CRISPR/Cas9基因编辑技术在泌尿系统肿瘤研究中的应用

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9)基因编辑技术是源于细菌和古细菌介导抵御外源性遗传物质入侵的获得性免疫防御系统,可以实现对基因组的定点修饰。相对于传统的基因编辑系统,该系统具有设计简单、易操作、成本低廉和更加高效等优势,广泛应用于肿瘤学研究,包括肿瘤分子机制的研究、筛选肿瘤细胞耐药相关基因及肿瘤治疗等多方面。本文就CRISPR/Cas9在泌尿系统肿瘤研究中的应用进展进行综述。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在精准肿瘤学研究中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术通过精准定位和修改基因序列,可以识别与细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药性相关的基因,不仅为理解肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础,还为实现肿瘤的精准治疗提供了一种方便、高效的方法。由于其具有低成本、高效率的优点,被广泛地应用于精准肿瘤学的基础和临床研究当中,包括用于探寻抗肿瘤药物耐药靶点、筛查驱动基因、优化CAR-T和TCR-T细胞,以及筛选肿瘤靶向基因等。目前,已开展了十余项项使用CRISPR/Cas9技术治疗肿瘤的临床试验,策略多为利用CRISPR/Cas9技术敲除T细胞中的免疫检查点基因后回输患者,以达到免疫激活的效果,大多数研究仍处于Ⅰ期和Ⅱ期阶段。管CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究与治疗领域展现出了巨大潜力,但仍需面对脱靶效应,以及永久编辑可能带来的弊端等瓶颈,其实际临床效用仍有待更多的深入研究和大规模临床试验的严格验证。     

沉默单羧酸转运体4对前列腺癌PC3细胞恶性生物学行为的影响

目的：探讨沉默单羧酸转运体4（monocarboxylate transporter 4,MCT4）对前列腺癌PC3细胞增殖、迁移和侵袭的影响 及其可能的分子机制。方法：利用RNA干扰技术分别将siRNA-MCT4（si-MCT4）和阴性对照质粒（si-NC）转染进PC3细胞,培养 96 h后用乳酸测定法检测转染后PC3细胞培养液中乳酸含量, 用CCK-8法、Transwell小室法分别检测PC3细胞的增殖、迁移和侵 袭能力, 用Western blotting检测沉默效果及细胞中 integrin β4-FAK-SRC-MEK-ERK 信号通路相关蛋白（integrin β4、p-FAK、 p-SRC、p-ERK1/2、p-MEK1/2）和EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin）的表达水平。结果：成功构建沉默MCT4的PC3细胞株。 与对照组比较,si-MCT4组PC3细胞培养液中乳酸含量显著降低（P<0.01),细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著降低（P<0.05或 P<0.01）;si-MCT4组PC3细胞中integrin β4、p-FAK、p-SRC、p-ERK1/2、p-MEK1/2 及 N-cadherin 水平显著降低（均 P<0.01）, 而 E-cadherin表达水平显著升高（P<0.01）。结论：沉默MCT4表达可显著抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制 可能与抑制细胞培养液中的乳酸水平和细胞中integrin β4-FAK-SRC-MEK-ERK信号通路及EMT相关蛋白的表达有关。     

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌诊疗及其转移相关机制研究中的进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其治疗手段以手术为主,放、化疗作为卵巢癌术后的辅助治疗;晚期卵巢癌尤其容易发生远处转移,所以卵巢癌转移的诊疗也是我们卵巢癌临床治疗的重点。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术系统相比传统的基因编辑技术来说可以更快获得基因敲除突变体,有望通过CRISPR/Cas9来解析卵巢癌的发生及转移机制,从而加速卵巢癌的研究。本文简要的介绍了CRISPR/Cas9技术以及近年来CRISPR/Cas9技术在卵巢癌的治疗及晚期发生、发展转移的应用现状及展望。     

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌诊疗及其转移相关机制研究中的进展

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其治疗手段以手术为主,放、化疗作为卵巢癌术后的辅助治疗;晚期卵巢癌尤其容易发生远处转移,所以卵巢癌转移的诊疗也是我们卵巢癌临床治疗的重点。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术系统相比传统的基因编辑技术来说可以更快获得基因敲除突变体,有望通过CRISPR/Cas9来解析卵巢癌的发生及转移机制,从而加速卵巢癌的研究。本文简要的介绍了CRISPR/Cas9技术以及近年来CRISPR/Cas9技术在卵巢癌的治疗及晚期发生、发展转移的应用现状及展望。     

