噬菌体展示体内筛选技术及其应用进展

噬菌体展示技术是将高度多样性的多肽或蛋白展示于噬菌体衣壳蛋白表面的一项技术。这一技术将展示分子的基因型和表型联系在一起,极大地方便了多肽或蛋白分子的功能性筛选。从噬菌体展示文库中筛选出的多肽或蛋白具有高度的特异性和极强的亲和力,在生物医学基础研究和临床诊断治疗中具有重要的应用价值。随着噬菌体展示技术的不断发展,已将其用于活体的体内筛选。体内筛选技术发挥了高通量筛选的特点,能够在活体水平研究血管表面的分子表达状况,分析不同器官血管表面分子的表达差异,从而为临床靶向性诊断和治疗提供实验依据。     

利用体内噬菌体展示技术进行人源肿瘤细胞特异性结合肽的筛选

目的：寻找肿瘤细胞特异性结合肽，为肿瘤诊断试剂及肿瘤药物的研制奠定基础。方法：用培养的人源肿瘤细胞使裸鼠致瘤，将随机肽库从裸鼠的尾静脉注射到裸鼠体内，循环数分钟后取肿瘤组织及正常对照组织进行噬菌体筛选；经过2—3轮体内筛选，获得在肿瘤组织中富集的肽段。结果与结论：利用体内噬菌体展示技术，结合人源肿瘤细胞(SMMC—7721和PLA—801D)裸鼠致瘤模型，从随机十二肽库中成功地筛选到可以较高特异性地结合SMMC—7721肿瘤细胞或肿瘤血管的噬菌体多肽，通过对噬菌体单克隆进行测序，初步确定了几种可能的多肽基序(motif)。     

应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(core promoter)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体表面展示技术,以HBV核心启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到6个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白——羧肽酶N(CPN)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV核心启动子的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV的复制机制创造了新的途径。     

不同靶标的噬菌体展示肽库筛选的研究新进展

噬菌体展示技术自建立以来 ,经过十几年的发展 ,逐渐成为一个强有力的筛选工具。用于筛选的靶标也越来越具有多样性 ,不仅是分子 ,新鲜分离或培养的细胞 ,甚至活体器官都可作为筛选的对象 ,使这一技术有了更广泛的应用前景     

利用噬菌体肽库筛选脂多糖的模拟表位

目的：利用噬菌体肽库获得脂多糖的模拟表位。方法：用脂多糖免疫大耳白兔获得抗血清，从中纯化抗脂多糖的多克隆抗体。以纯化的抗体IgG为筛选靶分子，对噬菌体随机十二肽库进行亲和筛选。经3轮筛选后，随机挑取25个克隆测序，并进行噬菌体ELISA结合实验及脂多糖竞争抑制实验，以确定阳性克隆。结果：获得12种序列，ELISA实验结果显示其中6个为阳性克隆，且经脂多糖竞争抑制实验进一步证实。结论：获得了6个脂多糖的模拟表位，为脂多糖抗原表位的研究及疫苗研究提供了线索。     

基于骨架蛋白的噬菌体肽库研究

噬菌体展示肽库技术是研究蛋白质分子进化的理想工具，从选择合适的蛋白骨架入手，构建在此结构基础上的构象型肽库，结合高通量大规模的筛选技术，可以方便地获得具有新功能的蛋白质，这些新功能蛋白因具有高亲和力和高特异性，将有可能在许多生物技术领域中替代天然抗体。     

从噬菌体随机七肽库中筛选hERG钾通道亲和肽的研究

目的获得与hERG钾通道特异性结合的功能性亲和肽。方法以hERG1a亚基第3个细胞外环（L3）为靶蛋白分子,对噬菌体随机七肽库进行亲和筛选,ELISA法检测噬菌体克隆与靶蛋白的亲和性,使用全自动膜片钳技术观察亲和肽的活性。结果与结论经过3轮亲和筛选后,随机挑选15个噬菌体克隆对其亲和性做ELISA鉴定,均显示较强的阳性结果。将上述阳性克隆进行DNA测序得到3种不同小肽序列。电生理学研究表明,合成的3个小肽均能显著抑制hERG钾电流,为靶向hERG钾通道抗肿瘤研究提供了新的研究思路。     

应用噬菌体展示技术筛选细胞周期素B2启动子DNA的结合蛋白

目的筛选细胞周期素B2（cyclin B2）启动子DNA结合蛋白,探索cyclin B2的表达调节机制.方法应用噬菌体展示技术,以cyclin B2启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果噬菌体经富集后,筛选出20个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和cyclin B2启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白.结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到cyclin B2启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究cyclin B2基因的转录调节机制奠定了基础.     

