益肝康药物血清对大鼠肝星状细胞胞浆游离钙效应的抑制作用

目的研究益肝康药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙([Ca2 ]i)增高的作用。方法将32只健康雄性SD大鼠按随机数字表分为4组:肝纤维化模型益肝康组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40?L4溶液9周,然后灌服益肝康6d;肝纤维化模型对照组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40?L4溶液9周,然后灌服0·9%氯化钠溶液6d;正常大鼠益肝康组(8只)皮下注射等量精制橄榄油9周,然后灌服益肝康6d;正常对照组(8只)皮下注射等量精制橄榄油9周,然后灌服0·9%氯化钠溶液6d。结束后经下腔静脉取血并分离血清。用盲法,采用上述10%血清培养HSCs24h并负载好Fluo-3/AM后,使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测HSCs[Ca2 ]i。结果(1)经正常大鼠益肝康组及肝纤维化模型益肝康组大鼠血清预处理的HSCs,其[Ca2 ]i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P<0·05);且两者与正常对照组间差别均有显著性意义(P<0·05)。结论益肝康能抑制肝星状细胞[Ca2 ]i的升高,这可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。     

三甲益肝冲剂对肝纤维化大鼠肝组织结缔组织生长因子表达的影响

目的探讨复方中药三甲益肝冲剂(Sanjia-yigan granule,S-JG)对肝纤维化的预防机制和效果。方法雄性SD大鼠40只,随机分为模型组、复方丹参组、S-JG组和正常对照组各10只。模型组、复方丹参组、S-JG组均以二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型;模型组造模同时给予生理盐水灌胃,复方丹参组造模同时给予复方丹参口服液灌胃,S-JG组造模同时给予S-JG灌胃;正常对照组腹腔注射生理盐水并用自来水灌胃,共4周。4周后取肝组织标本,行HE和Masson染色,免疫组织化学法检测肝组织结缔组织生长因子(CTGF)。结果(1)肝脏病理学改变:模型组可见较粗的纤维间隔;复方丹参组、S-JG组可见稍细的纤维间隔。(2)Masson染色胶原纤维面积比较:模型组胶原面积较正常对照组显著增加(P<0.05),复方丹参组和S-JG组胶原面积均较模型组减轻(P<0.05);(3)免疫组织化学检测结果:模型组CTGF强阳性表达,S-JG组和复方丹参组组表达少于模型组。结论三甲益肝冲剂抗纤维化作用与其抑制肝组织中CTGF的表达有关。     

TGF-β和PDGF在肝纤维化进程中的研究进展

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β1)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是对肝纤维化的形成过程有重大影响作用的细胞因子,它们与肝纤维化的发生发展以及细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的代谢关系最为密切.学者们通过对肝纤维化疾病大量的实验研究,发现TGF-β1和PDGF在肝纤维化形成、发生及发展中扮演了重要角色.近年来提出了针对干预TGF-β1和PDGF的抗肝纤维化治疗新途径,在基因治疗及免疫治疗的研究方面取得了可喜的进展.本文简要总结了国内外学者关于肝纤维化中TGF-β1和PDGF的作用及以它们为靶点的药物开发新进展.     

血清PDGF水平对肝纤维化的诊断价值

目的探讨血清PDGF水平对肝纤维化的诊断价值。方法对100例临床诊断为慢性乙型肝炎或肝硬化的患者,行肝脏穿刺活检或术中活检,并对基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、透明质酸(HA)等四项肝纤维化相关血清学指标进行检测,50例健康人作为正常对照行纤维化相关血清学指标检测。将病例组血清学指标结果与肝活检病理结果及正常对照血清学指标结果进行对比分析,找出灵敏度(Se)、特异度(Spe)高的肝纤维化诊断指标。结果四项血清学指标含量均与肝纤维化程度及炎症分级呈正相关,S2以上纤维化患者与正常对照血清学指标比较均明显高于对照组,差异有统计学意义。C-Ⅳ在纤维化早期阶段无明显上升,从S3期开始升高;TIMP-1、PDGF、HA在纤维化各期之间比较差异均有统计学意义。ROC曲线分析,诊断S2以上纤维化血清PDGF-BB的AUC(0.886)最大,Se、Spe分别为78.7%和86%,其次为HA与TIMP-1;在判断硬化时,以血清PDGF-BB的AUC(0.893)最大,Se、Spe分别为82.4%和87.5%,其次为HA与TIMP-1。结论四项血清学指标中以PDGF-BB对肝纤维化的诊断价值较大,具有较高的Se和Spe,提示其可作为一项新的肝纤维化血清学诊断指标。     

