靶向胃癌干细胞单克隆抗体2C12的鉴定及功能研究

目的:研究胃癌干细胞的功能性单克隆抗体2C12体外功能实验,为胃癌干细胞的靶向治疗提供候选单抗药物。方法:以胃癌细胞系SNU-5为细胞模型,流式细胞术检测其亲本细胞和通过无血清悬浮培养的球体细胞中2C12+细胞的表达水平,双色细胞免疫荧光检测单抗2C12和CD90识别的抗原在SNU-5细胞中的表达情况。流式细胞术分选SNU-5细胞中2C12+和2C12-细胞,采用无血清悬浮培养成球实验和Transwell小室法分别检测其自我更新能力和侵袭能力。用单抗2C12处理SNU-5的球体细胞后,检测其对SNU-5的球体细胞自我更新能力和侵袭能力的影响。结果:2C12+细胞在SNU-5的球体细胞中的表达水平明显高于亲本细胞。免疫荧光结果显示单抗2C12识别的抗原分子能与CD90在SNU-5细胞上共定位。流式细胞术分选结果表明SNU-5细胞中2C12+细胞成球数明显高于2C12-细胞（103.3±9.07 vs 50.67±5.86）（P<0.01）,侵袭能力也明显较高（209.3±12.9 vs 99.0±3.61）（P<0.01）。对2C12单抗的体外功能研究发现,不同浓度的单抗2C12（0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）能显著抑制SNU-5的球体细胞的成球能力（122.0±5.66、83.0±5.66、59.0±4.24）,抑制率达到31.97%和51.64%,同时侵袭能力也显著降低（178.0±8.49、106.5±5.0、78.0±2.83）,抑制率达到40.17%和56.18%。结论:单抗2C12是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,能够显著抑制胃癌干细胞的干性相关特征,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

抗胃癌干细胞单克隆抗体的筛选鉴定及功能研究

目的:筛选鉴定靶向胃癌干细胞的功能性单克隆抗体,为胃癌干细胞靶向治疗提供抗体候选药物。方法:以胃癌细胞系BGC-823为模型,采用流式细胞术分选CD44+细胞后检测其自我更新和致瘤能力。双色细胞免疫荧光检测单抗11H5和CD44在BGC-823细胞中的表达情况。流式细胞术分选11H5+细胞后检测其自我更新能力、细胞增殖和耐药能力。结果:流式细胞术分选CD44+细胞成球率明显高于CD44-细胞［（27.2±1.6）% vs （12.9±1.2）%］（P<0.01）,CD44+细胞的致瘤性比CD44-细胞至少高100倍。细胞免疫荧光结果显示单抗11H5识别的抗原能与CD44在BGC-823细胞上共定位。流式细胞术分选11H5+细胞体外成球率明显高于11H5-细胞［（21.4±2.0）% vs （6.2±1.0）%］（P<0.01）,耐药性也明显高于11H5-细胞(IC50值:0.986 μmol/L vs 0.315 μmol/L)。抗体体外功能研究发现,单抗11H5能显著抑制BGC-823细胞成球,抑制率达到47.9%。单抗11H5能抑制其sphere细胞的增殖,抑制率为44.9%（P<0.05）。经单抗11H5作用的耐药能力显著降低(IC50值:0.52 μg/ml vs 0.64 μg/ml)。结论:单克隆抗体11H5是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

ENO1在胃癌干细胞中表达及其与胃癌侵袭转移的相关性研究

摘 要：［目的］ 探讨ENO1在胃癌干细胞中的表达及其对胃癌侵袭转移的影响。［方法］ 以胃癌SNU-5模型,实时荧光定量PCR和双色细胞免疫荧光检测ENO1在其分选的CD44+细胞中的表达情况。运用慢病毒载体稳定干扰SUN-5中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Western blot检验干扰效率。流式细胞术分选稳定干扰ENO1的SNU-5中CD44+细胞后（shRNA-ENO1）,实时荧光定量PCR检测其Oct-4、Sox 2以及干性相关基因Nanog的表达,同时分别进行细胞成球实验、体外侵袭与体内致瘤的胃癌干细胞生物学特性研究,Western blot检测ENO1对胃癌干细胞侵袭转移影响的相关分子机制。［结果］ SNU-5的CD44+细胞中ENO1基因和蛋白表达明显高于CD44-细胞,并建立稳定干扰ENO1的SUN-5。shRNA-ENO1细胞中干性基因Oct-4、Sox 2和Nanog中mRNA的表达显著低于PLV-Ctr细胞（P<0.05）。与PLV-Ctr细胞相比较,shRNA-ENO1细胞的自我更新能力、侵袭能力和肿瘤重量显著降低。Western blot检测shRNA-ENO1细胞中Vimentin、Snail和N-cadherin下调表达,同时E-cadherin上调表达,并伴随AKT和PI3K的磷酸化水平降低,提示ENO1的作用可能通过PI3K/AKT信号通路激活。［结论］ ENO1在胃癌干细胞中高表达,其在调控胃癌侵袭转移能力中发挥重要作用。     

