Ski在大鼠活化星形胶质细胞中表达的变化

目的:探究Ski在大鼠正常及活化星形胶质细胞中的表达及随时间变化的规律。方法:提取大鼠大脑皮质,分离星形胶质细胞,体外培养。采用LPS刺激和细胞划痕损伤2种方法活化星形胶质细胞,均采用Western blot法检测各个时点2种活化星形胶质细胞中Ski和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白表达情况,利用间接免疫荧光法检测Ski蛋白在星形胶质细胞中的表达定位。结果:GFAP蛋白在星形胶质细胞中固有表达,LPS活化和划痕损伤后表达均上调。Ski在正常星形胶质细胞中呈低表达状态,1 mg/L LPS活化星形胶质细胞后,Ski表达开始增加,4 d时表达量最高(P0.05),6 d时开始下降,但仍高于未活化组;细胞划痕损伤后Ski蛋白表达情况与上述情况高度一致。Ski在正常及LPS活化6 d星形胶质细胞中表达主要集中在胞核,LPS活化后2和4 d时在胞质中出现明确的Ski表达。结论:Ski蛋白表达于星形胶质细胞,并在活化星形胶质细胞中表达上调。由此,我们推测Ski蛋白可能调控星形胶质细胞的活化、增殖等过程。     

TAAR1-EAAT2通路抑制乳鼠星形胶质细胞的谷氨酸摄取能力北大核心CSCD

目的研究多巴胺(DA)对原代星形胶质细胞谷氨酸(Glu)摄取能力的影响,以及DA通过痕量胺相关受体1-兴奋性氨基酸转运体2(TAAR1-EAAT2)信号通路对星形胶质细胞Glu摄取能力的影响。方法采用Amplex Red谷氨酸测定试剂盒测定经过DA处理的原代星形胶质细胞对Glu摄取含量的变化,反转录PCR检测TAAR1、EAAT2 mRNA水平,Western blot法检测TAAR1、EAAT2蛋白水平;采用TAAR1小干扰RNA(siRNA)和TAAR1质粒转染DA处理后的原代星形胶质细胞,Western blot法检测EAAT2表达水平并采用Amplex Red谷氨酸测定试剂盒测定培养上清液Glu含量。结果 DA处理的原代星形胶质细胞EAAT2水平降低,TAAR1水平增加,培养上清液Glu含量上升。DA处理经TAAR1 siRNA转染后的原代星形胶质细胞,上调EAAT2水平,培养上清液中Glu含量减少;DA处理经TAAR1质粒转染后的原代星形胶质细胞,则EAAT2降低,培养上清液中Glu的含量增加。结论 DA通过影响星形胶质细胞TAAR1-EAAT2信号通路,减弱细胞Glu摄取能力,引起细胞外Glu蓄积,从而损伤星形胶质细胞的功能。     

氯喹抑制体外培养星形胶质细胞的激活

目的研究氯喹对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用,为癫痫的治疗提供实验依据。方法分离新生SD大鼠海马,体外培养星形胶质细胞,经纯化鉴定后分为:对照组、戊四氮(PTZ)组、氯喹干预组(25、50和75 mg/L),经相应处理后,分别用MTT法、免疫荧光、Western blot测定星形胶质细胞数量及活性、星形胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及CyclinD1的表达量。结果与对照组比较,PTZ可激活星形胶质细胞的增殖,使GFAP、CyclinD1的表达量增加(P<0.05);与PTZ组比较,氯喹阻滞了PTZ激活的星形胶质细胞的增殖(P<0.05);氯喹可抑制PTZ激活星形胶质细胞异常增加的GFAP的表达;氯喹可抑制PTZ激活星形胶质细胞的CyclinD1的表达量(P<0.05);与对照组相比,3种结果均显示75 mg/L氯喹对体外培养星形胶质细胞激活的抑制作用较强,并可维持其在正常范围。结论氯喹具有抑制PTZ激活体外培养星形胶质细胞的作用,其可能通过抑制星形胶质细胞的增殖来发挥抗癫痫作用。     

两型星形胶质细胞损伤后胰甘油三酯脂酶的表达

目的:通过建立两型星形胶质细胞体外机械损伤模型,于损伤后不同时间点检测两型星形胶质细胞中胰甘油三酯脂酶(PTL)的表达变化。方法:采用震荡培养和差速贴壁法分离纯化新生SD大鼠的1型星形胶质细胞(T1As)和2型星形胶质细胞(T2As),以real-time PCR和Western Blot分别检测损伤后的两型星形胶质细胞中PTL mRNA和蛋白表达变化。结果:损伤后两型星形胶质细胞中PTL表达均出现先升高后降低的趋势,而在T2As中的表达远高于在T1As中的表达水平(P<0.01)。结论:PTL在T2As中高表达提示,中枢神经系统损伤后再生与修复过程中,T2As对脂质代谢及髓鞘形成发挥作用。     