益肝康对大鼠肝纤维化的防治作用

目的　研究中药益肝康对CCl4 和猪血清 (PS)所致的肝纤维化的防治作用。方法　采用CCl4 和PS 1 0周法制作SD大鼠肝纤维化模型 ,用中药益肝康治疗 1 4周。预防组在制模前 4周即开始预防用药 ,于制模结束时停止用药 ;治疗组在制模结束前 4周开始用药治疗 ,于制模结束后 1 0周停止用药。设正常对照组和模型对照组。进行Mas son染色肝组织病理切片检查 ,采用计算机图像分析系统对结果进行分析。结果　在两种模型中 ,对照组、预防组、治疗组假小叶数目、纤维间隔数目间的差别均有显著性意义 (P <0 0 5) ;PS造模各组肝组织纤维间隔宽度间的差别有显著性意义 (P <0 0 5 ,造模结束后第 4周者除外 )。结论　益肝康对上述两种造模方法所致的肝纤维化均具有明显的防治作用。造模前 4周即开始预防用药比造模结束前 4周开始治疗用药更能有效地防止大鼠肝纤维化的形成。     

大鼠肝纤维化中PDGF和TGF-β1的动态改变

目的　探讨肝纤维化过程中血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子 (TGF β1)表达的动态变化。方法　采用CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型 ,分别于造模的第 3、7、10周末处死动物 ,取肝组织石蜡包埋 ,制作组织芯片 ,免疫组织化学SP法检测PDGF、TGF β1的改变。结果　正常肝组织不表达或微弱表达PDGF、TGF β1,纤维化的肝组织PDGF、TGF β1表达明显增强 ,并随肝纤维化时间的延长而增强 (P <0 0 5 ) ,第 7、10周间表达差异无显著性。两者的表达呈正相关。结论　PDGF和TGF β1是参与肝纤维化发生发展的重要生长因子     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组。MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCsⅠ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。结果与空白对照组相比,1、10nmol/LAcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10nmol/L及0.1～100nmol/LAcSDKP的干预,分别显著抑制HSCsColⅠmRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10nmol/L和0.1、1nmol/LAcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达。结论本实验发现,AcSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1nmol/L时作用最为显著。其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关。     

蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的研究蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响。方法传代培养的HSC-T6与蕲艾提取液药物血清共同培养24h后,采用MTT法检测其对HSC增殖的影响,Elisa法检测TGFβ1蛋白表达情况。结果不同浓度蕲艾提取液药物血清(5%、10%、20%)与空白对照组及生理盐水血清组比较,能显著抑制HSC-T6增殖(P0.01)及TGFβ1蛋白的表达(P0.01)。结论蕲艾提取液药物血清可显著抑制HSC-T6增殖。     

抗纤Ⅰ号对肝星状细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究抗纤I号对肝星状细胞(HSC)的影响及抗肝纤维化的机制. 方法:用RT-PCR方法检测转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板衍生生长因子(PDGF) mRNA在HSC的表达,用Western Blot检测TGF-β1和PDGF蛋白的表达. 同时,应用MTT法观察HSC的生长曲线. 结果:抗纤I号复方药物血清作用于HSC后,与对照组和秋水仙碱组相比HSC增殖明显被抑制(P<0.05),同时TGF-β1和PDGF蛋白及mRNA的表达明显下降(P<0.05). 结论:抗纤I号复方药物血清能够抑制HSC增殖,下调TGF-β1和PDGF蛋白及mRNA的表达,这可能是该药抗肝纤维化的分子机制之一.     

Role of RhoA in platelet-derived growth factor-BB-induced migration of rat hepatic stellate cells