一株胃癌干细胞功能性单克隆抗体的鉴定及功能研究

[目的]从抗人胃癌干细胞单克隆抗体杂交瘤库中筛选鉴定识别胃癌干细胞的单克隆抗体,并证明其具有抑制胃癌干细胞自我更新能力和侵袭功能的功能性单抗,为靶向人胃癌干细胞治疗胃癌提供有治疗潜能的单抗候选药物。[方法]采用无血清培养、PKH26染色及流式细胞术等方法确定人胃癌细胞系SNU-5中存在肿瘤干细胞,可作为研究抗人胃癌干细胞单抗的细胞模型。应用双色免疫荧光、流式细胞分选等技术分析鉴定单克隆抗体25G5是识别胃癌干细胞的单克隆抗体。用肿瘤干细胞的成球生长实验、Transwell侵袭实验及耐药性实验研究分析25G5单抗对胃癌干细胞功能的影响。[结果]SNU-5细胞在无血清培养基中存活并增殖成球形生长,SNU-5球体细胞中表达胃癌干细胞标志物CD44~+和CD90~+的细胞比例分别为72.4%和8.55%,较亲本细胞分别提高了21.3倍和2.4倍,表明SNU-5中存在有CD44~+、CD90~+的胃癌干细胞。细胞免疫荧光结果显示25G5单抗识别的抗原分子与CD44、CD90胃癌干细胞标志物共染表达于胃癌干细胞膜上。流式细胞术分选的25G5~+细胞的成球率为(21.4±0.3)%,显著高于25G5-细胞(12.3±0.7)%和亲本细胞(16.1±1.0)%。Transwell侵袭实验、细胞耐药性实验和动物体内致瘤实验结果显示25G5~+细胞的侵袭能力和耐药能力也显著高于25G5-细胞和亲本细胞,表明25G5单抗识别的细胞是具有自我更新、高侵袭、高耐药性特征的肿瘤干细胞。体外功能研究发现,单抗25G5能显著抑制SNU-5胃癌细胞在无血清培养液中的成球生长,抑制率可达46.4%,也能显著地抑制SNU-5成球细胞(Sphere细胞)的侵袭,抑制率达58.4%。单抗25G5是一株能显著抑制SNU-5中肿瘤干细胞自我更新和侵袭能力的功能性抗人胃癌干细胞单抗。[结论]单克隆抗体25G5是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

杂交瘤单抗4F11识别CD90+肝癌干细胞并抑制其侵袭【院士点评：靶向CD90+肿瘤干细胞可能治疗肝癌转移】

目的:筛选识别肝癌干细胞的单克隆抗体并研究其体外的抗肿瘤作用,为肝癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物。方法:无血清悬浮培养及PKH26染色分析人肝癌细胞株MHCC97H中是否存在肝癌干细胞。流式细胞术检测MH-CC97H细胞及其成球细胞中7种肿瘤干细胞标志物的表达,以及MHCC97H细胞中肝癌干细胞标志物CD90和不同杂交瘤单抗3G7、4F11、11C9、15B7、15D2识别抗原的共表达情况。无血清悬浮培养法和CCK8法检测单抗4F11对MHCC97H细胞及其成球细胞自我更新和增殖的影响,Transwell实验检测单抗4F11对MHCC97H细胞体外侵袭和迁移的影响。结果:PKH26染色实验显示,MHCC97H细胞球体由单个肝癌干细胞增殖分化形成。MHCC97H细胞球中CD90+MHCC97H细胞比例较亲本MHCC97H细胞显著增加[(18.0±7.5)%vs(2.3±1.0)%,P<0.05]。杂交瘤单抗4F11、3G7、11C9、15B7、15D2均能识别MHCC97H细胞中CD90+MHCC97H细胞,其中单抗4F11对CD90+MHCC97H细胞的识别比例为(47.2±4.4)%,其对MHCC97H成球细胞增殖的抑制率远大于对亲本MHCC97H细胞增殖的抑制率[(29.4±3.8)%vs(12.0±2.2)%,P<0.05]。单抗4F11抑制MHCC97H细胞成球,抑制率达(58.0±20.8)%。单抗4F11能显著抑制MHCC97H细胞体外侵袭和迁移,抑制率分别为(48.6±5.1)%和(47.6±3.6)%。结论:杂交瘤单抗4F11能特异性识别CD90+肝癌干细胞,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,可作为肝癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

