色钉菇乙酸乙酯提取物对帕金森病模型小鼠黑质多巴胺神经元的保护作用

目的:探讨色钉菇乙酸乙酯提取物能否改善帕金森病(PD)小鼠的行为症状以及对黑质多巴胺(DA)能神经元保护作用。方法:以成年C57BL/6小鼠为对象,设置空白对照组、MPTP模型组和100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg三个剂量的色钉菇乙酸乙酯提取物的干预组。通过站立次数和爬杆得分等指标评价行为症状,以TH的免疫荧光方法检测存活的黑质DA能神经元,FJC染色法显示黑质致密部变性的DA能神经元。结果:在行为上,实验处理之前各组之间无显著性差异(P0.05);而实验处理后,于站立次数指标上,400 mg/kg剂量干预组显著地高于实验对照组(P0.05),与空白对照组无显著性差异(P0.05);在爬杆得分指标上,200 mg/kg组和400 mg/kg组均显著地高于实验对照组(P0.05),但与空白对照组无显著性差异(P0.05)。在TH标记的黑质多巴胺能神经元数量上,只有400 mg/kg组显著地高于实验对照组(P0.05),与空白对照组无显著性差异(P0.05)。而FJC标记的变性细胞只在MPTP组、100 mg/kg和200 mg/kg组表达,空白对照组和400 mg/kg组未见FJC阳性细胞。结论:色钉菇乙酸乙酯提取物能显著地改善PD的行为症状和保护黑质DA能神经元,且呈剂量依赖性。     

色钉菇乙酸乙酯相对SH-SY5Y细胞的保护作用

目的探讨色钉菇乙酸乙酯提取物对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导损伤的多巴胺能神经元的保护作用。方法以SH-SY5Y细胞系为对象,首先测定MPP+孵育48 h时的半致死量(IC50)。然后用25mg/L、50mg/L、100mg/L等剂量的乙酸乙酯提取物预先孵育4 h,随后加入1.0mmol/L(IC50值)MPP+孵育48 h。通过MTT法检测细胞活性;Hoechst染色法、AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测法观察细胞凋亡情况。利用DCFHDA检测色钉菇乙酸乙酯提取物对细胞内活性氧(ROS)水平的影响。结果 1.0mmol/L MPP+孵育48 h时达到半致死剂量,MPP+的损伤浓度确定为1.0mmol/L。预先经色钉菇乙酸乙酯相(50mg/L)孵育,可显著提高SH-SY5Y细胞的活力,降低细胞凋亡率。MPP+损伤后ROS水平急剧升高,而25mg/L、50mg/L、100mg/L乙酸乙酯提取物干预后ROS水平下降。结论 50mg/L色钉菇乙酸乙酯相可显著减轻MPP+对SH-SY5Y细胞的毒性损伤,具有显著的保护作用。     

鱼藤酮对多巴胺能神经元的损伤作用及机制

鱼藤酮等环境毒物的长期接触可能与帕金森病发病有关。鱼藤酮(Rotenone)是线粒体复合酶Ⅰ抑制剂，可以抑制多巴胺能神经元线粒体复合酶Ⅰ的活性、降低线粒体膜电位、诱导细胞内活性氧的产生，从而导致多巴胺能神经元α-突触核蛋白(α-synuclein)表达增加、路易小体(Lewy bodies)形成，DJ-1和Parkin的突变以及细胞微管破坏。     

脑内炎症对黑质多巴胺能神经元的选择性损伤作用

目的 探讨脑内炎症反应对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性变性作用.方法 健康SD雄性大鼠10只,随机分为实验组和对照组,实验组行脂多糖(LPS)右侧脑室定位注射,对照组注射生理盐水.注射后48周用免疫组织化学或组织化学法观察黑质多巴胺能、中缝核5-羟色胺能及基底核胆碱能3种不同类型神经元的变性及上述不同脑区小胶质细胞的激活情况.结果 免疫组织化学染色显示,LPS组在黑质、海马、纹状体、中缝核部位均可见到OX6阳性小胶质细胞,说明不同脑区均出现炎症反应.不同类型神经元染色结果显示,LPS组黑质多巴胺能神经元胞体变小、染色变浅、突起减少甚至消失,神经元数量比对照组减少40.1%(P<0.01);5-羟色胺能神经元及胆碱能神经元形态及数量均无明显改变.结论脑室注射LPS导致的脑内炎症反应可选择性引起黑质多巴胺能神经元变性损伤.     

