人参总皂甙诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

【目的】观察人参总皂甙(GS)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。【方法】取成年SD大鼠骨髓细胞,采用密度梯度分离法与贴壁法结合获取MSCs,进行原代培养和克隆培养;采用流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD34和CD44以鉴定该法所获细胞是否为MSCs;对传至第8代的MSCs进行分组诱导,分别为GS组(终末浓度为 250 mg／L)、5-氮胞苷(5-aza)组(终末浓度为10μmoL／L)、GS 5-aza组(终末浓度分别为250 mg／L、10μmol／L),每组再分 3个亚组,分别对MSCs进行24、48、72 h诱导,并设空白对照组;采用共聚焦荧光显微镜观察细胞数及阳性细胞数,计算心肌样细胞转化率;采用免疫组化法检测分化的心肌样细胞的特异性蛋白结蛋白(Desmin)和肌钙蛋白(cTnI),采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测诱导前后心肌细胞特征性基因α-心肌肌球蛋白重链(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重链(β- MHC)的表达。【结果】分离培养后的细胞生长密集,形态呈纺锤状,表面抗原鉴定为CD44表达阳性,表明所获细胞为 MSCs;经GS、5-aza诱导后,MSCs分化成类心肌细胞,3组的心肌样细胞转化率无显著性差异(分别为38％、35％、39％); 免疫组化和RT-PCR检测结果显示Desmin、cTnI和MHC表达均阳性,阳性细胞呈梭形和成纤维细胞样形态,表明MSCs在 GS体外诱导下已向心肌样细胞转化,并具有心肌样细胞的特性。【结论】GS可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的] 探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 ( MSCs )向心肌样细胞分化的潜能.[方法] 取大鼠下肢骨骨髓,分离培养 MSCs,用 5-氮胞苷 ( 5-aza )定向诱导 24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白 ( cTnT )和心肌细胞结蛋白 ( desmin )表达,并通过 RT-PCR对肌球蛋白重链 ( MHC )在细胞中的表达进行鉴定.[结果] MSCs经 5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构.免疫组化检测示诱导后 MSCs的 cTnT阳性细胞数为 15%, Desmin表达强阳性, RT-PCR示诱导后 MSCs有 MHC表达.[结论] MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

【目的】探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。【方法】取大鼠下肢骨骨髓，分离培养MSCs，用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24h，相差显微镜下观察其形态变化，免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达，并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。【结果】MSCs经5-aza诱导后，部分细胞呈梭形，并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％，Desmin表达强阳性，RT—PCR示诱导后MSCs有MHC表达。【结论】MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞，是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为心肌样细胞的条件。方法抽取大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离MSCs进行培养、传代,在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,应用荧光免疫组织化学方法进行鉴定。结果大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观。诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,肌钙蛋白及Connexin43表达强阳性。结论大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：研究兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离、培养及向心肌细胞诱导分化的条件。方法：抽取兔髂骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化MSCs，第3代细胞（P3）用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD11b，CD90、CD29。以10μmol／L5-氮胞苷（5-aza）进行诱导分化，4周后，用倒置显微镜、透射电镜观察MSCs形态学变化及超微结构特征，RT—PCR检测心肌特异性β-肌球蛋白重链（β—MHC）、肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果：兔MSCs呈贴壁集落生长，流式细胞术检测显示P3细胞均一性在97％以上，纯度较高。诱导后细胞体积较诱导前增大，更加细长。14天后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。4周后，透射电镜下有肌丝、心房特殊颗粒及线粒体等心肌细胞超微结构形成。RT—PCR显示B—MHC、cTnI呈阳性反应。结论：MSCs在体外经5-aza诱导可以向心肌细胞进行分化。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell,MSC）经5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导在体外定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,RT—PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果5-氮杂胞苷诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成,RT—PCR检测显示有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结论经5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。     

黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞治疗帕金森病的新思路

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种黑质神经元发生损伤坏死的中枢神经退行性疾病。现在以药物治疗为主要手段,现有药物主要作用在关键信号靶点以缓解病情,但未能彻底修复变性神经元。近几年细胞治疗技术逐渐渗入到临床试验,已然成为社会焦点。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种成体多能干细胞,其自我增殖和多向分化能力已被公认。BMSCs 可以应用于PD 中以探索更加有效的治疗策略。黄芪甲苷是中药黄芪的特征成分,具有抗炎,抗氧化以及抗凋亡等活性作用。另外黄芪甲苷对神经干细胞具有保护作用,研究亦发现黄芪甲苷在PD 模型中发挥保护神经作用。该文就BMSCs 治疗PD 现状和黄芪甲苷对PD 治疗作用的研究进展作一综述,以此为基础提出了黄芪甲苷诱导骨髓间充质干细胞治疗帕金森病的新思路。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究