人胃癌CD90+干细胞可能影响胃癌的转移和患者的预后

目的： 分离并鉴定人胃癌细胞系SNU-5中的肿瘤干细胞,探讨人胃癌CD90+干细胞对胃癌转移和预后的影响。 方法： 无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5细胞系中是否存在肿瘤干细胞,流式细胞术分析SNU-5亲本及球体细胞中肿瘤干细胞标志物的表达,分选CD90+SNU-5细胞并进行体外生物学特征研究及SCID鼠致瘤实验。收集肿瘤医院腹部外科95例胃癌患者肿瘤病理标本,免疫组化方法检测胃癌组织中CD90的表达。 结果： SNU-5细胞无血清悬浮培养11 d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。无血清悬浮培养可将CD90+SNU-5细胞富集6.1倍,且CD90可在球体细胞中与标示干细胞的PKH26共染。CD90+SNU-5细胞较CD90- SNU-5细胞和亲本SNU-5细胞具有更高的自我更新能力\[成球率（7.7±1.1）% vs (1.3±0.4)%、(1.8±0.3)%,均P<0.01\]和侵袭能力\[侵袭细胞数(283.3±30.2) vs (48.0±7.5)、(156.7±72)个,均P<0.01\]。CD90+SNU-5细胞在重症联合免疫缺陷（severe combined immune deficency,SCID）小鼠皮下接种2×102个细胞6周即可致瘤（1/6）,而接种2×104个CD90- SNU-5细胞10周才能致瘤（1/6）。95例胃癌患者组织中CD90的表达与胃癌的远处转移显著相关（P<0.01）,且CD90阳性胃癌患者的生存期明显短于CD90阴性的患者（P<0.01）。 结论： 人胃癌细胞系SNU-5中存在具有更强自我更新及侵袭能力的CD90+干细胞,人胃癌组织中CD90+干细胞数量与肿瘤的转移与患者生存期明显相关。     

卵巢癌SKOV3细胞中侧群细胞的生物学特性

目的 分选人卵巢癌细胞系SKOV3中的侧群（side population, SP）细胞,并探讨其是否具有肿瘤干细胞的生物学特性。方法 流式细胞仪检测、分选经DNA染料Hoechst 33342染色后SKOV3中的SP细胞,并对侧群细胞（SP）与非侧群细胞（non-SP）作细胞生物学鉴定,包括增殖能力、克隆形成能力、侵袭及迁移能力、自我更新能力及细胞周期。结果 SKOV3细胞系中SP细胞比例为（1.12±0.104）%,SP细胞增殖速度快于non-SP细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。接种相同数量的细胞,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞（P<0.05）。Transwell实验显示,SP细胞侵袭与迁移的细胞数与non-SP相比均明显增多（P<0.05）。SP细胞体外能分化为Non-SP细胞,具有自我更新能力。SP细胞大多处于细胞周期的G0/G1期。结论 卵巢癌细胞系SKOV3中的SP细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性,SP细胞表型可考虑作为富集卵巢癌干细胞样细胞的有效方法。     

