSCs,并具有自我更新特性和多向分化潜能。     

乙酰胆碱酯酶染色法观察体外培养成骨细胞的凋亡

目的 观察体外培养大鼠颅骨成骨细胞的凋亡。方法 运用我们新建立的AChE染色识别法。结果 显示原代培养第40天的培养物中有处于不同时期的凋亡细胞。结论 原代培养大鼠颅骨成骨细胞在经历增殖期、基质形成期、矿化期后部分细胞进入凋亡阶段。我们建立的凋亡细胞染色识别方法简便,成本低廉,具有开发前景。     

人骨髓间质干细胞分离、培养、分化和鉴定方法的研究

目的 探讨人骨髓间质干细胞(hMSCs)分离和体外培养的适宜条件,检测其多向分化的能力.方法 应用细胞生物学干细胞培养法、分子生物学干细胞组织工程学等方法研究hMSCs的分离、培养并检测其多向分化潜能.结果 hMSCs增殖能力在一定的范围内(2.5%～20%)随着血清浓度的增加而增大,20%的血清浓度最适宜,其增殖活性在一定种植密度范围内(1～8×10~4/ml)随种植细胞数量增加而增高,在种植细胞密度为8×10~4/ml时,细胞的增殖活性最高.所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增的稳定的细胞.hMSCs在成脂培养基中有脂肪细胞形成,苏丹Ⅲ染色法将脂肪细胞胞浆染成桔红色.在成软骨培养基中有软骨细胞形成,阿尔新蓝染色法将软骨结节样结构染为深蓝色.在成骨培养基中有成骨细胞形成,Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成.该细胞在特定的诱导培养条件下具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化能力,符合判定hMSCs的"金标准".结论 所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增并保持未分化状态的、稳定的细胞,其在体外诱导条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化,是一种具有多向分化潜能的细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化及扩增的方法及对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法采用贴壁筛选法分离大鼠MSCs，并通过不断传代进行纯化和扩增培养，检测大鼠MSCs生长周期，绘制细胞生长曲线。结果大鼠MSCs在体外分离培养扩增，大鼠MSCs形态呈长梭形，细胞周期显示第3代MSCs约有81．48％的细胞处于G0／G1期，细胞生长曲线呈S形。结论所建立的分离和培养方法获取的大鼠MSCs具有生物学特性。     

氟致体外培养山羊成骨细胞损伤的超微结构观察

目的探讨过量氟对体外培养山羊成骨细胞生长发育及形态结构的影响。方法以酶半消化组织块培养法体外分离培养山羊成骨细胞,通过扫描电镜和透射电镜观察不同水平氟对成骨细胞超微结构的影响。结果扫描电镜观察,1．0×10-4、5．0×10-4、1．0×10-3 moL／L氟使成骨细胞突起收缩,胞间连接断裂,胞膜不完整,微绒毛减少。透射电镜观察,1．0×10-4、5．0×10-4、1．0×10-3moL／L氟导致胞膜不完整．胞质浓缩,胞核固缩;细胞染色质同缩、边集;线粒体明显肿胀,嵴断裂、消失或空泡变性;内质网扩张,脱颗粒。结论过量氟对体外培养的山羊成骨细胞生长发育和形态结构有明显的影响。     

体外血管钙化模型中骨钙素的分泌和X型胶原的表达

目的 :研究 2 5 羟基胆固醇对体外培养的主动脉中膜细胞钙化的促进作用 ,以及在此过程中骨钙素的分泌和X型胶原mRNA的表达与钙化的关系 ,初步探讨主动脉钙化的机制。方法 :采用外殖块法分离培养家兔主动脉中膜细胞 ,进行vonkossa染色以显示钙化 ,显微分光光度法检测细胞内外不溶性钙。平衡法1 2 5 I放免测定培养上清骨钙素的含量。RT PCR方法检测X型胶原mRNA的表达。结果 :2 5 羟基胆固醇 (实验组 )培养的传代细胞可见多个细胞结节 ,且细胞结节vonkossa染色阳性 ;而对照组无细胞结节形成 ,vonkossa染色阴性。前者每孔不溶性钙沉积量 ,以及培养上清中骨钙素含量明显高于后者。且实验组X型胶原mRNA的表达为阳性 ,而对照组为阴性。结论 :2 5 羟基胆固醇可促进主动脉中膜细胞发生钙化。主动脉中膜在体外钙化过程中与成骨细胞相似 ,骨钙素分泌增多且有X型胶原mRNA的表达 ,表明二者具有某些共同的发生机制     

