宫颈永生化细胞和癌细胞的α、β、γ-微管蛋白比较分析

目的：探讨中心体α、β、γ-微管蛋白在人鳞状上皮宫颈永生化细胞（H8细胞株）和癌细胞（Caski细胞株）的表达差异及其在宫颈癌发生发展过程中的作用。方法：采用免疫细胞化学sP法检测中心体α、β-微管蛋白在人宫颈永生化细胞和癌细胞中的表达差异,提取两株细胞的骨架蛋白并用Western blotting对α、β、γ-微管蛋白的表达水平进行半定量分析。结果：Caski细胞中α、β-微管蛋白表达水平高于H8细胞,差异均有统计学意义（P〈0．05）。半定量分析α、β、γ-微管蛋白,Caski细胞中的表达量高于H8细胞。结论：中心体异常可能是宫颈癌细胞恶性表型的特征之一,以中心体微管蛋白为治疗靶点的研究有着可期待的前景。     

永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立

目的：建立永生化人成牙本质细胞系．方法：采用脂质体转染法，将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞．培养液加G418筛选约1mo后，抗性细胞克隆形成，滤纸片法转移、扩增并连续培养．检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达，初步分析细胞系的生物学特征．结果：hTERT稳定转染入目的细胞，表达mRNA及其蛋白．转染后共获得5个细胞克隆，克隆5b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好，具有较高碱性磷酸酶活性，在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白，细胞核型正常．该细胞系至今传代56代，约6mo，命名为hTERThOd-L结论：建立起永生化人成牙本质细胞样细胞系．     

星形胶质细胞的永生化研究

星形胶质细胞（astrocyte，AST）是中枢神经系统内主要的神经胶质细胞，其功能复杂且分布广泛，已经成为生命科学研究的热点。体外细胞培养是研究AST生物学特性和生理学功能等的主要方法之一。然而，体外培养的AST增殖周期有限，多次连续传代后，常因复制衰老而死亡，难以获得较多性状一致的细胞，给研究带来很大不便。因此，学者们提出建立永生化的星形胶质细胞株，使体外培养的细胞具有无限增殖的能力且在一定范围内保持细胞生物学特性的相对稳定。本文拟对近年来AST永生化的研究进行综述。     

端粒酶永生化的人单克隆神经前体细胞系诱导表达多巴胺D2受体

目的:检测人神经前体细胞系HNG1210-E能否诱导表达多巴胺D2受体mRNA和受体蛋白,表达的受体是否有生理功能.方法:细胞因子诱导分化,RT-PCR和免疫荧光染色检测D2的表达; Fluo-3 测定多巴胺刺激产生的胞浆Ca2+.结果:RT-PCR显示D2 mRNA诱导后阳性,免疫荧光结果显示诱导后D2受体蛋白在细胞膜表面阳性,Fluo3法测定胞浆Ca2+,结果显示诱导后的细胞对5 mmol*L-1多巴胺递质反应使胞浆Ca2+快速上升.结论:从mRNA、蛋白和生理功能3个层次均证明HNG1210-E细胞系诱导后表达D2.     

可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox的构建与表达

目的 探讨以hTERT作为永生化基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因puro作为筛选基因、加强型绿色荧光蛋白EGFP作为报道基因、loxP作为重组位点构建可回复性永生化逆转录病毒载体。为建立可回复性永生化细胞株奠定基础。方法 用NheⅠ酶切线性化pBABE-puro产生两个相同的黏端，与loxP双链混合连接构建成载体pBABE—puro—lox；用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切下逆转录病毒载体pBABE—hTEKT-puro上约3．5kb hTERT基因片段，插入pBABE-puro—lox载体的相应酶切位点之间，重组的新载体称为phTERTPlox；扩增出无终止密码子的EGFP基因片段并插入phTERTPlox，正确构建的载体命名为phTERTGPlox。转染包装细胞PT67并用嘌呤霉素选择培养，在荧光显微镜下观察绿色荧光细胞，免疫组化染色检测hTERT基因的表达。结果 EcoRⅠ和NheⅠ双酶切鉴定phTERTGPlox形成4．0kb和5.3kb两个片段，转染PT67细胞荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光细胞，免疫组化染色结果显示稳定转染的细胞胞核呈阳性染色。结论 成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox。     