抗肝癌干细胞单克隆抗体的鉴定及功能

目的:鉴定可靶向肝癌干细胞的功能性单克隆抗体,为肝癌干细胞靶向治疗提供抗体候选药物.方法:以肝癌细胞系Bel7402-V3为模型,采用流式细胞术分选ESA+细胞后检测其耐药能力及致瘤能力.双色细胞免疫荧光检测单抗3G7和ESA识别的抗原蛋白在Bel7402-V3细胞中的表达情况,同时采用此法检测sphere中PKH26与3G7的共染情况.流式细胞术分选3G7+细胞后检测其自我更新能力,并采用CCK-8法检测其耐药能力;甲基纤维素成球实验,检测单抗3G7对细胞自我更新能力的影响;CCK-8法检测单抗3G7对细胞增殖和耐药能力的影响.结果:流式细胞术分选ESA+细胞的耐药性明显高于ESA-细胞,其IC50值分别为2.30 μmol/L、0.49 μmol/L(P<0.01),ESA+细胞的致瘤性较ESA-细胞高至少40倍.细胞免疫荧光结果显示单抗3G7识别的抗原分子能与ESA在Bel7402-V3细胞上共定位,并能与标识干细胞的PKH26染料共染.流式细胞术分选3G7+细胞体外成球率明显高于3G7-细胞[(30.4±3.4)% vs (8.8±1.8)%](P<0.01),耐药性也明显较高(IC50值:1.014 μmol/L vs 0.365 μmol/L).抗体体外功能研究发现,单抗3G7能显著抑制Bel7402-V3的甲基纤维素成球,抑制率达到37.2%;同时,单抗3G7能抑制sphere细胞的增殖,抑制率为41.7%(P<0.01);经单抗3G7处理过细胞的耐药能力显著降低,实验组与对照组的IC50分别为0.56 μg/ml和0.68 μg/ml.结论:单克隆抗体3G7是一株抗肝癌干细胞的功能性单抗,为肝癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物.     

肿瘤干细胞多靶点联合治疗效果分析

[目的]探讨有效的肿瘤生物治疗新思路,用肝癌细胞系Bel7402-V3为细胞模型检测联合单克隆抗体9A9和15D2对其干性功能（自我更新、侵袭和耐药）的影响。[方法]采用活细胞流式免疫荧光术检测单独抗体、联合抗体与肿瘤干细胞标志物ESA在Bel7402-V3亲本及sphere细胞中的表达;甲基纤维素成球实验和Transwell小室侵袭实验分别检测抗体对Bel7402-V3亲本细胞成球能力和侵袭能力的影响;CCK8法及IC50法检测联合抗体对Bel7402-V3亲本细胞耐药能力的影响。[结果]流式荧光结果显示：标志物ESA、单抗15D2、单抗9A9所识别的细胞比例在Bel7402-V3 sphere细胞中比在亲本细胞中分别富集了2.6倍、4.1倍、2.0倍;在Bel7402-V3亲本和sphere细胞中,联合单抗与标志物共染比例（9A9＋15D2与ESA）大于单抗分别与标志物共染比例之和[（9A9＋ESA）＋（15D2＋ESA）];单抗9A9与15D2联合时对Bel7402-V3亲本细胞的成球抑制率和侵袭抑制率均明显高于等浓度的单种单抗对Bel7402-V3亲本细胞的功能抑制;经联合单抗处理的Bel7402-V3亲本细胞耐药能力较经等浓度单种单抗处理的细胞耐药能力显著降低[9A9＋15D2：IC50为0.32μg/ml,9A9：IC50为0.58μg/ml,15D2：IC50为0.56μg/ml。[结论]肿瘤干细胞中存在不同亚群,其在不同的信号通路或基因水平上发挥了不同的作用。联合多靶点的抗体治疗能显著提高疗效。     

抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的筛选和鉴定

目的：从抗胰腺癌干细胞单抗库中筛选、鉴定识别胰腺癌干细胞的功能性单抗,为胰腺癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物。方法：无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌HPAC细胞系中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术检测HPAC的干细胞标志物CD133在球体细胞中的阳性比例,检测20株杂交瘤单抗在HPAC亲本和球体细胞中的阳性表达。双色荧光标记流式细胞术检测CD133和单抗在HPAC亲本和球体细胞中的共表达比例;无血清悬浮培养法观察单抗15E9对HPAC成球细胞自我更新的影响。CCK一8法检测单抗15E9对HPAC细胞增殖和耐药的影响。结果：HPAC细胞能在无血清培养基中存活、增殖并形成细胞球,成球率为4．8％±0．6％。HPAC球体细胞中CD133’细胞的比例较亲本细胞提高至11．6倍。20株候选杂交瘤单抗中有3株单抗能识别HPAC球体细胞中CD133’细胞,其中单抗15E9共染比例为3．5％,并能显著抑制HPAC细胞的成球,抑制率达到30．4％。单抗15E9联合吉西他滨能显著抑制HPAC球体细胞的增殖,联合组和对照组Ic50分别为30．8nmol／L和58．1nmol／L。结论：本研究成功筛选出1株杂交瘤单抗可以识别胰腺癌干细胞,并且可识别CD133＋的胰腺癌干细胞;体外功能显示该抗体具有抑制HPAC干细胞的自我更新能力,抗体干预后显著降低HPAC耐药能力,可能是潜在的胰腺癌干细胞的靶向治疗抗体药物。     