利用CRISPR/Cas9系统对人A549肺癌细胞NRF2基因的稳定敲除及其功能研究

背景与目的：CNC-bZIP是核转录因子E2相关因子2［nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2,NRF2］近羧基端一个亮氨酸拉链结构,该区域是DNA结合以及NRF2与小分子肌腱纤维肉瘤（small masculoaponeurotic fibrosarcoma,sMaf）蛋白结合形成二聚体所必需的区域,随后该区域与抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）结合,激活NRF2下游靶基因的转录表达,从而增加细胞抗氧化应激能力。构建CRISPR/Cas9慢病毒系统,获得了A549细胞中NRF2基因稳定敲除株并进行了功能研究。方法：针对该结构上下游设计一对sgRNA,与pLenti CRISPR v2载体连接,通过包装慢病毒的方式构建A549稳定敲除细胞系。根据测序图谱及蛋白质印迹法（Western blot）验证敲除效果。然后通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）、Western blot检测、克隆形成实验、细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）、划痕实验、Transwell实验比较A549细胞株NRF2敲除与不敲除的功能表达。结果：显示A549肺癌细胞中NRF2基因稳定敲除株构建成功;NRF2敲除株下游靶基因mRNA表达及蛋白水平明显减少,且能明显降低A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结论：利用CRISPR/Cas9慢病毒系统获得了高效永久NRF2基因敲除的肺癌细胞系,该基因敲除后A549肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力都显著降低。     

利用CRISPR/Cas9技术构建CYP2E1基因敲除的HEK293FT细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9系统在HEK293FT细胞系中敲除CYP2E1基因并探讨其在检测化学物毒性中的应用。方法：设计3对分别靶向CYP2E1基因第2、第3和第7外显子的sgRNA序列并构建PX461表达载体;将携带靶向CYP2E1的sgRNA表达载体转染至HEK293FT细胞中,通过SURVEYOR检测分析sgRNA的切割效率;利用有限稀释法获得CYP2E1敲除细胞株,通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测细胞株中CYP2E1的敲除效果;并检测其对N-（4-羟基苯基）乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性效应的影响。结果：SURVEYOR检测分析靶向CYP2E1基因第3外显子的sgRNA的切割效率为23%;成功构建了2株CYP2E1基因敲除的细胞株,实时荧光定量PCR结果显示CYP2E1 mRNA表达下降,蛋白印迹结果显示CYP2E1蛋白无表达;CYP2E1基因敲除会显著降低N-（4-羟基苯基）乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性。结论：通过CRISPR/Cas9构建出CYP2E1稳定敲除的肾细胞系,为研究CYP2E1的功能和作用机制提供了有效的工具。     

CRISPR/Cas9敲除内源TCR增强TCR-T细胞对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的杀伤

目的：基于CRISPR/Cas9基因编辑技术制备无内源TCR的TCR-T细胞并鉴定其在体外杀伤HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的功能。方法：培养健康志愿者外周血CD8⁺T细胞和Jurkat细胞,CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CD8⁺T、Jurkat细胞的TCR基因,制备过表达转基因TCR的重组慢病毒,在敲除内源性TCR的CD8⁺T和Jurkat细胞中用慢病毒过表达转基因TCR制备TCR-T细胞,多色FCM检测TCR-T细胞中TCR和CD3的表达水平,荧光素酶活性实验检测TCR-T细胞对HPV16阳性SiHa细胞的杀伤效率。结果：CRIPSR/Cas9基因编辑技术高效地敲除了外周血CD8⁺T细胞和Jurkat细胞中的TRAC和TRBC基因,敲除效率分别为(81.4±4.5)%(、98.5±0.07)%,制备的无内源TCR的TCR-T细胞高效表达转基因TCR,在外周血CD8⁺T和Jurkat细胞中表达率为(66.0±17.8)%、(97.3±2.6)%,敲除内源TRAC和T...     