尼古丁抑制脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性及相关机制

目的: 观察尼古丁对脂多糖(LPS)诱导的胎鼠中脑小胶质细胞激活的影响及对其白介素6(IL-6)分泌的影响,以探讨尼古丁对中脑多巴胺(DA)能神经元的保护机制.方法: 取孕14d SD大鼠,胎鼠中脑腹侧区组织,混合培养中脑神经元-胶质细胞,Elisa检测细胞不同时间点分泌IL-6的水平;免疫细胞化学术检测小胶质细胞特异的钙结合蛋白(Iba1)和标记DA能细胞的酪氨酸羟化酶(TH)的阳性细胞数.结果: 经LPS激活的小胶质细胞胞体增大,活化标记物Ibal表达上调;DA能细胞的数目减少,突起受损.Elisa方法测定显示10ng/ml LPS致小胶质细胞在8、24和72h分泌IL-6的量均增高;在尼古丁(100μmol/L)预处理组,小胶质细胞的激活被抑制,TH免疫阳性的多巴胺能神经元的数量增加,LPS+尼古丁组分泌IL-6的量减少,在不同时间点(8、24和72h)与LPS组比较差异均有统计学意义.结论: 尼古丁可抑制小胶质细胞的激活,保护多巴胺能神经元,抑制小胶质细胞炎性因子的释放可能是其主要保护机制.     

美满霉素对帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用

目的观察美满霉素(MC)对脂多糖(LPS)所致帕金森病(PD)大鼠黑质多巴胺能(DA)神经元损伤的保护作用。方法黑质内注射LPS制作PD大鼠模型。应用MC对实验动物进行处理。采用行为学、酪氨酸羟化酶(TH)、核因子-κB(NF-κB)等免疫组化及免疫印迹技术观察MC的神经保护作用。结果对照组大鼠无行为变化,PD组大鼠平均旋转圈数为196.90±9.52,MC组为120.03±10.50,差异非常显著(p<0.01)。免疫组化表明对照组TH阳性神经元数量较多,PD组神经元数量明显减少或消失(p<0.01),MC组TH阳性神经元数与PD组相比明显增加(p<0.01);对照组黑质仅见少数NF-κB阳性细胞,无明显核转位现象,PD组黑质NF-κB阳性细胞较多,部分细胞有明显核转位现象,与PD组相比,MC组NF-κB阳性细胞数明显减少(p<0.01);对照组黑质OX-42小胶质细胞呈分枝状,胞体较小突触细长,PD组黑质小胶质细胞大部分呈圆形,突起少而短甚至消失,与PD组相比,MC组呈激活状态的小胶质细胞数量明显减少。Western blotting分析结果相同。结论 MC可防护LPS所致黑质DA能神经元损伤,具有神经保护作用。     

针刺百会和大椎穴对帕金森病小鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的探讨针刺百会和大椎穴对帕金森病(PD)小鼠多巴胺能神经元的保护作用及可能机制。方法C57BL/6雄性小鼠随机分为5组:正常组、模型组、针刺组、美多巴组、针刺结合美多巴组(针美组)。后4组首先腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD动物模型,后3组造模后采取不同的治疗措施,造模后动物存活14d。采用爬杆法测量小鼠行为学改变,应用高效液相电化学内标法测定前脑单胺类神经递质含量,用免疫组织化学技术检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目。结果针刺、针美组小鼠爬杆时间较模型组短(P0.05)。与正常组比较,各组动物前脑内多巴胺及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸含量明显降低,3个治疗组与模型组比较虽然无明显差异,但从数值上看降低的程度较模型组低。造模后14d,模型组TH阳性神经元数目较正常组减少(P0.01),3个治疗组也较正常组减少(P0.01),但较模型组增多(P0.05)。结论针刺百会、大椎穴或针刺结合美多巴可改善PD小鼠的行为障碍,这种作用可能与减少多巴胺能神经元的丢失有关。     