细胞穿透肽在生物医学领域中的应用

细胞膜作为活细胞选择性渗透屏障是细胞存活和功能的必要组成部分。然而,在许多情况下,外源性活性物质通过胞浆膜的有效传递存在物质运输至胞内的主要屏障。在过去20年里,多肽转运药物至细胞的潜能被许多细胞穿透肽的发现而重视。细胞穿透肽作为载体可以有效转运如小干扰RNA、核酸、蛋白质、小分子治疗物质、荧光量子点和磁共振成像造影剂等物质。本文主要介绍了细胞穿透肽的分类和细胞摄取机制,及其作为新型载体在细胞成像、核定位、p H-敏感和热靶向传递系统发展中的应用前景。     

噬菌体展示技术在肿瘤诊断和治疗中的应用

噬菌体体内展示技术的出现,使器官靶向性多肽的筛选、器官特异性血管分子作图成为可能。更值得注意的是,通过动物体内的筛选,鉴定出了一系列肿瘤相关分子的标志物的特异性多肽配体,为肿瘤的诊断,肿瘤药物的输送以及肿瘤血管性基因治疗等提供了靶向性分子。最近,人们又成功地将此技术应用于肿瘤患者,并鉴定出与肿瘤特异性结合的多肽模序。     

人参皂苷Rg3对人宫颈癌Hela细胞诱导凋亡作用

目的探讨人参皂苷Rg3对人宫颈癌Hela细胞的诱导凋亡作用。方法用浓度梯度Rg3处理Hela细胞,用流式细胞仪方法检测细胞凋亡及细胞周期的变化,用RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2、bax表达。结果 10、20、40 mg/L Rg3作用Hela细胞24 h后的凋亡率分别为(5.6±1.4)%、(10.3±2.7)%、(21.2±4.9)%,均高于对照组(P<0.01);同时随着Rg3浓度的增加,G2/M期细胞比例升高,Bcl-2表达明显降低,bax基因表达明显升高(P<0.01)。结论 Rg3能将Hela细胞阻滞在G2/M期,通过上调bax和下调Bcl-2表达诱导肿瘤细胞凋亡。其作用呈浓度依赖性。     

白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡及其机制

目的探讨白藜芦醇诱导人宫颈癌Hela细胞的凋亡作用及其分子机制。方法应用不同浓度的白藜芦醇作用于人宫颈癌Hela细胞,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测药物对细胞的增殖抑制率;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡、细胞周期分布：免疫组化法检测Survivin及Caspase-3的表达。结果白藜芦醇能明显抑制Hela细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。经白藜芦醇处理Hela细胞后,FCM分析发现各实验组S期细胞比例增高,G2／M期细胞比例减少,凋亡率明显高于对照组,并呈剂量依赖性（P〈0．01）;各实验组Heal细胞Survivin的表达均低于对照组,而Caspase-3的表达均高于对照组（P〈0．01）。结论白藜芦醇能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与抑制Survivin的表达、上调Caspase-3的表达有关。     

靶向survivin基因shRNA抑制宫颈癌裸鼠移植瘤生长的研究

组化结果 显示,HeLa-s2组裸鼠survivin蛋白表达、FVlR.g表达显著降低,MVD值降至23.38±3.14;TUNEL染色结果 显示,HeLa-s2组裸鼠细胞凋亡明显增多,AI值达22.73%±1.37%.HeLa-NC组、HeLa-U6 neo组各指标检测结果 与HeLa组相比均无明显差异(P>0.05).结论 靶向survivin基因shRNA可通过下调移植瘤组织survivin蛋白表达降低其MVD,从而抑制移植瘤生长并促进其凋亡.     

宫颈癌细胞摄取99TcmN(NOEt)2与99Tcm-MIBI动力学对比研究

目的研究99Tcm-氮-二(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐)[N(NOEt)2]在人宫颈癌Hela细胞中的摄取动力学.方法用放射性核素示踪法研究人宫颈癌Hela细胞在37 ℃和22 ℃时对99TcmN(NOEt)2和99Tcm-甲氧基异丁基异腈(MIBI)的摄取动力学.结果 Hela细胞摄取99TcmN(NOEt)2的峰值为46.15%,99Tcm-MIBI为12.60%(P<0.01);5 min时Hela细胞摄取99TcmN(NOEt)2为峰值的65%,99Tcm-MIBI为50%(P<0.05);60 min时99TcmN(NOEt)2在Hela细胞中的滞留率为66.02%,99Tcm-MIBI为56.67%(P<0.05);Hela细胞对99TcmN(NOEt)2的摄取不依赖温度,99Tcm-MIBI摄取则呈温度依赖性.结论 99TcmN(NOEt)2可能较99Tcm-MIBI更适用于肿瘤显像,有潜在的临床应用价值.     