氧糖剥夺诱导原代大鼠星形胶质细胞miR-21的表达变化

目的研究原代大鼠星形胶质细胞氧糖剥夺不同时间miR-21的表达,探讨miR-21是否参与了缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的活性变化。方法原代大鼠星形胶质细胞随机分为正常组和氧糖剥夺组,分别培养3、6、9和12h。CCK-8法检测各组星形胶质细胞的活力,real-time PCR方法检测各组星形胶质细胞miR-21的表达。结果氧糖剥夺组miR-21的表达水平随培养时间延长呈先升高后降低的动态变化,3h开始高于对照组水平(P<0.05),6h达高峰(P<0.05),随后下降,9h与对照组无差异(P>0.05),12h显著低于对照组(P<0.05)。氧糖剥夺不同时间星形胶质细胞活力变化与miR-21的变化趋势一致。结论 miR-21可能参与了缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的活性变化,发挥促增殖和抗凋亡的作用。     

IL-1β和NF-κB在慢性内侧颞叶癫痫模型中的相互作用

目的:观察白介素1β(IL-1β)与核因子-κB(NF-κB)在大鼠内侧颞叶癫痫(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)模型中的表达变化;体外培养的星形胶质细胞经IL-1β和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)预处理后,观察其增殖和NF-κB表达变化。方法:利用匹罗卡品诱导SD大鼠发作癫痫制成MTLE模型,根据自发发作出现和稳定时间分为急性期对照组(AC,制模后2 h)、急性期癫痫组(AS)、潜伏期对照组(LC,制模后3周)、潜伏期癫痫组(LS)、慢性期对照组(CC,制模后8周)和慢性期癫痫组(CS)。体外培养的星形胶质细胞分为对照组、IL组和PDTC+IL组,利用凝胶迁移电泳(EMSA)、免疫印迹(WB)、酶联免疫吸附(ELISA)和免疫组织化学(IHC)的方法观察IL-1β和NF-κB的表达变化;MTT检测星形胶质细胞的增殖活化程度。结果:匹罗卡品诱导的MTLE模型大鼠海马内IL-1β和NF-κB在急性期、潜伏期和慢性期表达均增加,但以急性期和慢性期明显;IL-1β可以促进体外培养的星形胶质细胞增殖、上调星形胶质细胞内NF-κB的表达,而PDTC可以明显抑制IL-1β的上述作用。结论:IL-1β通过NF-κB促进大鼠星形胶质细胞的活化增殖,这一改变可能与MTLE发病密切相关,探讨其机制可能为MTLE的治疗提供新的靶点。     

miRlet7b在氧糖剥夺诱导原代大鼠增殖星形胶质细胞的表达

目的研究miRlet7b在氧糖剥夺诱导原代Wistar大鼠增殖星形胶质细胞的表达,探讨缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞增殖的分子机制。方法原代Wistar大鼠星形胶质细胞随机分为实验组(氧糖剥夺诱导的增殖组)和对照组(正常培养组)。EdU掺入法检测两组细胞的增殖,Western blot检测VEGF蛋白表达,real-time PCR方法检测两组细胞miRlet7b mRNA的表达。结果实验组EdU阳性细胞率,VEGF蛋白表达水平显著高于对照组(P0.01),而实验组miRlet7b mRNA的表达水平显著低于对照组(P0.01)。结论 MiRlet7b mRNA表达下调可能是缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞增殖的分子机制之一,上调VEGF可能促进星形胶质细胞增殖。     

S100A9通过增加小鼠星形胶质细胞的谷氨酸分泌促进神经元损伤

目的:研究钙防卫蛋白S100A9刺激体外星形胶质细胞后细胞外谷氨酸浓度变化及其对神经元影响和调控机制。方法:分离培养新生C57BL/6小鼠大脑皮层星形胶质细胞和神经元；Amplite荧光法检测星形胶质细胞培养上清谷氨酸浓度；Real time RT-PCR和Western Blot分别检测星形胶质细胞谷氨酸转运体(GLT-1) mRNA和蛋白表达；Fluo-4荧光探针法检测星形胶质细胞胞内Ca²⁺浓度；转录组测序并结合KEGG分析筛选星形胶质细胞谷氨酸浓度变化的调控机制；S100A9刺激星形胶质细胞的培养上清(CS)干预神经元后，末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)检测神经元凋亡，CCK-8试剂盒检测神经元存活。结果:S100A9刺激星形胶质细胞后细胞外谷氨酸浓度增加，GLT-1 mRNA和蛋白表达减少，细胞内Ca²⁺浓度增加。差异表达基因KEGG富集在核因子-κB(NF-κB)信号通路、toll样受体(TLRs)信号通路和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。培养上清组神经元凋亡率高于对照组。结论:S100A9可能通过激活TLR4/NF-κ...     