重组人核糖核酸酶抑制因子对小鼠脑内多巴胺能神经元的保护作用

目的:观察重组人核糖核酸酶抑制因子对小鼠脑内多巴胺能神经元保护作用。方法:将重组的pGEX-6p-1-hRI转化到大肠杆菌Rosetta表达菌中,并对产物提纯得到谷胱甘肽核糖核酸酶抑制因子(GST-RI),选取健康C57BL/6品系小鼠,随机分为5组:模型对照组皮下注射MPTP(溶于三蒸水,pH8.5)20mg/kg,连续8d;实验给药组(低剂量组腹腔注射GST-RI0.5mg/kg);高剂量组(腹腔注射GST-RI1.0mg/kg);空白给药组(腹腔注射GST1.0mg/kg)每日分别2次注射,连续13d,同时予MPTP造模;空白对照组给等量生理盐水。各组同时进行爬杆、悬挂行为学实验。实验结果后,动物断头取脑,取纹状体,应用高效液相色谱法(HPLC)测定小鼠左侧纹状体内多巴胺(DA)和高香草酸(HVA)的含量;免疫组织化学方法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)的免疫反应活性。结果:PD模型小鼠均出现不同程度的行为障碍,得分较空白对照组明显降低;而实验给药组小鼠得分则显著回升,以高剂量组尤为明显。TH免疫组化结果显示:与空白对照组比较,PD模型小鼠中脑黑质致密部TH免疫反应阳性神经元明显减少;实验组TH阳性神经元数目明显多于对照组.HPLC结果显示:PD模型小鼠较空白对照组明显降低,HVA/DA比值升高,给药组小鼠纹状体内DA和HVA含量明显恢复,高剂量组HVA/DA比值降至正常。结论:GST-RI对PD小鼠黑质DA能神经元的形态与功能具有明显的保护作用。     

鱼藤酮对体外培养的大鼠中脑脑片多巴胺能神经元的毒性作用

目的研究鱼藤酮（rotenone）对多巴胺（DA）能神经元的早期毒性作用,并探索一种较理想的组织模型.方法采用界面组织培养法建立SD乳鼠的中脑脑片长期培养体系.加入鱼藤酮作用一定的时间,并用测定培养基中乳酸脱氢酶（LDH）活力、组织中DA含量以及进行酪氨酸羟化酶（TH）染色等技术观察它对整个脑片及脑片上DA能神经元的毒性效应.结果不同浓度的鱼藤酮作用24 h后,组织中DA含量随浓度增加明显下降,TH阳性神经元突起呈串珠样改变,数量减少甚至消失.低浓度鱼藤酮作用14 d后,脑片组织中的DA水平显著降低,但未见明显的DA能神经元形态学变化.结论建立了长期、稳定的中脑脑片培养体系;鱼藤酮对整个脑片以及脑片上DA能神经元的毒性作用具有浓度依赖性;功能性损伤早于形态学变化,突起的变性是形态学变化的早期特征.     

Genistein对体外培养的大鼠多巴胺能神经元的保护作用

为了探讨genistein(GST)对离体培养的Parkinson模型多巴胺能神经元的保护作用,本实验取孕14～16 d的SD大鼠胚胎中脑腹侧,常规体外培养。将培养细胞分为四组:正常对照组、E2+MPP+组、GST+MPP+组、MPP+组。用免疫细胞化学染色法观察培养物中TH阳性神经元的生长状况、观察神经元中微管相关蛋白-2(MAP-2)的染色情况。通过突触素(SYN)免疫荧光染色,观察各实验组突触数量的变化。结果显示:与正常对照组、E2+MPP+组以及GST+MPP+组相比,MPP+组TH阳性神经元数量少,SYN免疫阳性产物表达亦减少(P<0.05);MAP-2阳性染色的平均灰度减少约40%左右。而E2+MPP+组、GST+MPP+组中上述指标与正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究结果表明genistein对体外培养的多巴胺能神经元具有类似雌激素样的神经保护作用。     