Background Although the migration of hepatic stellate cells （HSCs） is essential for hepatic fibrotic response, the detailed mechanisms involved are poorly understood. The aim of this study was to examine the role of Rho GTPases （especially RhoA） in platelet-derived growth factor （PDGF）-BB-induced migration of HSCs. Methods The migration of primary rat HSCs was evaluated using transwell Boyden chamber, while cytoskeletal changes were visualized by immunofluorescence staining of intracellular actins and vinculin. Quantitative real-time PCR and Western blotting analysis were used to detect the expression of Rho GTPases （RhoA, Racl and Cdc42） within HSCs and their activation was determined by glutathione S-transferase pull-down assay. Finally, the effects of RhoA on PDGF-BB-induced cell migration and cytoskeletal remodeling were analyzed using HSC-T6 cells stably transfected with constitutively active （CA, Q63L） or dominant negative （DN, T19N） RhoA mutants. Data were analyzed using SPSS 16.0 software. Student＇s t test was used to analyze differences between two groups and one-way analysis of variance （ANOVA） was used among multiple groups. Results Rapid cytoskeletal remodeling led to a significant increase in the motility of primary rat HSCs after haptotactic （direct） and chemotactic （indirect） stimulation by PDGF-BB： PDGF-BB caused a dramatic elevation in the levels of both total and active RhoA protein. However, the levels of mRNA for Rho GTPases, including RhoA, Racl and Cdc42, were unaffected. Furthermore, PDGF-BB induced increased formation of stress fibers and focal adhesions in HSC-T6 cells transfected with CA-RhoA, but not in HSC-T6 transfected with DN-RhoA. Surprisingly, both CA- and DN-RhoA-transfected HSC-T6 cells showed decreased migratory potential in the absence or presence of PDGF-BB compared with controls. Conclusions PDGF-BB induced cytoskeletal remodeling in rat HSCs and promoted their migration via regulation of intracellular RhoA. RhoA may be one of the determinants in PDGF-BB-induced HSC miaration.     

Effects of ribozyme targeting platelet-derived growth factor receptor β subunit gene on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells in vitro

Background Activation and proliferation of hepatic stellate cells (HSC) is essentially involved in the development and progression of hepatic fibrosis. The most potent growth factor for HSC is platelet-derived growth factor receptor (PDGF) and PDGF receptor β subunit (PDGFR-β) is the predominant signal transduction pathyway of PDGF which is overexpressed in activated HSC. This study investigated the cleavage activity of hammerhead ribozyme targeting PDGFR-β mRNA in HSC and the effect on biological characteristics of HSC.Methods Expression vector of anti-PDGFR-β ribozyme was constructed and transfected into rat activated HSC with lipofectamin. The positive cell clones were gained by G418 selection. The expression of PDGFR-β, α-smooth muscle actin, and typeⅠand type Ⅲ collagen were detected by using Northern blot, Western blot and immunocytochemical staining, respectively. The cell proliferation was determined with MTT colorimetric assay. The cell apoptosis was analyzed by using flow cytometry, acridine orange fluorescence vital staining and transmission electron microscopy.Results The expression of PDGFR-β at mRNA and protein level was markedly reduced in ribozyme-transfected HSC by 49%-57% (P&lt;0.05-0.01). The proliferation and α-smooth muscle actin expression of ribozyme-transfected HSC were significantly decreased (P&lt;0.05-0.01), and the type Ⅰ and type Ⅲ collagen synthesis were also reduced (P&lt;0.01). In addition, the proliferative response of ribozyme-transfected HSC to PDGF BB was significantly inhibited. Otherwise, the apoptotic cells were significantly increased in ribozyme-transfected HSC (P&lt;0.01), and typical apoptotic cells could be found under transmission electron microscopy.Conclusions The anti-PDGFR-β ribozyme effectively cleaved the target RNA and significantly inhibited its expression, which blocked the signal transduction of PDGF at receptor level, inhibited HSC proliferation and collagen synthesis, and induced HSC apoptosis. These results suggest that inhibiting PDGFR-β expression of HSC may be a new target for the therapy of liver fibrogenesis, and ribozyme may be a useful tool for inhibiting PDGFR-β expression.     

姜黄素对血小板衍生生长因子诱导活化的肝星状细胞细胞外基质的影响

目的 研究姜黄素对血小板衍生生长因子（PDGF）诱导活化的肝星状细胞细胞外基质沉积的干预机制。方法 以Western blotting和RT-PCR方法分别检测姜黄素对PDGF诱导活化的肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、细胞外基质主要成分I型前胶原（α1I胶原）和纤黏蛋白的表达,以及对调控细胞外基质降解平衡的基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9与其组织抑制剂（TIMP-1）蛋白与mRNA表达的影响。结果 姜黄素可显著下调α-SMA、α1I胶原和纤黏蛋白的蛋白与mRNA表达,减少细胞外基质的沉积;还可调节细胞外基质的降解平衡,表现为TIMP-1表达下调和MMP-2的表达上调。结论 姜黄素能够抑制PDGF诱导的肝星状细胞合成与分泌细胞外基质增加,促进细胞外基质降解,减少细胞外基质在肝脏中的沉积,进而发挥治疗肝纤维化的作用。     

