HCV感染者体内病毒NS3区部分区段的演变观测

目的　观察２ 例慢性 Ｈ Ｃ Ｖ 携带者及１ 例 Ｈ Ｃ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 转阴者体内包含 Ｃ Ｔ Ｌ 抗原表位的 Ｈ Ｃ Ｖ Ｎ Ｓ３ 区部分区段的长期演变。方法　通过反转录 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增, Ｍ１３ 亚克隆,对３ 例 Ｈ Ｃ Ｖ 感染者的 Ｈ Ｃ Ｖ Ｎ Ｓ３ 区部分区段的一级结构进行测定。对感染者的 Ｈ Ｌ Ａ 进行分型。根据基序（ ｍｏｔｉｆ） 及 Ｈ Ｌ Ａ 分型资料预测该区段中的 Ｃ Ｔ Ｌ 抗原表位。结果　文献报道的 Ｈ Ｌ Ａ Ａ２ 限制的抗原表位在无 Ｈ Ｌ Ａ Ａ２ 的感染者 Ｃ 中,１９９１ 年至１９９６ 年氨基酸序列无变异。具有 Ｈ Ｌ Ａ Ａ２ 的感染者 Ｗ, Ｚ 部分氨基酸序列中该表位的起始密码子发生无义突变,测序资料中包含稳定的变异位点的肽段,符合 Ｍ Ｈ Ｃ结合肽的基序（ ｍｏｔｉｆ） 。结论　无义突变可能与 Ｃ Ｔ Ｌ 的免疫压力有关。稳定变异位点产生的原因可能是免疫逃避。     

活体荧光成像监测HCV NS3/4A蛋白在小鼠体内的瞬时表达

目的建立HCV NS3/4A蛋白酶在小鼠体内可视化表达模型。方法利用水动力转染技术将融合基因NS3/4A-Fluc转染至小鼠肝脏,建立目的基因的瞬时表达模型,通过RT-PCR方法检测目的基因Fluc及NS3/4A的RNA表达水平,以及通过Western blot方法检测目的基因NS3/4A-Fluc的蛋白表达水平。结果建立了通过报告基因Fluc反映HCV NS3/4A蛋白酶的瞬时表达可视化小鼠模型。结论成功建立了可用于评价NS3/4A蛋白酶的可视化小鼠模型。     

慢性丙型肝炎患者丙型肝炎病毒NS5A区序列与干扰素疗效的关系

目的　探讨上海地区丙型肝炎病毒 (HCV) 1b亚型慢性感染者的血清HCV非结构基因5A(NS5A)与干扰素 (IFN)疗效的关系。方法　收集上海地区 2 4例HCV1b慢性感染者在干扰素治疗前后及随访过程中的血清标本 ,定量检测治疗前血清HCVRNA ,用逆转录 聚合酶链反应方法扩增NS5A的干扰素敏感决定区 (ISDR)基因并进行测序和分析。另扩增干扰素应答类型不同的 3例患者治疗前后共 5株HCV病毒的NS5A全长序列 ,测序后作种系发生树分析及蛋白二级结构预测。结果　治疗前血清HCVRNA的定量结果显示 ,持续应答组的病毒滴度 (平均滴度 4 50× 1 0 4copies ml)明显低于复发组和无应答组 (平均滴度 1 82× 1 0 7copies ml)。 2 4例慢性丙型肝炎患者干扰素治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与抗干扰素的HCV J株比较 ,1 3例为野生型 ,1 1例为中间型 ,无突变型。 6例完全应答者 3例感染的是野生型株 ,另 3例感染的是中间型病毒株。 5株HCV病毒的NS5A全长序列种系发生树显示 ,3种不同应答类型株在种系发生上分属 3个组别 ,无应答株与抗干扰素的HCV J株关系相近被归为 1组。蛋白质二级结构预测显示 ,上述病毒株NS5A蛋白在二级结构方面基本相似 ,仅在 2 2 55～ 2 2 89范围内有明显不同 ,这一区域与PKR结合域部分重叠。结论　HCVNS5A基因     

HCV非结构蛋白3真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3的构建

目的：构建HCV NS3基因真核表达载体，为进一步研究和解析HCV NS3基因诱发不死化人肝细胞癌化的机制准备了条件。方法：将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-3011质粒转化感受态菌JM109并扩增；提取pBRTM/HCV1-3011质粒；从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV NS3片段；并将其插入到克隆载体pMD18-T中，再与表达载体pcDNA3.1(-)重组，以得到重组的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3；最后限制性酶切鉴定HCV NS3表达载体。结果：从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCV NS3片段大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1/NS3内。结论：成功地构建了HCV NS3基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3。     

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的 制备针对丙型肝炎病毒（HCV）非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体（MAb）,并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法 用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westem blot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶（NS3蛋白的N末端1／3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3p、NS3解旋酶（NS3蛋白的C末端2/3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3A,将其瞬时转染COS-7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果 获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论 获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。     