子宫内膜腺上皮永生化细胞模型的建立

目的建立永生化人子宫内膜HPV16型E6和E7基因诱导的腺细胞,以促进对其的细胞生物学、生长分化调节等方面的研究。方法将质粒pcDNA3.1(+)/HPV16E6E7转入腺上皮细胞中,G418筛选,WesternBlot检测目的基因的表达;用相差显微镜观察细胞变化;上机分析细胞周期。结果转化后腺细胞形态无明显改变,相差显微镜下观察细胞贴壁较紧,为多边形或圆形,密集区域呈镶嵌状排列,阳性细胞灶胞浆被均染成棕黄色,胞核呈蓝色;转化后细胞倍增时间约为52.8 h,对数生长期后细胞停止分裂增生,活性降低;转化后的细胞无凋亡峰出现,S期比例为33.23%,明显增加。与未转化细胞相比差异具有统计学意义。结论转染HPV16E6、E7基因至体外培养的子宫内膜腺上皮细胞寿命明延长,得到了可以在体外传代30次以上的转化细胞;具有正常细胞的表型和生长特性,有较强的增殖能力却不具有致瘤性。     

永生化表皮细胞体外快速扩增的实验研究

目的探讨获取大量皮肤组织工程种子细胞的方法和技术.方法通过真核表达载体,把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入兔表皮细胞,筛选、挑选阳性克隆在微载体-RCCS内快速扩增永生化表皮细胞.观测RCCS中微载体培养永生化表皮细胞的生长情况和检测细胞代谢率,进行抗人角细胞广谱角蛋白(AE1/AE3)免疫组化染色,并与常规培养方法进行比较.结果永生化表皮细胞在微载体-RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短(P＜0.01).在培养第10天,细胞数量可达最初接种的64倍(P＜0.01).结论联合应用微载体和RCCS培养技术,能够在体外快速、大量扩增永生化表皮细胞.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在宫颈癌中的表达及意义

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在宫颈癌中的表达状况,探讨其临床意义。方法利用组织芯片技术和免疫组织化学技术检测70例宫颈癌标本、26例宫颈上皮内瘤变标本和同期26例慢性宫颈炎标本中PPAR-γ表达状况并分析其与分化程度等临床病理指标关系。结果70例宫颈癌标本中PPAR-γ表达阳性38例(54.29%),26例宫颈上皮内瘤变表达阳性7例(26.92%)、26例慢性宫颈炎标本中表达阳性1例(3.85%)。三者比较具有极显著的统计学差异(P<0.01)。PPAR-γ高表达与宫颈癌患者的年龄、临床分期和组织学类型均无相关性(P>0.05);与分化程度、淋巴转移均有差异(P<0.05)。结论PPAR-γ在宫颈癌中的表达高于宫颈上皮内瘤变和慢性宫颈炎,在宫颈癌的发病机制中可能具有重要的作用,PPAR-γ基因的激活有望成为宫颈癌治疗的一个新途径。     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

Toll样受体在人眼角膜上皮和永生化人角膜上皮细胞系的表达及功能研究

目的探讨Toll样受体（TLR）1—9在人眼角膜上皮和上皮细胞系的表达及其功能性。方法以健康人外周血单个核细胞（PBMC）为阳性对照,收集20例健康青年人角膜上皮标本和培养永生化人角膜上皮细胞系（THCE）细胞,用半定量反转录聚合酶链反应检测TLR1～9mRNA表达;Western印迹检测TLR2、4的蛋白质表达;TLR3和TLR4的配体对THCE刺激后酶联免疫检测分泌IL-8的变化,结合抗体封闭实验,研究角膜上皮TLR的功能性。结果与PBMC比较,人角膜上皮强表达TLR1、2、3、5、6、9,弱表达TLR8,微弱表达TLR4;20例角膜上皮标本中发现1例TLR3、4、6、8阴性表达,1例TLR5微弱表达;人角膜上皮在蛋白质水平表达TLR2、4;THCE细胞与人角膜上皮有相似的TLR表达谱;LPS和PolyI：C刺激THCE1、4、8h后IL-8分泌增加,8h时分别达到对照组的10倍和7倍（均P〈0．05）,抗体封闭TLR4可以阻断LPS诱导的IL-8分泌。结论人角膜上皮表达TLR1—9,但不同TLRs表达水平有差异。THCE是研究人角膜上皮TLR表达和功能的良好细胞系。     

诺帝对HPV16型亚基因永生化人宫颈上皮细胞的诱导分化作用

目的 研究诺帝(Nordy)对HPV16型亚基因(E6、E7)永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)的诱导分化作用.方法 MTT法检测诺帝对H8细胞增殖的抑制作用,流式细胞术(FCM)分析细胞周期,免疫细胞化学S-P法检测增殖细胞核抗原Ki67的表达,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性变化.结果 诺帝能够明显抑制H8细胞增殖;可阻滞细胞周期于G0/G1期,S期细胞减少;细胞核内Ki67蛋白的表达水平明显下降;端粒酶活性明显降低.结论 诺帝对H8细胞有诱导分化作用,这种作用可能是通过抑制增殖,阻滞细胞周期,降低端粒酶活性来实现的.     