CRISPR/Cas9 介导的PD-1基因敲除对食蟹猴T细胞增殖、表型及IFN-γ和IL-2 分泌的影响

目的：探讨CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除食蟹猴T细胞PD-1 基因对T细胞增殖、表型及IFN-γ、IL-2 分泌的影响。方法: 设计靶向食蟹猴PD-1 基因的gRNA,构建并提取质粒,分离食蟹猴外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,加入质粒DNA,用Lonza 4D电转仪进行细胞转染,转染48 h 后用流式细胞术和荧光显微镜技术检测转染效率。提取细胞基因组DNA进行PCR扩增及T7E1 酶切鉴定。在人源性CD3 抗体和IL-2 刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖并绘制细胞生长曲线,PI 染色流式细胞术检测T细胞的细胞周期及CD4、CD8 表达水平,ELISA检测IFN-γ、IL-2 的分泌水平。结果: 转染48 h 后,荧光显微镜下见实验组出现绿色荧光蛋白表达的细胞,其转染效率为（21.6±3.2）%;实验组细胞基因组DNA PCR产物经T7E1 酶切显示3 条带,出现目的分裂条带（243、197 bp）。与未转染组比较,（1）实验组T细胞增殖缓慢、集落形成时间延迟、细胞体积较小、折光性较弱;（2）实验组处于G0/G1 期的T 细胞数显著增多（P<0.05）、G2/M 期细胞数显著减少（P<0.05）;（3）实验组T 细胞IFN-γ、IL-2 的分泌水平显著升高（均P<0.05）,但CD4、CD8 表达水平比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论: PD-1 基因敲除可使食蟹猴T细胞阻滞于G0/G1 期从而抑制其增殖,同时上调了IFN-γ、IL-2 的分泌水平。     

应用CRISPR/Cas9 系统敲除PD-1 基因对人T 淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ 的影响

[摘要] 目的：探讨应用CRISPR/Cas9 基因编辑系统敲除PD-1 基因对人T 细胞增殖及分泌IFN-γ 的影响。方法：设计靶向PD-1 基因的sgRNA 序列,应用T7 RNA聚合酶体外分别合成PD-1-sgRNA 和Cas9mRNA。利用核转染技术将PD-1-sgRNA 和Cas9 mRNA混合物转入激活的人T淋巴细胞,测序确认基因敲除的效率。应用流式细胞术分析基因敲除后T淋巴细胞表型和PD-1 的表达情况,锥虫蓝活细胞计数法检测T 细胞增殖活力,ELISA 检测T 细胞分泌IFN-γ 情况。结果：体外成功合成PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA。将PD-1-sgRNA和Cas9 mRNA核转染T淋巴细胞,测序证实PD-1 基因序列编辑效率为58.3%。CRISPR/Cas9 系统成功下调T淋巴细胞表面PD-1 分子的表达水平[ （9.6±1.85）% vs（16.2±2.05）%,P<0.05],PD-1 基因敲除不影响T 细胞的增殖活力和细胞表型(P>0.05);但PD-1-sgRNA 组的效应T细胞分泌IFN-γ 水平显著升高(P<0.01)。结论：CRISPR/Cas9 基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞PD-1 基因,降低PD-1 分子表达可阻断PD-1／PD-L1 负性调控从而增强T细胞的免疫活性,且促进效应T细胞分泌IFN-γ。     

CRISPR/Cas9-mediated gene knockout of NANOG and NANOGP8 decreases the malignant potential of prostate cancer cells

NANOG expression in prostate cancer is highly correlated with cancer stem cell characteristics and resistance to androgen deprivation. However, it is not clear whether NANOG or its pseudogenes contribute to the malignant potential of cancer. We established NANOG- and NANOGP8-knockout DU145 prostate cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system. Knockouts of NANOG and NANOGP8 significantly attenuated malignant potential, including sphere formation, anchorage-independent growth, migration capability, and drug resistance, compared to parental DU145 cells. NANOG and NANOGP8 knockout did not inhibit in vitro cell proliferation, but in vivo tumorigenic potential decreased significantly. These phenotypes were recovered in NANOG- and NANOGP8-rescued cell lines. These results indicate that NANOG and NANOGP8 proteins are expressed in prostate cancer cell lines, and NANOG and NANOGP8 equally contribute to the high malignant potential of prostate cancer.     