目的观察体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同时间段分化为心肌样细胞的能力及表达心肌细胞特异性标志物的差别。方法分离培养SD大鼠BMSCs和SD乳鼠心肌细胞并鉴定,取第3代BMSCs分别进行5-氮胞苷(5-Aza)诱导、与心肌细胞共培养及单独培养,分别于第2、4、6、8、10周使用倒置显微镜观察细胞生长情况和形态变化,反转录-聚合酶链反应检测每组细胞心肌特异性基因肌钙蛋白I(cTnI)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和心肌特异性转录因子4(GATA-4)的表达。结果对照组未见有搏动细胞,cTnI、Cx43和GATA-4基因表达阴性;5-氮胞苷诱导组于第2周时细胞呈梭形且排列方向趋于一致,未见有搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达第8周达到高峰,GATA-4基因表达第4周达高峰;共培养组细胞多为梭形,呈肌性排列,可见搏动频率不一致的搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达于第2⁸周表达逐渐增加,GATA-4基因表达第6周达高峰;相同时段内,共培养组的cTnI、Cx43和GATA-4基因表达高于5-氮胞苷诱导组(P<0.05)。结论 BMSCs经5-氮胞苷诱导或与心肌细胞共培养可转化为心肌样细胞并表达基因cTnI、Cx43和GATA-4,且共培养组BMSCs分化为心肌样细胞的能力比5-氮胞苷诱导组强,推测心肌微环境可促进BMSCs定向分化为心肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的鉴定指标

越来越多的研究发现,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在一定的诱导条件下可以定向分化为心肌样细胞。该文对BMSCs定向分化为心肌样细胞的鉴定指标结蛋白、α肌动蛋白、肌钙蛋白、间隙连接蛋白43、肌细胞增强子2C、心脏转录因子GATA结合蛋白4、Csx/Nkx2.5、超极化激活的核酸环化酶门控的离子通道2/4、肌球蛋白重链等予以综述。     

三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响

【目的】观察三七总皂苷(PNS)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和体外诱导其分化为心肌样细胞的作用。【方法】采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,以流式细胞仪检测细胞表面标志;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察PNS对MSCs增殖的影响;采用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化;采用相差显微镜、免疫组化及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果鉴定心肌细胞。【结果】大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性,CD34阴性;经PNS作用后MSCs增长速度比空白对照组明显加快,体外诱导后细胞形态发生变化,其细胞免疫组化鉴定呈结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnI)阳性;RT-PCR结果显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。【结论】PNS能促进大鼠MSCs体外增殖并可诱导MSCs分化为心肌样细胞,这为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

[目的]观察5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖和成肌分化的影响.[方法]无菌条件下取SD大鼠骨髓组织,采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后,随机分为4组:浓度为5、10、15μmol/L的5-Aza组和空白对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度5-Aza对MSCs生长增殖的影响;以含5、10、20μmol/L5-Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后,改用完全培养基继续培养,采用免疫组织染色法鉴定5-Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白(myosin)和结蛋白(desmin)的表达情况.[结果]双标免疫组化染色结果显示:所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%,鉴定结果表明所培养细胞为MSCs;5、10μmol/L5-Aza对MSCs增殖无显著影响(P>0.05),15μmol/L5-Aza可显著抑制MSCs生长(P<0.05);不同浓度5-Aza诱导培养MSCs后第3天,部分细胞出现desmin阳性表达,诱导后14 d,部分细胞表达myosin,以10μmol/L5-Aza组作用为佳.[结论]高浓度5-Aza可抑制MSCs体外增殖;适宜浓度的5-Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化.     

成人脂肪来源干细胞定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

[目的] 诱导脂肪组织来源干细胞(ADSCs)定向分化为软骨细胞并进行鉴定,为软骨组织工程获取大量种子细胞做准备.[方法] 对患者抽脂术的脂质部分进行分离培养及传代,采用四氮唑复合物(MTT)法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线,通过流式细胞仪将培养的细胞行干细胞鉴定,将第4代的ADSCs向软骨细胞定向诱导分化并行阿新蓝染色鉴定;免疫组化检测成软骨方向诱导后的ADSCsⅡ型胶原的表达.[结果] ADSCs体外增殖速度快,并且保持稳定的倍增率直至13～15代;流式细胞仪分析提示该细胞具有干细胞特性;通过定向分化技术,ADSCs可向软骨细胞分化,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原表达均呈阳性,说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能.[结论] 成功诱导ADSCs向软骨细胞定向分化,为软骨组织工程提供了可靠的种子细胞.     

龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响

【目的】观察龟甲(也称龟版或龟板)提取物对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖过程中核受体 (nuclear receptor,NR)表达的影响。【方法】采用密度梯度法分离大鼠MSC进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和 CD44免疫组化染色鉴定后,分别以高、中、低剂量的龟甲提取物(3 333、333．3、33．33μg／mL)加入到体外培养的MSC中, 与龟甲提取物作用12、24、72、120 h后,采用免疫组化法和免疫荧光细胞化学法检测MSC的视黄酸受体(retinoic acid receptor-α,RARα)、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)、雌激素受体(estrogen reeepror,ER)、糖皮质激素受体 (glucocorticoid receptor,GR)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor-α,TRα)和过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator activated receptor-δ,PPARδ)的表达。【结果】高、中、低剂量龟甲提取物组的MSC的RARα、VDR表达阳性细胞均高于对照组(P<0．05或P<0．01),且呈剂量依赖性;作用24 h后RARα表达达峰值,作用72 h后VDR表达达峰值。未检测到ER、GR、PPARδ、TRα阳性反应细胞。【结论】视黄酸受体α和维生素D受体可能为龟甲提取物促MSC增殖的药理靶点。     

杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

【目的】探讨杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。【方法】分别取10日龄SD大鼠胫骨、股骨的骨髓,过滤离心后将所得BMSCs进行体外单层培养、扩增,采用DMEM培养基,37℃、体积分数5%CO2条件培养。在细胞达到80%～90%融合时,使用2.5 g/L胰酶消化传代。将传代细胞分别置于空白血清培养液(对照组)、杜仲水提取物含药血清及杜仲醇提取物含药血清培养液进行培养,观察细胞在3种条件下的形态、贴壁生长、增殖、集落等情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法绘制生长曲线,比较3种培养条件下达到100%融合的时间。【结果】杜仲水提取物组、杜仲醇提取物组对大鼠BMSCs增殖的影响显著高于空白血清对照组(P<0.05),且杜仲醇提取物组作用优于杜仲水提取物组(P<0.05)。【结论】杜仲对大鼠BMSCs增殖具有一定促进作用。     

龟板含药血清对大鼠骨髓间质干细胞体外增殖的影响

[目的]观察益肾中药龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖的影响。[方法]使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,分别从光学显微镜下的形态学特征、免疫细胞化学染色后的MSC表型特征、四甲基偶氯唑盐(MTT)染色后MSC的吸光值以及以Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色后MSC的阳性细胞数变化等角度观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC的生长变化。[结果]不同浓度的龟板血清均以浓度依赖方式促进MSC增殖活力和增加Brdu、PCNA阳性细胞数,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。[结论]龟板血清可促进MSC的增殖而有利于细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成,推测这可能是龟板补肾的机理之一。     

山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖抑制及诱导凋亡作用

[目的]观察山奈酚对大鼠肝癌细胞CBRH7919增殖抑制、诱导凋亡和细胞周期的影响.[方法]选用CBRH7919肝癌细胞株,传代培养24 h后,加入不同浓度山奈酚处理,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,彗星电泳技术和流式细胞术检测药物对细胞DNA的作用.[结果]山奈酚体外能抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖,以6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L浓度的山奈酚处理细胞72 h,对CBRH7919细胞的增殖抑制率显著升高,呈明显的剂量效应关系.用50、100μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞24、48、72、96 h,对细胞的增殖抑制作用显著增强,呈明显的时间效应关系,即药物作用时间越长,抑制作用越强.DAPI染色显示不同浓度山奈酚组的细胞均有明显的细胞凋亡特征.彗星电泳显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h后,细胞后面均呈现长度不等的拖尾,平均光密度值较空白对照组显著降低(P<0.01),彗星尾距较空白对照组显著增加(P<0.01),且两者改变与药物浓度相关.流式细胞仪检测结果显示30、60、120μmol/L浓度的山奈酚作用于细胞72 h出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期被阻滞于S期,不同浓度山奈酚组凋亡率较空白对照组均明显增高.[结论]山奈酚可能通过抑制大鼠肝癌细胞CBRH7919的增殖及诱导其凋亡而产生抗肿瘤作用.     

丹酚酸B抑制人鼻咽癌细胞生长的体外试验研究

[目的]研究丹酚酸B(Sal B)对体外培养的人低分化鼻咽癌细胞株c666-1生长的抑制作用及可能的机制.[方法]采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Sal B对C666-1细胞的半数抑制剂量(IC50),以IC50浓度的Sal B处理G666-1细胞48 h后,采用Hoechst 33258进行凋亡染色,荧光显微镜下计...     

成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的初步研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成为胰岛β细胞的可能性。方法采用Percoll分离液和差异贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞，在纤维连接蛋白包被。含有表皮生长因子和血小板源性生长因子BB的低浓度血清（2％FBS）培养液中培养，传代后用碱性成纤维细胞生长因子、B27添加剂、尼克酰胺诱导。放免法检测培养液中胰岛素．双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定。并进行体外细胞功能测定。结果细胞诱导第二周逐渐聚集成胰岛样细胞团．开始分泌胰岛素，双硫腙染色成猩红色，免疫荧光显示细胞表达胰岛素，体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性。结论成人骨髓间充质干细胞可以在体外一定条件下实现向β细胞转分化。