顺铂诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡后氧自由基水平的变化

 目的 探讨顺铂诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡后氧自由基水平的变化特点.方法 应用MTT比色法、流式细胞术、电子显微镜观察化疗前后Hela细胞活性、细胞周期,以及凋亡形态的改变;用化学比色法检测细胞凋亡前后细胞内丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的含量.结果 顺铂处理Hela细胞48 h的IC50值为3 mg/L,当DDP浓度在3 mg/L以下时,对Hela细胞无明显毒性作用,超过此浓度时,其毒性呈剂量效应关系(P<0.001);与亲本细胞相比较,Hela+DDP细胞的G2期细胞数增多,为(90.80±8.37)%,而G1、S期的细胞数明显减少,分别为(30.84±8.02,5.30±0.60)%.扫描及透射电镜下可观察到典型的凋亡早期细胞形态学改变;当DDP作用48 h后,细胞内SOD的活性比对照组显著降低(P<0.05),细胞内的脂质过氧化产物MDA的含量与对照组相比显著升高(P<0.01),抗氧化剂GSH的含量较对照组明显降低(P<0.05).结论 经DDP可诱导Hela细胞的凋亡,其机制可能与细胞的氧化损伤有关.     

Radiolabeled peptides for targeting cholecystokinin-B/gastrin receptor-expressing tumors.

The high sensitivity of pentagastrin stimulation in detecting primary or metastatic medullary thyroid cancer (MTC) suggests widespread expression of the corresponding receptor type on human MTC. Indeed, autoradiographic studies have demonstrated cholecystokinin (CCK)-B/gastrin receptors not only in more than 90% of MTCs but also in a high percentage of small cell lung cancers, some ovarian cancers, astrocytomas and potentially a variety of adenocarcinomas. The aim of this study was to systematically screen and optimize, in a preclinical model and a pilot clinical study, suitable radioligands for targeting CCK-B receptors in vivo. METHODS: A variety of CCK/gastrin-related peptides, all bearing the C-terminal CCK receptor-binding tetrapeptide sequence Trp-Met-Asp-PheNH2 or derivatives thereof, were studied. They were radioiodinated by the lodogen or Bolton-Hunter procedures. The peptides were members of the gastrin or CCK families, which differ by the intramolecular position of a tyrosyl moiety. Their stability and affinity were studied in vitro and in vivo; their biodistribution and therapeutic efficacy were tested in nude mice bearing subcutaneous human MTC xenografts. Diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA) derivatives of suitable peptides were synthesized successfully, and their preclinical and initial clinical evaluations were performed, labeled with 111In. RESULTS: All members of the CCK or gastrin families were stable in serum (with half-lives of several hours at 37 degrees C); nevertheless, the stability of those peptides bearing N-terminal pGlu residues or D-amino acids was significantly higher. In accordance with their comparably low affinity, nonsulfated members of the CCK family showed fairly low uptake in the tumor and other CCK-B receptor-expressing tissues. Sulfated CCK derivatives performed significantly better but also displayed a comparably high uptake in normal CCK-A receptor-expressing tissues. This effect was probably due to their similar affinity for both CCK-A and CCK-B receptors. Best tumor uptake and tumor-to-nontumor ratios were obtained with members of the gastrin family because of their selectivity and affinity for the CCK-B receptor subtype. Pilot therapy experiments in MTC-bearing animals showed significant antitumor efficacy compared with untreated controls. DTPA derivatives of minigastrin were successfully developed. In a pilot clinical study, radioiodinated and 111In-labeled derivatives showed excellent targeting of physiological CCK-B receptor-expressing organs, as well as all known tumor sites. CONCLUSION: CCK/gastrin analogs may be a useful new class of receptor-binding peptides for diagnosis and therapy of CCK-B receptor-expressing tumors, such as MTC or small cell lung cancer. Nonsulfated gastrin derivatives may be preferable because of their CCK-B receptor selectivity, hence lower accretion in normal CCK-A receptor-expressing organs.     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。     