腺苷预处理对氧糖剥夺/复氧糖诱导的星形胶质细胞及脂质运载蛋白-2表达的影响

目的:探讨在氧糖剥夺/复氧糖(OGD/R)情况下腺苷预处理对体外培养星形胶质细胞的影响和脂质运载蛋白-2(LCN-2)表达的影响及其意义。方法:原代培养的大鼠星形胶质细胞随机分为腺苷预处理对照组(Ado-treated control)、对照组(Control)、实验组(ADO/R)和模型组(OGD/R)。用MTT法检测各组细胞活力,ELISA检测各组OGD/R后细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的浓度,免疫荧光及免疫印迹检测各组LCN-2的相对表达。结果:腺苷预处理对照组与对照组的细胞活力、LDH浓度和LCN-2的表达量均无明显差别。与腺苷预处理对照组、对照组相比,模型组细胞损伤程度和LCN-2的表达量均明显升高。与模型组相比,实验组细胞损伤程度和LCN-2的表达量均明显降低。结论:腺苷可以通过减少LCN-2的释放明显改善OGD/R所引起的星形胶质细胞的损伤,从而增强脑组织对缺血再灌注损伤的耐受。     

氧糖剥夺诱导原代大鼠星形胶质细胞增殖反应中microRNA-125b的表达变化

目的研究氧糖剥夺诱导原代大鼠星形胶质细胞增殖过程中microRNA-125b的表达,探讨microRNA-125b是否参与了缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的增殖。方法原代大鼠星形胶质细胞随机分为正常组和氧糖剥夺组,分别培养3、6和9h。EdU掺入法检测各组星形胶质细胞的增殖,real-timePCR方法检测各组星形胶质细胞microRNA-125b的表达。结果氧糖剥夺组microRNA-125b的表达水平随培养时间延长呈先升高后降低的动态变化,3h开始高于对照组水平(P0.05);6h达高峰(P0.01),随后下降,9h与对照组无差异(P0.05)。氧糖剥夺不同时间星形胶质细胞增殖变化与microRNA-125b的变化趋势一致。结论 miroRNA-125b可能参与缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的增殖。     

GFAP reactivity,apolipoprotein E redistribution and cholesterol reduction in human astrocytes treated with α-synuclein

α-Synuclein (α-syn) is an abundant neuronal protein expressed at the synapse. In neurodegenerative disease α-syn accumulates in the extracellular space. Astrocytes present at neural synapses are thought to contribute to synaptogenesis through cholesterol release and normally exhibit increased glial fibrillary acid protein (GFAP) reactivity and apolipoprotein E (apoE) expression in neurodegenerative disease states. We proposed that extracellular α-syn treatment of human astrocytes would impact cholesterol levels and expression of GFAP and apolipoprotein E (apoE). Human astrocytes were treated with α-syn at different concentrations and time points to determine the effective membrane permeability of the peptide. After α-syn treatment, we analyzed apoE and cholesterol levels in the astrocyte membrane. Lastly, we performed immunocytochemistry for GFAP in control and α-syn treated cells. Our results indicate membrane apoE was reduced and redistributed from a nuclear and membranous dominated expression to the cytosol. Cholesterol levels were also reduced in the astrocyte cell membrane. GFAP expression was sharply increased in α-syn treated cells indicating that α-syn may contribute to reactive gliosis. Our results support the conclusion that astrocytes play a role in pathological mechanisms in synucleinopathies.     