人骨髓间充质干细胞的体外多向分化潜能

目的体外观察人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞的分化。方法体外培养扩增hMSCs,流式细胞仪分析其免疫表型。取稳定传代的hMSCs,分别在体外向成骨细胞、脂肪细胞及心肌细胞分化,并采用碱性磷酸酶染色、油红O染色及PTAH染色鉴定3种诱导分化后的细胞。结果 hMSCs传代后形态上为典型的成纤维细胞样结构;流式细胞仪检测表明,hMSCs表达CD44、CD105,不表达CD31、CD34和CD45;hMSCs诱导分化后,细胞化学染色显示呈阳性表达的成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞。结论 hMSCs具有多向分化潜能,可向成骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞分化。     

新型有序纳米介孔生物玻璃材料对体外培养成骨细胞的影响

目的探讨新型有序纳米介孔生物活性玻璃材料（mesoporous bioactive glass,MBG）对体外培养成骨细胞（osteoblast,OB）粘附、增殖、分化及矿化的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养;成骨细胞与不同浓度的MBG浸提液作用后,MTT法测定细胞增殖;PNPP法检测碱性磷酸酶活性;矿化结节计数和面积测量分析MBG对成骨细胞矿化能力的影响。同时扫描电镜对直接在MBG材料上培养的OB进行细胞形态学和粘附情况分析。结果0.5%以下各浓度组MBG浸提液均对成骨细胞增殖无影响,而1%浓度组对细胞增殖有轻度抑制,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）;各浓度MBG浸提液均可以增强碱性磷酸酶活性,与对照组相比,其中0.0625、0.125、0.25%浓度明显提高ALP活性,差异有统计学意义（P〈0.01）;0.0625%浓度时,矿化结节数目差异无统计学意义（P〉0.05）,而矿化结节面积差异有统计学意义（P〈0.01）;扫描电镜下细胞形态分化良好,细胞相互之间及细胞与材料之间结合良好。结论不同浓度MBG浸提液对成骨细胞的增殖和分化有不同的作用,低浓度对成骨细胞的增殖和分化有更好的作用。MBG材料有良好的生物相容性,有望成为新型骨组织修复替代材料或骨组织工程支架材料。     

依普拉芬对大鼠成骨细胞增殖分化及一氧化氮合成的影响

目的研究依普拉芬对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖分化以及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法体外分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞,将不同浓度的依普拉芬加入培养液,测定细胞增殖情况、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节以及培养基中NO浓度。结果与阴性对照组相比,依普拉芬可增加成骨细胞数量(P<0.01),提高细胞的ALP活性和促进钙化结节形成,增加培养液中NO浓度(P<0.01)。其中,依普拉芬浓度在10~8~10~5mol/L之间作用最为显著。结论一定浓度的依普拉芬可以促进体外培养成骨细胞的增殖、分化的作用,这种作用可能是通过增加细胞内NO合成进行调控的。     

Wnt/β-catenin基因对骨髓瘤患者间充质干细胞成骨潜能的影响

目的:探讨Wnt/β-catenin基因和多发性骨髓瘤骨病的关系。方法:分离培养多发性骨髓瘤患者和正常人的骨髓间充质干细胞(MSCs),体外诱导分化成骨细胞,茜素红实验检测矿化物沉积、荧光定量RT-PCR方法检成骨指标(OPN、OC、ALP、Cbfal)和Wnt/β-catenin mRNA表达,分析MSCs细胞成骨能力变化及两组间Wnt/β-catenin mRNA表达差异。结果:骨髓MSCs体外成骨诱导后,茜素红染色阳性,呈现明显红色钙化结节;MSCs体外诱导成骨细胞,试验组与对照组比较,成骨指标OPN、OC、ALP、Cbfαl mRNA表达降低(P<0.05);骨髓MSCs体外成骨诱导后β-catenin mRNA表达降低(P<0.05)。结论:骨髓MSCs体外可成功诱导分化为成骨细胞;多发性骨髓瘤患者MSCs向成骨细胞分化潜能比正常人降低,Wnt/β-catenin可作为多发性骨髓瘤骨病潜在治疗靶点。     