抗HSP90抗体通过内化eHSP90抑制人胃癌干细胞并提高顺铂的抗癌效果

目的：探索抗HSP90单克隆抗体28C10通过靶向肿瘤干细胞促进顺铂(cisplatin,DDP)对人胃癌细胞PAMC82恶性生物学行为的抑制效果及其可能的作用机制。方法:28C10单独或与DDP联合处理人胃癌细胞PAMC82,采用不同实验方法检测该细胞的无血清成球能力、迁移和侵袭能力与克隆形成能力,CCK-8法检测28C10对PAMC82细胞恶性生物学行为和协同DDP抗癌能力的影响。采用细胞免疫荧光及流式细胞术检测PAMC82细胞中HSP90及eHSP90(extracellular HSP90)的表达、定位、eHSP90⁺亚群比例,以及28C10处理后对ALDH⁺、CD44⁺、eHSP90⁺细胞亚群的影响。采用WB实验检测28C10作用后PAMC82细胞中HSP90、干性相关蛋白以及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达的变化。结果：胃癌细胞PAMC82膜表面表达eHSP90,具有2%～3%的eHSP90⁺细胞亚群,且eHSP90⁺细胞多为与ALD...     

miR-1207-5p通过靶向LIMD1调控乳腺癌T47D干细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨miR-1207-5p对乳腺癌T47D干细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能的机制.方法:以IGF-1、EGF、bFGF诱导、富集乳腺癌T47D干细胞并进行成球培养,流式细胞术分离干细胞,采用WB法检测干细胞分子标志物.采用qPCR检测干细胞中miR-1207-5p的表达水平,双荧光素酶报告基因实验分析miR-...     

一株靶向CD90+MHCC97-L细胞单克隆抗体治疗肝癌的实验研究

目的:研究抗人肝癌干细胞单抗28C10体内外功能,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有应用价值的候选治疗剂。方法:采用无血清成球实验、侵袭实验和CCK-8方法等检测分析28C10单抗对MHCC97-L sphere的细胞自我更新、侵袭和耐药的影响。裸鼠体内治疗实验研究单抗28C10联合顺铂对MHCC97-L移植瘤生长的作用。Western-Blot方法鉴定该单抗识别抗原的分子量。结果:流式细胞检测结果显示单抗28C10能够识别MHCC97-L中CD90阳性细胞的比例为2.75%。体外功能实验结果显示单抗28C10能显著抑制MHCC97-L sphere细胞的无血清成球能力和侵袭能力,抑制率分别达33.33%和53.8%。28C10能显著抑制MHCC97-L sphere的顺铂耐药能力,其IC50为0.74 μg/ml,而对照组的IC50为1.42 μg/ml。抗体体内治疗实验结果显示,低、高剂量抗体28C10均能抑制肝癌移植瘤的生长,抑制率分别达到了24.0%和67.7%,单独顺铂组肝癌移植瘤的抑制率为35.9%,而顺铂联合高剂量抗体28C10组对肝癌移植瘤的抑制率达到70.1%。Western-Blot结果显示单抗28C10识别的抗原蛋白分子量约100 kD。结论:筛选获得了1株抗肝癌干细胞的功能性单抗,为靶向肝癌干细胞治疗肝癌奠定了重要的基础。     