异丙酚通过抑制p38激活下调氨处理的大鼠脑星形胶质细胞AQP4的表达并减轻细胞水肿

目的:研究异丙酚对氨处理的大鼠脑皮质星形胶质细胞水通道蛋白-4(AQP4)表达的影响以及相关机制。方法:原代培养Sprague Dawley大鼠大脑皮质星形胶质细胞。用细胞免疫荧光标记星形胶质细胞特异性的神经胶质酸性蛋白,星形胶质细胞纯度达95%以上的细胞备用。实验分为正常对照组(N)、氯化铵(5mmol/L)处理24h组(NH4Cl-24h)、p38抑制剂SB203580(10μmol/L)预处理组(SB)、异丙酚(10μmol/L)预处理组(P)和溶剂二甲亚砜(DMSO)对照组(C)。p38抑制剂、异丙酚和溶剂均预处理星形胶质细胞30min后再加入氯化铵作用24h。用光学显微镜观察各组细胞水肿情况,同时用Western blotting检测AQP4、p38和磷酸化p38的表达情况。结果:光学显微镜观察发现氯化铵处理后星形胶质细胞较正常对照组细胞肿胀明显,异丙酚和p38抑制剂预处理能明显减轻星形胶质细胞水肿。Western blotting检测发现各组星形胶质细胞总p38蛋白表达无明显变化(P0.05)。异丙酚预处理组和SB预处理组磷酸化p38蛋白和AQP4蛋白表达均较氯化铵处理组和溶剂对照组明显降低(P0.05)。结论:AQP4蛋白表达受p38信号途径的调节,异丙酚可通过抑制p38信号途径的激活,降低氨引起的星形胶质细胞AQP4蛋白表达上调,减轻细胞水肿。     

Immunohistochemical Study of Netrin-1 in the Spinal Cord with Rat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

To investigate whether netrin-1 is involved in autoimmune injury of the central nervous system, the expression of netrin-1 protein was analyzed in the spinal cord of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Western blot analysis revealed significantly increased content of netrin-1 in the spinal cords of rats at the peak stage of EAE, as compared with the levels in normal control animals (p < 0.01). Immunohistochemistry detected the netrin-1 protein in neurons, oligodendrocytes, astrocytes and vascular endothelial cells in the spinal cords of normal controls. In EAE-affected spinal cords, netrin-1 immunoreactivity was detected in infiltrating inflammatory cells at the peak stage as well as in neurons, oligodendrocytes and astrocytes. These results suggest that netrin-1 is transiently increased in rat EAE lesions, where it contributes to the modulation of rat acute EAE.     

Immunohistochemical study of netrin-1 in the spinal cord with rat experimental autoimmune encephalomyelitis

To investigate whether netrin-1 is involved in autoimmune injury of the central nervous system, the expression of netrin-1 protein was analyzed in the spinal cord of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Western blot analysis revealed significantly increased content of netrin-1 in the spinal cords of rats at the peak stage of EAE, as compared with the levels in normal control animals (p < 0.01). Immunohistochemistry detected the netrin-1 protein in neurons, oligodendrocytes, astrocytes and vascular endothelial cells in the spinal cords of normal controls. In EAE-affected spinal cords, netrin-1 immunoreactivity was detected in infiltrating inflammatory cells at the peak stage as well as in neurons, oligodendrocytes and astrocytes. These results suggest that netrin-1 is transiently increased in rat EAE lesions, where it contributes to the modulation of rat acute EAE.     

睫状神经营养因子对体外培养的星形胶质细胞细胞周期及Fos蛋白表达的影响

目的研究睫状神经营养因子（CNTF）对体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞（Ast）细胞周期及Fos蛋白表达的影响。方法通过体外纯化培养获取大鼠大脑皮质Ast,将CNTF加入培养液,作用相应的时刻点后,应用流式细胞仪测定细胞周期的变化,采用免疫细胞化学方法研究Fos蛋白的表达。结果CNTF作用Ast6垢,可显著促进细胞周期进程,表现为G0／G1期细胞百分比降低;S期＋G2／M期细胞百分比（增殖指数,poliferation index,PI值）升高。12h促增殖作用达高峰,24h、48h有所恢复,但PI仍明显高于对照组。CNTF作用于Ast 2 h后即可引起Fos蛋白的显著表达,并持续至24h,而糖皮质激素预处理可明显抑制Fos蛋白表达。结论CNTF可促进Ast增殖及Fos蛋白表达。     

大鼠脊髓星形胶质细胞培养方法的改良

目的:改进大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养方法,为研究脊髓星形胶质细胞的生物学作用及脊髓相关疾病提供实验模型.方法:新生1～2d的SD乳鼠,无菌操作下游离整段脊柱,将脊髓从椎管中冲出,机械吹打制成单细胞悬液,差速黏附处理以去除成纤维细胞成分.利用GFAP免疫荧光显色对培养细胞进行鉴定.结果:经原代和传代培养,获得的星形胶质细胞纯化率高达99%以上.结论:采用本实验室改进的方法,操作简便快捷,培养的大鼠脊髓星形胶质细胞生长良好,纯度高,为后续实验对脊髓星形胶质细胞的生物学作用研究奠定实验基础.     