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响

目的：探讨核心蛋白聚糖（ｄｅｃｏｒｉｎ）在肝纤维化形成机制中的作用。方法：在正常人肝细胞株Ｌ－０２及大鼠肝星形细胞株ＨＳＣ－Ｔ６体外培养体系中,分别加入不同质量浓度（０．０１,５,１０μｇ／ｍｌ）ｄｅｃｏｒｉｎ共培养不同时间后,进行细胞计数以及＾３Ｈ－ＴｄＲ和＾３Ｈ－Ｌｅｕ掺入量测定。结果：实验组经０．０１μｇ／ｍｌ ｄｅｃｏｒｉｎ作用４ｄ或６ｄ后,ＨＳＣ－Ｔ６和Ｌ－０２细胞增殖数量以及＾３Ｈ－Ｔ     

丹参素对PDGF-BB刺激下肝星状细胞的抑制作用

目的观察丹参素对PDGF-BB刺激下大鼠肝星状细胞活化增殖,Ⅰ、Ⅲ型胶原合成与分泌,ERK1/2和PI3K通道蛋白表达的影响,探讨丹参素抑制肝纤维化的分子机制。方法用不同浓度丹参素(0.250、0.125、0.062 mmol/L)、ERK通道特异性抑制剂UO126(20 nmol/L)和PI3K通道特异性抑制剂LY294002(20 nmol/L)分别作用于经血小板衍生生长因子PDGF-BB(10 ng/ml)处理的大鼠肝星状细胞(HSC)48 h,CCK8法检测HSC增殖活性,免疫化学染色法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原合成,酶联免疫吸附法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌,Western blot测定ERK1/2、p-ERK1/2、AKT和p-AKT蛋白表达。结果 PDGF-BB 10 ng/ml处理后,HSC增殖明显增加(0.139±0.009),丹参素能抑制PDGF-BB刺激大鼠HSC增殖的作用,并随丹参素浓度增加(0.062、0.125、0.250 mmol/L)细胞增殖受到的抑制作用越强(0.102±0.008、0.083±0.007、0.066±0.014,P<0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及分泌均显著减少(P<0.05),p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论丹参素可通过抑制PDGF-BB诱导的HSC增殖和活化,同时抑制与肝纤维化密切相关的MAPK、PI3K途径中ERK、AKT蛋白的磷酸化,负性调控肝纤维化过程,其机制可能与抑制ERK1/2和PI3K信号转导通路有关。     

牛磺酸抑制血小板衍生生长因子诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌

目的：观察牛磺酸对血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响，并探讨其作用的可能机制。方法：体外传代培养的大鼠系膜细胞，经一定量的牛磺酸和（或）PDGF作用48h后，用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，ELISA检测细胞外基质（Ⅳ型胶原及层粘连蛋白）含量，免疫细胞化学方法检测C－jun,C-fos的表达。结果：与对照组比较，10，20ng/ml PDGF可明显促进系膜细胞增殖，影响细胞周期，使G0－G1期细胞减少，S期细胞增加，并能明显促进细胞外基质的分泌及C-jun,C-fos的表达（P＜0．01），而20或40mmol/L牛磺酸作用于系膜细胞后，可明显抑制PDGF（20ng/ml)诱导的细胞增殖，细胞外基质分泌及C-jun,C-fos的表达。结论：牛磺酸对PDGF诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌有显著抑制作用，其机制可能与牛磺酸抑制C-jun,C-fos表达有关。     

虎杖苷抑制肝星状细胞增殖活化的作用和机制研究

目的:研究虎杖苷 (Polydatin) 在体外对HSC-T6细胞的影响,探讨虎杖苷抑制肝纤维化发生的作用及相关机制。方法:体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,分为对照组和虎杖苷低、中、高浓度（125、250、500 μmol/L）给药组。MTT法检测细胞增殖情况;比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性;酶消化法检测细胞培养上清液中羟脯氨酸（Hyp）的含量;蛋白印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达水平。多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐则采用LSD检验,若方差不齐采用Dunnett T3检验,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果:与对照组比较,虎杖苷125、250、500 μmol/L给药组细胞活力显著降低（F=252.01, P<0.001）,Hyp含量明显减少（F=16.50,P<0.05）,α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达显著减少（F=19.89、182.91, 均P<0.05）,且随着浓度的增加,抑制作用越强,呈一定的剂量依赖性;与对照组比较,虎杖苷125、250、500 μmol/L给药组Nrf2蛋白表达显著增加（F=23.70,P<0.05）,虎杖苷250、500 μmol/L给药组HO-1蛋白表达显著增加（F=12.40,P<0.01）,且随着浓度增加,上调作用越明显,呈一定的剂量依赖性。结论:虎杖苷通过抑制肝星状细胞增殖活化及胶原合成发挥抑制肝纤维化发生的作用,该作用可能与其上调Nrf2/HO-1通路有关。