幽门螺杆菌感染与胃癌细胞侵袭转移的关系研究

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)感染与胃癌细胞侵袭转移的关系及可能机制。方法将幽门螺杆菌与胃癌细胞株SGC7901共培养12 h;按胃癌细胞与H.pylori菌落之比为1∶100,与SGC7901共培养0、12、24 h来进行Western-blot实验,测定基质金属蛋白酶9(MMP-9)、细胞外总调节蛋白激酶1/2(t-ERK1/2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)在胃癌细胞中表达水平的变化;共培养24 h后,分为两组,不处理组和加入ERK抑制剂U0126的处理组,应用Transwell小室细胞侵袭实验,比较抑制ERK前后对胃癌细胞运动、侵袭能力的影响。结果随着胃癌细胞与H.pylori比例增大,胃癌细胞中MMP-9、p-ERK1/2表达明显增高(P<0.01),t-ERK1/2表达水平无明显差异(P>0.05)。不处理组胃癌细胞穿透基膜的数量与H.pylori比例呈正相关,而U0126处理组的胃癌细胞穿透基膜数量明显减少。各组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论幽门螺杆菌感染能促进胃癌细胞的侵袭迁移能力,可能与其通过ERK信号途径增强MMP-9表达而诱导胃癌的发生发展有关。     

ENO1 monoclonal antibody inhibits invasion,proliferation and clone formation of cervical cancer cells

α-enolase (ENO1), highly expressing in cell membranes, cytoplasm and nuclei of cervical cancer and other tumors, acts as a plasminogen receptor and a glycolytic enzyme. ENO1 is found to be associated with tumorigenesis, invasion and migration, and proves to be an ideal target of tumor therapy. In this study, ENO1 monoclonal antibodies (ENO1mAb) was prepared to blockade ENO1 and the therapeutic role was observed in cervical cancer cells. First, ENO1mAb was prepared and screened by evaluating the inhibitory effect on migration and invasion of cervical cancer cells, which is supposed to block ENO1 expressed on cell membrane. Second, folic acid (FA) conjugated PLGA nanoparticles (FA-SS-PLGA) targeting tumor cells were prepared to mediate ENO1mAb entry into cells and its anti-tumor effects were investigated in vitro. We found that PLGA/FA-SS-PLGA nanoparticles-mediated ENO1mAb could antagonize the activity of ENO1 enzyme, significantly decreased the contents of lactic acid and pyruvate, and inhibited the proliferation, migration and clone formation of cervical cancer cells compared with the sham control (P < 0.05). In summary, ENO1mAb could specifically block ENO1 expressed on cell membrane and inhibit ENO1 glycolysis enzyme activity inside tumor cells, and plays a therapeutic role against cervical cancer cells. It suggests that ENO1mAb has promising anti-tumor effects.     

慢病毒介导Ras-GRF1调控肝癌干细胞干性维持与自我更新能力的机制

目的:探究Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1（Ras protein specific guanylate releasing factor 1,Ras-GRF1）在肝癌干细胞（cancer stem cells,CSC）生物学特性及自我更新中的作用,并初步探究其作用机制。方法:实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测人正常肝细胞系（HL-7702）和不同肝癌细胞系（Huh7、HepG2、Hep3B、CLC4、CLCl3、SMMC-7721）中Ras-GRF1表达水平;流式细胞术分选出肝癌干细胞,利用Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒感染肝癌干细胞,MTT法、EdU染色和平板克隆形成实验检测过表达Ras-GRF1对肝癌干细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞迁移与侵袭变化;成球实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞的自我更新能力;蛋白免疫印迹（Western blot）检测肿瘤干细胞中Hippo信号通路关键蛋白大肿瘤抑制因子（large tumor suppressor,LATS）、Yes协同蛋白（Yes cooperative protein,YAP）和哺乳动物STE20样蛋白激酶（mammalian STE20-like protein kinase,MST）的蛋白及磷酸化表达水平。结果:不同肝癌细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量较人正常肝细胞中显著降低（P＜0.05）;分离到的肝癌干细胞在感染Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒后,细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在两种肝癌干细胞 HepG2-CSC和SMMC-7721-CSC中,相较于空白对照组,Ras-GRF1-pCMV6组细胞增殖活性显著降低,EdU阳性染色数目和细胞克隆形成数目均显著减少,细胞迁移与侵袭数目也均显著减少,细胞成球能力明显降低,p-LATS/LATS、p-YAP/YAP及p-MST/MST蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:通过慢病毒介导Ras-GRF1在肝癌干细胞中过表达后,能够抑制肝癌干细胞的增殖、迁移与侵袭,降低自我更新能力,其机制可能与调控Hippo信号通路相关。