氯喹对体外培养星形胶质细胞激活的抑制作用

  目的 研究氯喹对体外培养大鼠海马星形胶质细胞激活的抑制作用,为癫痫的治疗提供实验依据。方法 分离新生SD大鼠海马,体外培养星形胶质细胞,经纯化鉴定后分组：a 对照组;b 戊四氮（PTZ）组;c 氯喹干预组（25mg、50mg、75mg/L）,经相应处理后,分别运用MTT法、免疫荧光、western-blot测定星形胶质细胞数量及活性、星形胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及CyclinD1的表达量,并分析比较各组星形胶质细胞激活情况。结果 与b组比较,MTT法显示氯喹阻滞了PTZ激活的星形胶质细胞的增殖（P<0.05）;免疫荧光结果显示,氯喹可抑制PTZ激活星形胶质细胞异常增加的GFAP的表达;western-blot结果显示氯喹可抑制PTZ激活星形胶质细胞的CyclinD1的表达量（P<0.05）;与a组比较,3种结果均显示75mg/L氯喹对体外培养星形胶质细胞激活的抑制作用较强,并可维持其在正常范围。结论 氯喹具有抑制PTZ激活体外培养星形胶质细胞的作用,其可能通过抑制星形胶质细胞的增殖来发挥抗癫痫作用。     

Netrin-1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的:研究netrin-1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法:用高糖培养人肾小管上皮HK-2细胞,real-time PCR和Western blot测定细胞中netrin-1的表达水平。用过表达netrin-1慢病毒感染HK-2细胞,检测其对高糖环境下HK-2细胞中netrin-1表达的影响。流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定cleavedcaspase-3蛋白水平,2,4-二硝基苯肼法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸法检测培养液中丙二醛(MDA)含量,ELISA法测定培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果:高糖处理后的HK-2细胞中netrin-1的mRNA和蛋白水平均明显下调(P 0.05)。过表达netrin-1慢病毒能够上调高糖环境下HK-2细胞中netrin-1的表达水平(P 0.05)。高糖可促进肾小管上皮细胞分泌IL-1β和TNF-α,提高细胞培养液中LDH和MDA的水平(P 0.05),使肾小管上皮细胞的caspase-3活化并诱导细胞凋亡;上调netrin-1的HK-2细胞经高糖诱导后,细胞分泌的IL-1β和TNF-α减少,细胞中活化的caspase-3蛋白水平降低,培养液中LDH和MDA水平降低,细胞凋亡减少(P 0.05)。结论:上调netrin-1减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和炎性损伤,减少细胞凋亡。     

大鼠大脑中动脉缺血后海马星形胶质细胞反应的研究

目的:观察大鼠大脑中动脉缺血后皮层损伤侧海马星形胶质细胞反应的变化。方法:采用大鼠大脑中动脉阻塞再灌流模型,应用免疫印迹和免疫组织化学方法测定脑缺血后3 d、7 d以及30 d皮层损伤侧海马胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达,观察星形胶质细胞增殖的变化。结果: GFAP免疫组化结果显示,脑缺血后7d皮层损伤侧海马CA1、CA2区星形胶质细胞数量较假手术组增加且胞体增大;脑缺血后30 d皮层损伤侧海马CA1、CA2区呈胶质疤痕样改变。同时,免疫印迹法显示脑缺血后7 d皮层损伤侧海马GFAP表达增强;脑缺血后30 d皮层损伤侧海马GFAP表达增高更加明显。此外,免疫印迹法显示脑缺血后3 d皮层损伤侧海马PCNA蛋白表达水平升高;脑缺血后7 d PCNA蛋白表达水平达到峰值;脑缺血后30 d,PCNA蛋白表达水平降低,但仍高于假手术组。结论: 大鼠大脑中动脉缺血后可引起其皮层损伤侧海马星形胶质细胞过度反应和增殖。     

Cytokine-induced enhancement of calcium-dependent glutamate release from astrocytes mediated by nitric oxide

Cytokines are produced in the central nervous system (CNS) and exhibit various effects on neurons, microglia, and astrocytes. Astrocytes can release chemical transmitters, including glutamate, in a calcium-dependent manner, which may mediate communication between neurons and astrocytes. To date, no studies have been conducted on the effects of cytokines on calcium-dependent glutamate release from astrocytes. Here, we studied the effects of cytokines on calcium-dependent glutamate release. Cytokines enhanced glutamate release and induced the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the production of nitric oxide (NO). The inhibition of iNOS eliminated the cytokine-induced enhancement of glutamate release, and treatment with a NO donor, even in the absence of cytokines, increased glutamate release. Thus, cytokines enhance glutamate release, and this enhancement is mediated by NO.