体外培养人成骨细胞随供体的增龄而改变

目的　观察体外培养的不同年龄组人成骨细胞形态、增殖与功能改变。方法　选取≤5岁 ,30～ 4 0岁 ,5 0～ 6 0岁和≥ 70岁四个年龄组的髂骨、股骨近端或股骨颈松质骨进行培养。培养期间应用相差倒置显微镜活体观察与碱性磷酸酶染色观察成骨细胞的生物学特性。一代成骨细胞生长至汇合时消化计数继续培养 ,二代成骨细胞分别于培养 1天 ,5天检测细胞增殖率 (MTT法 ) ,5天时检测碱性磷酸酶 (ALP)活性 ,14天时送电镜室进行透射电镜观察。结果　活体观察提示成骨细胞随增龄其胞体增大、变薄、空泡增多、突起拉长 ,汇合时趋向于长梭形 ,各年龄组成骨细胞碱性磷酸酶染色均呈阳性反应 ;电镜观察提示成骨细胞随增龄变得瘦长、细胞器减少、高尔基体不发达、糖原增多并呈堆积现象、溶酶体增多、出现空泡 ,细胞核内异染色质增多。成骨细胞生长至汇合时的细胞数与MTT相对比值随增龄而降低 (P <0 .0 1) ;ALP活性随增龄呈增高趋势 ,但差异无统计学意义。结论体外培养不同年龄组人成骨细胞的形态与增殖能力随年龄增加而发生衰老改变     

丹参酮ⅡA对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化能力的影响。方法扩增传代至第3代的SD大鼠BMSCs向成骨诱导分化培养,分为实验组和对照组,采用MTT比色法检测细胞的增殖能力;采用RT—PCR方法检测成骨相关细胞因子mRNA的表达;通过钙结节染色对比观察细胞形态情况。结果实验组各浓度TanⅡA较对照组BMSCs增殖速度提高（P〈0．05）,细胞增殖速率随TanⅡA浓度的增高而加快（P〈0．05）;实验组各浓度TanⅡA成骨相关细胞因子mRNA的表达较对照组提高（P〈0．05）;钙结节染色观察TanⅡA各浓度组均阳性显色,对照组显色不明显。结论TanⅡA能够提高体外培养的BMSCs增殖速率,对BMSCs向成骨细胞分化有明确的诱导作用,缩短骨细胞的成熟时间。     

高糖对成骨细胞MC3T3-E1活性影响的研究

目的探讨高糖对体外培养小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1活性的影响。方法将培养的MC3T3-E1细胞分为5．5mmol／L正常糖对照组、12．5mmol／L高糖组和25mmol／L高糖组,观察不同浓度糖对MC3T3-E1细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）、矿化结节、骨钙素（OC）及Caspase-3的影响。结果与5．5mmol／L正常糖对照组相比,12．5mmol／L高糖组培养5d细胞增殖和ALP分泌不受影响,在培养7d和14d时明显促进矿化结节形成,在培养5d时促进细胞内0（2表达,在培养3d时促进Caspase-3的表达;而25mmol／L高糖组在培养5d则可明显抑制细胞增殖及ALP分泌,在培养14d减少矿化结节的形成,在培养第5d时减少0（2表达,在培养3d时促进Caspase-3的表达。结论高糖可影响MC3T3-E1细胞活性,12．5mmol／L糖在培养时间内不影响细胞增殖与分化,可促进矿化;25mmol／L糖则对细胞产生明显的抑制效应。     

含骨碎补总黄酮血清对新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化和矿化的影响

目的 探讨骨碎补总黄酮含药血清对新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的影响及其作用机制.方法 (1)骨碎补总黄酮含药血清的制备:选用12月龄雌性SD大鼠,药物灌胃,每日1次,连续12 d,末次灌药1.5 h后腹主动脉取血,分离血清备用.(2)实验模型的建立:采用二次酶消化法从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞,传代培养,取第3代成骨细胞为实验模型.(3)指标测定:①细胞增殖:用MTr法;②细胞分化:碱性磷酸酶(ALP)活性(PNPP法);骨钙素含量(放射免疫分析法);③细胞矿化:采用茜素红染色法,在40倍光镜下计矿化结节.结果 骨碎补总黄酮含药血清可刺激体外培养新生SD大鼠成骨细胞增殖,促进成骨细胞合成分泌ALP,且能增加成骨细胞骨钙素的分泌,促进矿化结节的形成.结论 骨碎补总黄酮可促进成骨细胞的增殖、分化和矿化,从而促进骨形成.     