Effects of IL-6 secreted from astrocytes on the survival of dopaminergic neurons in lipopolysaccharide-induced inflammation

The role of astrocytes in microglia-induced neuronal death remains controversial. In this study, astrocytes and astrocyte-derived conditioned media (ACM) supported the survival of dopaminergic neurons, and the former was more effective than the latter. In the presence of astrocytes, low concentrations of LPS enhanced the survival of dopaminergic neurons, while high concentrations attenuated survival. LPS dramatically induced astrocytes to secrete IL-6 in a dose-dependent manner with no effect on secretion of GDNF. Neuron–astrocyte cultures had highest secretion of GDNF, followed by ACM-treated neuron-enriched cultures. After neuron–astrocyte cultures treated with IL-6-neutralizing antibody, both effects of the enhanced and attenuated survival of dopaminergic neurons were abolished. Our results indicate that astrocytes play a protective role in the LPS-induced damage of dopaminergic neurons in certain circumstances, and the interaction between astrocytes and dopaminergic neurons may enhance the protective effect of astrocytes. Suitable activation of astrocytes increases the protective effect while excessive activation attenuates it, and IL-6 might medicate this dual action. The underlying mechanisms related to the secretion of GDNF and proinflammatory factors warrant further investigation.     

壮药赪桐乙酸乙酯部位及流份对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用

目的 筛选赪桐乙酸乙酯部位及不同洗脱梯度二氯甲烷-甲醇部位对炎症反应的抑制作用最强的流份。 方法 使用MTT法确定壮药赪桐乙酸乙酯部位及不同洗脱梯度二氯甲烷-甲醇部位对RAW264.7细胞安全给药浓度范围,通过ELISA法测定赪桐乙酸乙酯部位及不同洗脱梯度二氯甲烷-甲醇部位对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO、TNF-ａ、IL-12、IL-6、IL-1β含量,筛选对炎症反应的抑制作用最强的流份。 结果 赪桐乙酸乙酯部位及流份在0.06~2.0 mg/ml浓度范围内,赪桐乙酸乙酯部位及流份对细胞活力的抑制作用逐渐增强,浓度在0.5 mg/ml以上具有明显的细胞毒性,在0.5 mg/ml以下对细胞活力具有增强作用。二氯甲烷-甲醇洗脱部位高剂量能抑制炎症因子IL-12、IL-6、TNF-ａ、IL-1β释放,对NO的分泌没有抑制作用。 结论 赪桐乙酸乙酯部位及不同洗脱梯度的二氯甲烷-甲醇部位抗炎机制是通过抑制NO、TNF-ａ、IL-12、IL-6、IL-1β炎症因子的分泌,二氯甲烷-甲醇（50:1）洗脱部位和二氯甲烷-甲醇（30:1）洗脱部位的抗炎能力较强。     

13-甲基十四烷酸对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用

目的探讨13-甲基十四烷酸(13-MTD)对氧反常诱导大鼠胚脑皮质神经元凋亡和形态学损伤的保护作用。方法原代培养大鼠胚脑皮质神经元,并以神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光法鉴定。将神经细胞随机分为正常对照组、模型组和不同剂量13-MTD组,每组设6个复孔。氧糖剥夺3h/再复氧糖24h(OGD3h/R24h)方法制备神经元氧反常模型,于再复氧糖即刻分别给予13-MTD 5、10、20、40mg/L干预。倒置相差显微镜下观察神经细胞形态改变;磺酰罗丹明B(SRB)法测定神经细胞存活率;吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色法观察神经细胞凋亡;透射电子显微镜下观察神经元超微结构的改变。结果与正常组比较,模型组神经元呈现病理改变,神经细胞存活率显著下降(P0.01),细胞凋亡显著增多(P0.01),神经元超微结构损伤明显,可见核内染色质边集或凝聚成块状,胞质内细胞器明显减少甚至消失,线粒体肿胀、嵴断裂甚至消失等;与模型组比较,不同剂量的13-MTD可有效改善上述变化(P0.05,P0.01),使神经元形态及其超微结构损伤明显恢复,且存在剂量依赖关系,以13-MTD 20mg/L改善更显著(P0.01)。结论 13-MTD对氧反常诱导的大鼠胚脑皮质神经元损伤具有明显保护作用,其可能通过改善神经细胞形态和线粒体超微结构损伤,减少神经元凋亡,提高细胞存活率。     