中心体γ-微管蛋白在人食管癌前病变及食管癌中的表达及其意义

目的探讨中心体γ-微管蛋白在人食管癌前病变及食管癌中的表达及其在食管癌发生发展过程中的作用。方法采用免疫组织化学法检测食管癌前病变及食管癌各40例中心体γ-微管蛋白表达水平,30例正常食管组织患者作为对照组,并用Western免疫印迹进行验证,所得数据进行统计学分析。结果不同样本组γ-微管蛋白表达水平不同（P=0．0001）,由食管正常上皮组织到出现不典型增生至进展为食管癌发展变化,γ-微管蛋白表达量呈增高趋势,各组间差异均有统计学意义（P=0．001）。比较同例和同组γ-微管蛋白的表达程度差异无统计学意义（P〉0．05）。Western免疫印迹与免疫组化检测结果一致。结论中心体异常为食管癌细胞恶性表型的明显特征之一,并可能是食管癌形成过程中的早期事件。γ-微管蛋白表达情况可为食管癌发生机制的探讨、高危病例的筛选及早期诊断、早期治疗提供一种新的思路和途径。     

用强化接种后的特殊PBMC和改良永生化技术制备人源抗HBs

目的 建立乙肝表面抗体(抗HBs)阳性者EBV永生化的B淋巴母细胞系(B-LCLs),筛选、获得人源抗HBs及其分泌细胞.方法 常规技术获得乙肝疫苗强化免疫后志愿者的特异性外周血单核细胞(PBMC),EBV转染,加入CpGDNA免疫调节基序诱导B淋巴细胞增殖,环孢菌素A(CyA)抑制T淋巴细胞活性.雅培法定量动态检测水生化细胞培养上清中的抗HBs滴度,取高滴度抗HBs孔的B-LCLs细胞有限稀释法培养.用免疫组化SP法观察细胞分化状况及抗HBs表达.结果 成功构建了分泌抗HBs的永生化.B-LCLs;培养上清抗HBs滴度维持较高水平3周左右,之后逐渐降低;免疫组化鉴定B-LCLs细胞培养3个月时,永生化细胞仍然为抗HBs合成细胞.结论 采用改进的EBV永生化技术转化强化接种后获得的特殊PBMC,可高效获得永生化的B-LCLs,并有效表达抗HBs.     

宫颈癌全切术对机体T细胞亚群及γ-干扰素表达水平的影响

目的探讨宫颈癌全切术对患者免疫功能的影响。方法采用流式细胞仪检测T细胞亚群,采用全自动酶联免疫分析仪测定宫颈癌术前术后血清γ-干扰素(IFN-γ)表达水平。结果宫颈癌全切术后患者血清辅助性T淋巴细胞CD4~+、CD4~+/CD8~+计数均降低,细胞毒性T淋巴细胞CD8~+细胞升高,IFN-γ表达水平降低,与术前比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论宫颈癌全切术对患者本身损伤较大,导致机体免疫下降,检测术前术后T细胞亚群和IFN-γ可为术后的免疫治疗提供一定的指导意义。     

DNA倍体、AgNOR和细胞病理学表达与宫颈癌诊断和放射敏感性关系的探讨

目的:探讨DNA倍体、AgNOR计数与放射敏感细胞对宫颈癌的诊断价值,分析和评价三项指标对选择放疗及判定疗效的意义。方法:46例临床拟诊为宫颈癌的患者放疗前测DNA倍体、AgNOR计数,行细胞学和病理学检查确诊,于放疗中、后测DNA倍体、AgNOR计数和细胞学、病理学检查,观察宫颈细胞的放射反应变化和判断放疗效果。结果:DNA倍体的异倍体量与宫颈癌的异型性和放射敏感性成正相关;AgNOR计数与宫颈癌病理分级和放射敏感性成正相关。细胞学放疗前、后诊断与病理学对比分析,其敏感性为100%,特异性为95.65%,其敏感细胞和反应细胞能客观反映宫颈癌的放疗敏感程度和放疗效果。结论:DNA倍体、AgNOR计数与细胞学检查可以作为宫颈癌定性和分级诊断的客观依据,可以作为选择放疗和判定疗效的客观指标,三者联合应用对宫颈癌的诊断与判定疗效意义更大。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在人垂体腺瘤中的分布和表达