湖北地区119例 HCV 1b 型 NS3丝氨酸蛋白酶区的序列变异研究

目的：分析丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b 型非结构蛋白3(non-structure protein 3, NS3)丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94％及87.68％,氨基酸序列同源性可达96.83％及92.39％,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57％,氨基酸序列同源性分别为92.17％及93.38％。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。     

用计算机程序预测可与HLA—A2分子结合的HCV抗原肽

本文设计了一个具有查找ＨＬＡ分子结合多肽功能的“Ｆｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ”程序，并针对ＨＬＡ－Ａ２分子特异的多肽结合基序建立了一个计算机评分系统。对 ＨＣＶ１型丙型肝炎病毒株中的ＨＣＶ－１和ＨＣＶ－Ｈ两氨基酸序列分析后发现，报道的ＨＬＡ－Ａ２分子结合的ＨＣＶ抗原均包含于查找的结果中，且绝大多数（１１／１２）评分≥１４４分。提示该程序可作为一种较为灵敏的能预测与ＨＬＡ－Ａ２分子结合的ＨＣＶ抗原     

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。     

聚合酶链反应诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点的突变及突变HCVNS3/4a蛋白的表达

目的 以聚合酶链反应（PCR）突变方法诱导丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶活性位点ser1165的突变，获得全长非结构基因3（NS3）／4a的表达与纯化。方法 分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物，诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物，产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物。再次PCR扩增突变模板，分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub，转化大肠杆菌BL21（DE3）pCG1，诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE－Sepharose、NTA纯化，Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用。结果 获得诱导突变的模板，Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割，部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割，纯化后的HCV NS3／4a蛋白在SDS－PAGE胶上显示为双带。结论 PCR突变方法简便、有效，获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达，NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在。     

A comparative analysis of the substrate permissiveness of HCV and GBV-B NS3/4A proteases reveals genetic evidence for an interaction with NS4B protein during genome replication

The hepatitis C virus (HCV) serine protease (NS3/4A) processes the NS3-NS5B segment of the viral polyprotein and also cleaves host proteins involved in interferon signaling, making it an important target for antiviral drug discovery and suggesting a wide breadth of substrate specificity. We compared substrate specificities of the HCV protease with that of the GB virus B (GBV-B), a distantly related nonhuman primate hepacivirus, by exchanging amino acid sequences at the NS4B/5A and/or NS5A/5B cleavage junctions between these viruses within the backbone of subgenomic replicons. This mutagenesis study demonstrated that the GBV-B protease had a broader substrate tolerance, a feature corroborated by structural homology modeling. However, despite efficient polyprotein processing, GBV-B RNAs containing HCV sequences at the C-terminus of NS4B had a pseudo-lethal replication phenotype. Replication-competent revertants contained second-site substitutions within the NS3 protease or NS4B N-terminus, providing genetic evidence for an essential interaction between NS3 and NS4B during genome replication.     

52 例病毒性肝炎患者肝组织中丙型肝炎病毒 RNA 和 HCAg-NS3 的测定

应用地高辛标记探针原位杂交法和单克隆抗ＨＣＶ－ＮＳ３－ＨＲＰ建立直接酶标免疫组化法分别测定５２例肝炎患者肝组织ＨＣＶＲＮＡ和ＨＣＡｇ－ＮＳ３。结果抗ＨＣＶ阳性组ＨＣＶＲＮＡ检出率５７．１％（１６／２８），ＨＣＡｇ－ＮＳ３检出率５３．６％（１５／２８）；抗ＨＣＶ阴性组其两项检出率均为１２．５％（３／２４）。肝组织中ＨＣＶＲＮＡ阳性物呈蓝紫色细小颗粒存在于肝细胞核或胞浆内，其在肝小叶中的分布可分为３型，即弥漫型、局灶型、散在型。肝组织中ＨＣＡｇ－ＮＳ３阳性物呈棕黄色细小颗粒分布于肝细胞核或胞浆内，以单个或数个阳性细胞散布于肝小叶中。２３例ＨＣＶＲＮＡ或／和ＨＣＡｇ－ＮＳ３阳性病例以肝炎后肝硬化（ＬＣ）病例占多数（１４／２３），其次为慢性重型肝炎（ＣＳＨ）和中度慢性肝炎（ＣＡＨ）。此两种检测方法具有较高符合率（９０．４％，４７／５２），表明病毒核酸及其表达产物均存在于肝细胞内，与ＨＣＶ感染密切相关。这为ＨＣＶ感染诊断提供了直接依据，有利于研究ＨＣＶ感染中病毒复制、慢性化进程、抗病毒治疗监测及重叠感染时病毒相互关系。     

肝细胞肝癌和肝硬化组织中丙型肝炎病毒各区段抗 …

目的 研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）和肝硬化（ＬＣ）中所起的作用。结合乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）进行分析，并初步探讨了ＨＣＶ与ＨＢＶ感染是否有相互促进作用。方法 采用ＨＣＶ－Ｃ，Ｅ，ＮＳ３，ＮＳ４区单克隆抗体，ＨＢｓＡｇ多克隆抗体用免疫组化方法检测了５９例ＨＣＣ及３５例ＬＣ组织标本。结果 ＨＣＶ阳性反应主要分布在肝细胞及癌细胞的胞浆内，呈细颗粒状。ＨＣＣ中，ＨＣＶ感染率；北京（２９例     