Breast cancer radioresistance may be overcome by osteopontin gene knocking out with CRISPR/Cas9 technique

PurposeOsteopontin (OPN) is a phosphoglycoprotein, with a wide range of physiological and pathological roles. High expression of OPN promotes aggressive behavior, causes poor prognosis in tumor cells, and reduces the survival of patients. Since overexpression of OPN gives rise to radioresistance, the effects of the gene knock out using the CRISPR/Cas9 system in combination with radiation are emphasized.Material and methodsWe used the CRISPR/Cas9 technique to knock out the OPN gene in the MDA-MB-231 cell line. After transfection, the cells were irradiated. The changes of the OPN mRNA levels, the apoptosis, and the differences in cell viability were assessed.ResultsA significant reduction in the OPN expression was observed alone or along with irradiation. The knocked out gene alone increased apoptosis rate. The cell viability decreased to after knocking out of the OPN gene. The gene knocking-out combined with irradiation led to more decline of cell viability.ConclusionOur results demonstrated that after knocking out the OPN gene, the MDA-MB-231 cells showed a significant radiosensitivity. Therefore, the OPN knock out in combination with conventional radiotherapy, may become an efficient therapeutic target in the future.     

BAY 11-7082对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨BAY 11-7082对人前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响.方法:选择PC-3细胞分别加入不同浓度(2.5μmol/L、5μmol/L)的Bay 11-7082培养2h(实验1组与实验2组),同时选择空白对照组,检测三组细胞增殖、凋亡与细胞周期变化情况.结果:实验1组与实验2组的细胞存活率分别为(65.14±13.26)%和(55.81±14.55)%,明显低于空白对照组(85.45±12.33)%(P<0.05).空白对照组、实验1组与实验2组的细胞凋亡率分别为(0.56±0.11)%、(10.12±2.37)%和(17.23±2.46)%,对比差异都有统计学意义(P<0.05).实验组的G 0/G1期细胞数目较对照组明显增加(P<0.05),同时实验组的S、G 2/M期细胞数目较对照组明显减少(P<0.05),实验1组与实验2组之间对比差异也有统计学意义(P<0.05).结论:BAY 11-7082能明显抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,其部分机制可能是通过调节细胞周期实现的.     

E2F1对 TFDP3 表达的调控及其对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响

目的：构建含TFDP3基因启动子和荧光素酶报告基因的重组载体pGL3-TFDP3-promoter,观察E2F1对TFDP3转录及表达的调控作用以及TFDP3对E2F1诱导肿瘤细胞凋亡的影响。方法：以人前列腺癌PC3细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增TFDP3启动子序列并克隆入荧光素酶报告基因载体,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA瞬时单独或共同转染PC3细胞,测定荧光素酶活性以观察E2F1对TFDP3启动子的调控作用,Western blotting检测pCMV-E2F1-HA转染对PC3细胞内TFDP3表达的影响,流式细胞术检测TFDP3与E2F1相互作用对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果：成功构建TFDP3基因启动子重组质粒pGL3-TFDP3-promoter,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA共转染PC3细胞后,TFDP3启动子诱导的荧光素酶活性较单独转染pGL3-TFDP3-promoter显著升高[（1.14±0.06）vs（0.61±0.05）, P<0.05]。转染pCMV-E2F1-HA的PC3细胞的TFDP3蛋白表达是未转染细胞的2.7倍[（0.24±0.03）vs（0.09±0.02）, P<0.05]。pCMV-E2F1-HA转染后PC3细胞凋亡率较未转染组显著上升[（7.10±0.003）% vs（2.66±0.001)%,P<0.05],而pCMV-E2F1-HA与pcDNA3.1-TFDP3共转染后细胞凋亡率较pCMV-E2F1-HA组显著下降[（4.92±0.002）% vs（7.10±0.003）%,P<0.05]。结论：E2F1可增强TFDP3启动子的活性,增加TFDP3蛋白的表达,其可能通过此机制抑制E2F1诱导的前列腺癌细胞凋亡。