缺氧诱导的UCHL5增强宫颈癌Hela细胞辐射抗性

目的 研究缺氧诱导的泛素羧基末端水解酶L5（UCHL5）在调节宫颈癌Hela细胞辐射敏感性中的作用。 方法 以宫颈癌Hela细胞为研究对象,1% O2条件下培养观察UCHL5表达水平的变化。采用Western blot和实时定量聚合酶链反应（PCR）检测慢病毒载体感染Hela细胞后稳定调变UCHL5的效率,转录本分为空白对照组、过表达对照组、过表达UCHL5组转录本1~4和沉默对照组、沉默UCHL5组转录本1~2。将实验所用的细胞分为过表达对照组、过表达UCHL5组、沉默对照组和沉默UCHL5组。采用流式细胞术检测8 Gy γ射线照射48 h后细胞的凋亡率;采用细胞克隆形成实验检测0、2、4、6 Gy γ射线单次照射培养2周后4组细胞的克隆形成率;采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测4组细胞培养1周后的增殖率以及联合0、2、4、6、8、10 Gy γ射线照射后的增殖率。使用基因表达谱数据动态分析癌症基因组图谱数据库宫颈癌组织和正常组织中抗缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与UCHL5表达的相关性。采用双荧光素酶报告基因实验观察HIF-1α对UCHL5的激活作用。组间比较采用单样本t检验,采用Pearson检验进行相关性分析。 结果 缺氧可诱导宫颈癌Hela细胞UCHL5的表达。Western blot和实时定量PCR结果显示,感染后的Hela细胞可显著上调或下调UCHL5的表达,其中,过表达UCHL5组转录本2和沉默UCHL5组转录本2的表达均较高,所以选择此2种转录本进行后续实验。克隆形成实验结果显示,与接受相同剂量照射的过表达对照组相比,上调UCHL5增加了Hela细胞的克隆形成率,在0 、2、4、6 Gy剂量照射后克隆形成率的差异均有统计学意义（t=14.16、19.22、8.76、6.79,均 P<0.05）。 流式细胞术结果显示,与沉默对照组相比,沉默 UCHL5 促进了 Hela 细胞的凋亡（t=10.29,P<0.05）,增加了 γ 射线诱导的细胞凋亡率 (t=52.01, P<0.05)。MTT 实验结果显示,与过表达对照组相比,上调 UCHL5 可升高宫颈癌 Hela 细胞的增殖率,增殖率在第3天时差异有统计学意义 (t=3.905,P<0.05);与过表达对照组相比,等剂量照射 UCHL5 上调组升高了受照细胞的增殖率,在剂量为6、8、10 Gy时,细胞的增殖率差异均有统计学意义（t=3.40、4.06、3.68,均P<0.05）。宫颈癌组织中 HIF-1α 表达水平和UCHL5 表达水平呈正相关（R=0.31,P<0.01）,双荧光素酶报告基因结果显示 HIF-1α 结合并激活 UCHL5 启动子的活性,其活性增加了2.5倍（t=30.47,P<0.05）。 结论 缺氧条件下,宫颈癌Hela细胞中UHCL5的诱导表达降低了细胞的辐射敏感性,其潜在的机制可能与HIF-1α转录激活UCHL5的表达有关。     

New oily agents for targeting chemoembolization for hepatocellular carcinoma

PURPOSE: The evaluation of new oily agents for targeting chemoembolization for hepatocellular carcinoma. METHODS: Five types of oily preparation were injected into the hepatic artery of 54 rabbits inoculated with VX2 carcinoma cells in order to evaluate (1) the safety of these preparations, (2) their histologic distribution and the amount of agents remaining at tumor sites, and (3) computed tomographic (CT) images obtained. Of these preparations, three were made by mixing non-iodinated poppy seed oil and a thickener and then adjusted to have a viscosity lower than, equal to, or higher than that of lipiodol. A fourth preparation was a mixture of lipiodol and a thickener with a higher viscosity than lipiodol alone, and the fifth preparation was lipiodol alone. RESULTS: (1) No injury to the hepatic parenchyma was observed hematologically or histologically. (2) With increase in the viscosity, a significantly larger amount of agent remained at the tumor site. No agent was present at normal sites 14 days after intraarterial injection, regardless of which preparation was given. (3) On CT scans following intraarterial injection, tumor cells were visibly deeply stained in the non-iodinated preparation groups, while the lipiodol groups were not evaluable because of excessively high attenuation. CONCLUSION: The non-iodinated oily preparations and highly viscous oily preparations developed in the present study were more useful than lipiodol for treatment of hepatic tumors.