国产丙型肝炎病毒NS3抗原的质量检定

目的为了研究我国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）诊断试剂用抗原的质量，加快改进丙型肝炎病毒抗体诊断试剂。方法特选国内“八五”攻关课题研究出的丙型肝炎ＮＳ３抗原和目前我国的主要使用的两种国外丙型肝炎ＮＳ３抗原，建立了单片段检测ＮＳ３抗体的试剂，对ＮＳ３抗原质量利用我国抗－ＨＣＶ第二代国家检验参考品以及中国药品生物制品检定所最近收集的部分血清样品，对其抗原性进行了比较研究。结果发现我国生产单位对ＮＳ３抗原的纯化条件及在试剂中的组装条件的研究尚嫌薄弱，使得在利用这些ＮＳ３抗原组成诊断试剂检测时出现了检出率较低及假阳性等问题。结论提示国内有关单位应加强对这方面的研究。     

山东省HCV分离株C区及NS5区核苷酸序列分析及其基因分型

目的 研究山东省丙型肝炎病毒（HCV）流行株的基因型别,方法 用反转录套式聚合酶链反应（PCR）方法分别扩增山东省HCV流行株C区（432bp)NS5区（319bp)的两个基因片段,将其克隆人T载体上并自动测序,进行同源性分析及基因型别鉴定。结果 4株HCVC区基因片段有3株为1b基因亚型,1株为2a基因亚型,10株NS5区的基因片段分析均为1b基因亚型,并且与GenBank中多个1b亚型代表株核苷酸序列同源性达90%以上,结论 山东省HCV流行株以1b亚型为主,兼有2a亚型,同一亚型中也有较大的变异,NS5区1b亚型中基因散率可达5%以上。     

中国大陆庚型肝炎病毒NS区部分基因序列分析及变异 …

目的 研究中国庚型肝炎患者分离的病毒基因的特异性及变异规律。方法 应用逆转录－巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从１６例庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）感染住院病人血清中扩增了ＨＧＶＮＳ５区部分基因片段。经纯化后采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。     

HLA-B宽特异性抗原表位Bw4对HCV特异性T细胞反应影响分析

目的 探讨HLA-B分子宽特异性抗原表位Bw4对丙型肝炎病毒(HCV)特异性T细胞反应的影响.方法 以有偿献血途径感染HCV患者86例为研究对象,采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,进行HLA分型.采用ELISPOT技术观察HCV非结构蛋白NS3、NS4及NS5诱导T细胞分泌IFN-γ反应.结果 86例HCV感染者中Bw4/4纯合子患者29例(33.7％)、Bw4/6杂合子患者38例(44.2％)、Bw6/6纯合子患者19例(22.1％).Bw4/4纯合子、Bw4/6杂合子、Bw6/6纯合子HCV病毒载量分别为(3.98±0.32) Log(IU/ml)、(5.22±0.29) Log(IU/ml)、(5.04±0.38) Log(IU/ml),3组比较,HCV病毒载量差异具有统计学意义(P=0.0153).24例患者进行HCV非结构蛋白(NS3、NS4、NS5)诱导T细胞分泌IFN-γ反应,Bw4/4纯合子组HCV特异性T细胞反应率为50％ (5/10),反应强度中位数为70 SFU/106 PBMC(0～2020 SFU/106 PBMC),非Bw4/4纯合子组中,HCV特异性T细胞反应率为14.28％ (2/14),反应强度中位数为0 SFU/106 PBMC (0～200SFU/106 PBMC).两组比较,Bw4/4纯合子组反应强度明显高于非Bw4/4纯合子组,差异有统计学意义(P=0.0450),前者HCV特异性T细胞反应频率高于后者,差异接近有统计学意义(P=0.069).在Bw4/4纯合子组,HCV以NS5诱导的T细胞反应为主体,其反应频率为50％ (5/10),非Bw4/4纯合子组,NS5反应频率仅为7.14％(2/14),两者比较差异接近具有统计学意义(P=0.050).结论 携带Bw4/4纯合子HCV感染者,病毒载量较低,HCV特异性T细胞反应较强.Bw4可能通过增强HCV特异性T细胞免疫,进而产生对抗HCV复制的作用.     

HCV/HBV复合DNA免疫的初步研究

目的 探讨HCV/HBV复合抗原PCX/S免疫原性。方法 将已证实具有良好免疫原性的人工合成的HCV复合多表位抗原基因PCX与HBV的S抗原基因融合于真核表达载体pcDNA3.0,构建真核表达载体pcDNA-PCXS。大量提取质粒并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR渗入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;用~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果 免疫后均能检测到抗-HBsAb和抗-HCVAb,抗体水平随着时间的推移逐渐升高,但后者OD_(450nm)平均值低于抗-HBsAb的OD_(450nm)。免疫小鼠诱发针对PCX或S抗原的CTL反应和淋巴细胞转化。结论 复合型PCX/S抗原基因可诱发特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。