切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物联合诱导海马NSCs向胆碱能神经元的分化

为探讨切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物(extract of ginkgo bilobo,EGb)在海马NSCs向胆碱能神经元定向分化中的作用,分别制备大鼠穹窿海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离扩增的NSCs球分成4组,应用不同的培养液促其分化:(1)联合组:含切割侧海马提取液和银杏内酯的DMEM/F12培养基;(2)提取液组:含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(3)EGb组:含银杏内酯的DMEM/F12培养基;(4)对照组:含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基。培养14d后行ChAT免疫荧光检测,计算ChAT阳性神经元的分化率,图像处理细胞面积和周长。结果显示联合组各项指标均明显优于其它各组(P<0.01);提取液组、EGb组各项指标也均优于对照组(P<0.05);细胞面积提取液组优于EGb组(P<0.05),细胞周长EGb组优于提取液组(P<0.05),两组ChAT阳性神经元分化率无明显差异(P>0.05)。上述提示切割穹窿海马伞的海马提取液和EGb联合应用可诱导海马NSCs分化为更多、更为成熟的胆碱能神经元。     

Differential effects of activating D1 and D2 receptors on electrophysiology of neostriatal neurons in a rat model of Parkinson's disease induced by paraquat and maneb

Neostriatum plays an important role in the pathophysiology of Parkinson's disease (PD). However, the changes of sensitivity of dopamine receptors of neostriatal neurons in PD have been less addressed in vivo. In the present study, systemic exposure to paraquat and maneb induced Parkinsonian symptoms and neuronal loss of substantia nigra pars compacta. Using single-unit recording methods, three types of neostriatal neurons were recorded including medium spiny-like neurons, large aspiny-like neurons and fast-spiking interneurons. In the exposed rats, increased firing activity of neostriatal neurons was revealed when compared to control rats. Following D1 receptor agonist, SKF38393 and D2 receptor agonist, LY171555 iontophoretically administrated respectively, effects of increase and decrease in firing activity were both observed in neostriatal neurons. However, stronger inhibitory effects of activating D1 receptors and weaker excitatory effects of activating D2 receptors were found in the exposed rats as compared to controls. It indicated that differential changes of sensitivity of D1 and D2 receptors in Parkinson's disease were related to the modulation of the imbalance between D1-receptor-dependent striatonigral direct pathway and D2-receptor-dependent striatopallidal indirect pathway. Our results illustrate the electrophysiological changes of in vivo neostriatal neurons in Parkinson's disease, thereby providing insight into the regulatory mechanisms of dopamine-mediated physiology.     

Different effects of anti-sonic hedgehog antibodies and the hedgehog pathway inhibitor cyclopamine on generation of dopaminergic neurons from neurospheres of mesencephalic precursors.

Production of dopaminergic neurons from stem/precursor cells for transplantation in Parkinson's disease has become a major focus of research. However, the inductive signals mediating this process have not been clarified. Reported data on the effects of Sonic hedgehog on differentiation of dopaminergic and serotonergic neurons from cultures of neural precursors are controversial. In the present study, cultures of proliferating neurospheres of mesencephalic precursors treated with anti-sonic hedgehog antibodies showed significantly less serotonergic and GABAergic cells and a markedly higher number of dopaminergic neurons generated from the neurospheres than control cultures. Treatment of the neurospheres with cyclopamine, which selectively inhibits sonic hedgehog signaling by preventing Smoothened activation, did not induce significant changes in generation of serotonergic and dopaminergic neurons. This suggests that Smoothened activation is not significantly involved in the above-mentioned effects and that sonic hedgehog may exert effects on the mesencephalic precursors that do not involve the canonical Patched-Smoothened-Gli signaling.