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在人垂体腺瘤组织中的分布和表达。方法免疫组织化学染色检测PPAR-γ在垂体腺瘤组织中的分布情况,Western blot方法分析PPAR-γ在正常垂体与垂体腺瘤中的表达水平。结果免疫组织化学染色显示,PPAR-γ主要分布于细胞核内。Western blot结果显示,PPAR-γ在垂体腺瘤中的表达水平显著高于正常垂体组织(P<0·01),在促肾上腺皮质激素腺瘤中的表达水平显著高于其他内分泌类型垂体腺瘤(P<0·05)。结论PPAR-γ可能在肿瘤的发生、生长、侵袭中起重要作用,该受体有可能成为未来垂体腺瘤治疗的新靶点。     

槲皮素对人宫颈癌HeLa细胞midkine和caspase-3表达的影响

目的 通过观察槲皮素对宫颈癌 HeLa 细胞中midkine(MK)、caspase-3 基因和蛋白表达水平,探讨槲皮素体外诱导 HeLa 细胞凋亡的机制.方法 宫颈癌细胞株 HeLa 细胞经培养、传代后分为实验组(分别加入浓度为10、20、40、80及160 μmol/L的槲皮素)和空白对照组.采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测细胞内的MK和caspase-3基因mRNA和蛋白表达水平.结果 随槲皮素浓度的增高HeLa细胞中MK mRNA和蛋白表达依次下降,其中80 μmol/L、160 μmol/L组下降较明显,而caspase-3的mRNA和蛋白表达随药物浓度增高表达增强(P<0.01).结论 槲皮素可能通过下调MK、上调caspase-3的表达水平而发挥抗宫颈癌作用.     

DNA倍体?PCNA表达与放射敏感细胞对宫颈癌诊断和放疗效果判定的研究

目的:探讨DNA倍体、PCNA表达与放射敏感细胞对宫颈癌的诊断价值,分析和评价3项指标对选择放疗及判定疗效的意义.方法:46例临床拟诊为宫颈癌的患者放疗前测DNA倍体、PCNA表达,行细胞学和病理学检查确诊,于放疗中、后测DNA倍体、PCNA表达和细胞学、病理学检查,观察宫颈细胞的放射反应变化和判断放疗效果.结果:DNA倍体的异倍体量与宫颈癌的异型性和放射敏感性成正相关;PCNA表达与宫颈癌病理分级和放射敏感性成正相关.细胞学放疗前、后诊断与病理学对比分析,其敏感性为100%、特异性为95.65%,其敏感细胞和反应细胞能客观反映宫颈癌的放疗敏感程度和放疗效果.结论:DNA倍体、PCNA表达与细胞学检查可以作为宫颈癌定性和分级诊断的客观依据,可以作为选择放疗和判定疗效的客观指标,三者联合应用对宫颈癌的诊断与判定疗效意义更大.     

大肠癌组织γ-谷氨酰转肽酶异质体表达的研究

作者对12例大肠癌患者的手术切除标本采用圆盘等电聚焦电泳将大肠粘膜γ—谷氨酰转肽酶分为8条区带,从阳极到阴极依次为GGTI—GGTⅧ,其中GGTⅤ主要存在于大肠癌组织(91.7％)和癌旁组织(72.7％),远癌组织仅1例阳性(10％)。GGTV阳性率与大肠癌Dukes分期和分化程度无相关(P=1),其等电点和胎盘型GGT(PGGTⅤ)等电点一致。结果表明GGTⅤ是大肠癌组织的癌胚蛋白,可望成为大肠癌早期诊断及监测癌前病变的生化标志。     

整合素连接激酶和黏着斑激酶在宫颈癌组织中的表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系

目的 探讨整合素连接激酶(ILK)和黏着斑激酶(FAK)在宫颈鳞状细胞癌(CSCC)组织中的表达及其与CSCC临床病理特征、人乳头状瘤病毒(HPV)感染的关系。方法 选择2015年10月至2019年8月邯郸市第一医院保存的30例正常宫颈组织、30例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织和60例CSCC组织标本,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测正常宫颈组织、CIN组织、CSCC组织中ILK和FAK mRNA的表达,采用免疫组织化学法检测正常宫颈组织、CIN组织、CSCC组织中ILK和FAK蛋白的表达,并分析ILK和FAK蛋白表达与CSCC患者临床病理特征及HPV感染的关系。结果 CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量分别为12.37±1.26、17.32±3.21,CIN组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量分别为8.39±3.20、13.35±2.34,正常宫颈组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量分别为3.67±2.40、5.47±2.10;CIN组织和CSCC组织中ILK、FAK mRNA的相对表达量显著高于正常宫颈组织(P<0.05),CSCC组织中ILK、FA...