改良成骨细胞体外培养和鉴定方法

目的探讨理想的成骨细胞培养和罄定方法。方法同时采用多次胶原酶消化法及骨片贴附法获得成骨细胞，应用Gomori改良钙钴法和在此基础上苏木精复染法做成骨细胞鉴定，通过做成骨细胞动态形态学观察和生物学鉴定，比较不同细胞培养法和鉴定法。结果多次胶原酶消化法获得的成骨细胞数量更多，纯度更高，密度更均匀一致，多数细胞处于同一个生长周期；在改良钙钻法基础上做苏术精复染，成骨细胞结构更清楚，棕黑色颗粒分布位置更清晰可见，和阴性对照比较差异更罹著。结论多次胶原酶消化法获得的成骨样细胞更适于做体外实验研究模型；采用苏木精复染法做成骨细胞鉴定更有效。     

雌二醇对大鼠成骨细胞凋亡受体mRNA表达的影响

目的建立成骨细胞体外培养模型，并研究雌二醇（E2）对体外培养大鼠成骨细胞主要凋亡受体mRNA的调节作用，探讨E2抑制成骨细胞凋亡的机制。方法用新生大鼠颅盖骨进行成骨细胞的原代培养并进行纯化和鉴定；应用TNF-α（200U／ml）以及TNF-α＋E2（10^-8mol／L）进行刺激；用AO-EB染色观察成骨细胞凋亡并计数和计算凋亡率；应用RT—PCR的方法测定成骨细胞的Fas、FasL、TNFR1、TNFR2 mRNA的相对表达量。结果10^-8mol／L的E2明显抑制由TNF-α诱导的成骨细胞Fas、TNFR1 mRNA的表达（P〈0．01），但是对FasL、TNFR2 mRNA的表达没有影响（P〉0．05）。结论雌激素可以通过调节成骨细胞凋亡受体的表达来改变成骨细胞对致死性细胞因子如TNF-α．和FasL等的凋亡敏感性，从而抑制其凋亡。选择性抑制成骨细胞凋亡受体的表达可能有助于增加成骨。     

17β-雌二醇在大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞转换中的作用

目的探讨17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的作用。方法体外分离培养SD大鼠MSCs,诱导大鼠MSCs向成骨细胞定向分化,应用放免法、酶联免疫吸附法观察应用17β-E2对成年大鼠来源的MSCs成骨分化的影响。结果分离得出BMSCs细胞为长梭形或纺锤形,诱导7 d时,大部分细胞逐渐变为多边形,可见碱性磷酸酶(ALP)染色呈阳性;诱导约14 d,细胞互相聚集周围有钙盐晶体形成;诱导培养21 d,细胞聚集形成典型的骨小结,茜素红染色将骨结节中沉积的钙盐染成红色。结论密度梯度离心与贴壁筛选法相结合,是体外分离、纯化MSCs的理想方法;雌激素能通过增强MSCs的成骨分化能力来发挥促骨形成作用。     

氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响

目的 观察不同浓度氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响。方法 采用胶原酶消化分离培养小鼠乳鼠颅盖骨成骨细胞，应用四唑盐(MTT)比色法，观察氟对培养的成骨细胞增殖活力的影响。结果 染氟0.5mg／L以下，细胞增殖活力变化不明显，染氟1．0～4．0mg／L时成骨细胞增殖活力明显增强，与对照组比较差异有显著意义，且此作用呈剂量和时间依赖性。结论 氟在一定剂量范围对体外培养的小鼠成骨细胞的增殖有促进作用。     

体外冲击波诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察体外冲击波(ESW)对人骨髓间充质干细胞增殖活性的影响,为体外冲击波和hMSCs的临床应用提供理论依据。方法采用密度梯度离心法提取hMSCs。观察EJW诱导前、后细胞形态及生长状态变化,进行细胞内碱性磷酸酶(ACP)活性测定,X-线衍射分析细胞的矿物质沉积物情况。结果 5 kV、100频次的EJW可以明显促进hMSCs的生长。干预后的hMSCs贴壁率升高,钙结节形成增多;ALP总体水平高于对照组。干预后的hMSCs体外培养有大量的羟基磷灰石形成。结论低能冲击波在适宜强度下可诱导hMSCs向成骨细胞分化。