线粒体基因表达改变在大鼠脑卒中发生中的作用

目的　探讨线粒体基因表达改变在大鼠脑卒中发生中的作用。方法　应用冷刺激加高盐饮食复合环境因素作用于 Wistar大鼠 ,诱发大鼠高血压脑卒中 ,应用抑制性差减杂交技术对卒中样发作鼠和正常对照鼠脑的差异基因进行筛选。经过两轮杂交后 ,产生的克隆均为脑卒中鼠脑组织特异表达的序列。每组随机挑取 2 88个克隆 ,进行测序及 Gen Bank Blast生物信息分析。结果　两组共有 4 5 6个可用序列 ,我们对每个与已知基因高度同源的序列以功能为参照进行了分类 ,发现大鼠脑卒中后脑组织线粒体基因转录出现的频数高达 2 6 .5 % ,6 0个克隆与线粒体基因高度同源 (P<0 .0 1) ,线粒体基因表达明显上调。结论线粒体基因表达发生改变 ,可能造成脑卒中的敏感性增加。     

心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下表达下调基因的分离和鉴定

目的：对成年大鼠心肌成纤维细胞（CF）受血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激后下调基因表达谱进行筛选及分析。 方法： 以受AngⅡ刺激CF为驱动方，未刺激CF为实验方，进行抑制消减杂交（SSH）建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将部分阳性克隆测序及进行同源性分析。 结果： 共获得17条下调表达基因，分别与胞内信号转导、转录抑制、纤维沉积和细胞骨架重构相关，并克隆到4条新基因表达序列标签（EST）。 结论： SSH有效地克隆了成年大鼠CF受AngⅡ刺激后下调表达基因，对这些基因的研究将有助于阐明心肌改建的分子机制。     

胃癌高表达cDNA片段W41的克隆及组织表达谱分析

目的：从人胃癌组织中克隆新的相关易感基因。方法：利用cDNA末端快速扩增PCR技术得到了扩增片段，将其克隆、核苷酸序列分析，并将序列在GenBank进行同源性比较。利用Northern杂交、多组织Northern及基因表达系列分析了所得基因片段的组织表达谱。结果：获得1条533bp带有poly(A)尾的cDNA片段，可见加尾信号AATAAA，与GenBank基因数据库同源比较，该序列未见与任何已知基因同源，登录GenBank(登录号为AF325202）。该序列在胃癌组织的表达强度高于对应正常组织，多组织Northern及基因表达系列分析表明该序列在多种肿瘤组织中高表达，在正常组织中表达减弱。结论：得到了1条与胃癌可能相关的新的cDNA序列。     

鼠伤寒沙门菌肠毒素基因功能 与毒力作用的研究

目的 研究确定肠毒素基因（enterotoxin gene,stn)在鼠伤寒沙门菌致病机理中的功能和毒力作用。方法 以鼠伤寒沙门菌株2000为研究对象,在克隆的stn基因Sfi I位点拼接入Km抗性标记基因以形成stn基因的插入失活,以此构建带有突变stn基因的重组自杀载体质粒,使重组自杀载体质粒与菌株2000染色体的同源基因发生交换,以突变stn基因置换其野生型拷贝,造成菌株2000stn基因位点的专一突变,筛选获得同源突变菌株。利用stn基因、Km抗性基因和自杀载体作探针进行菌株染色体Southern blot杂交,检测菌株对小鼠肠腔结扎攻毒实验和小鼠口服菌株半致死量的指标。结果 菌株2000染色体上野生型stn基因已被突变stn基因取代,同源突变菌株造成小鼠肠腔分泌能力比野生菌株明显减弱（P＜0．01）,小鼠口服突变菌株的致死剂量较野生菌株明显增高（P＜0．01）。结论 stn基因产物能够诱发小鼠肠腔液体分泌反应,stn基因是鼠伤寒沙门菌感染机制中一个较为重要的毒力因子。     

清络通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡相关基因p53和bcl-2表达的影响

目的：观察清络通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠滑膜凋亡相关基因的影响。方法：采用牛Ⅱ型胶原制备大鼠胶原性关节炎模型，提取滑膜细胞总RNA，采用RT—PCR技术，检测药物对滑膜细胞p53 mRNA、bcl-2 mRNA的影响。结果：胶原性关节炎大鼠滑膜细胞ps3mRNA、bcl-2mRNA表达较正常组明显升高（P〈0．01），清络通痹颗粒7．2g／kg可明显下调胶原性关节炎大鼠滑膜细胞p53 mRNA、bcl-2mRNA的水平（P〈0．05，P〈0．01）。结论：清络通痹颗粒可能通过下调滑膜细胞凋亡相关基因p53 mRNA、bcl-2 mRNA表达，促进滑膜细胞的凋亡而发挥治疗作用。     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

18月龄雌性大鼠下丘脑内源性阿片肽含量及其mRNA水平变化的研究

本文应用分子生物学和放射免疫测定方法，观察了老年前期雌性大鼠下丘脑、垂体和血浆中内阿片肽含量及下丘脑内阿片肽基因表达的变化．与5月龄青年大鼠比较，18月龄雌性大鼠下丘脑和血浆β-EP、L－ENK、Dy－nA含量减少，垂体β-EP、L－ENK含量升高，DynA含量降低（P＜0．05～0．01）．下丘脑POMC基因和proenkepbalin基因mRNA水平明显低于青年大鼠（P＜0．05）．结果提示，老年前期雌性大鼠下丘脑内阿片肽合成能力减退，衰老对下丘脑和垂体内阿片肽调节机制的影响有所不同．     

c—erbB—2和p53基因表达与胃癌浸润转移的关系

目的：探讨胃癌组织中c-erbB-2和p53基因的表达与胃癌发生和浸润转移的关系。方法：应用荧光原位杂交技术对55例胃癌的常规石蜡标本进行检测,结果：c-erbB-2和p53基因表达的阳性率分别为36．6％和45．45％,其中在肠型和弥漫型胃癌中,c-erbB-2和p53阳性率分别为51．615和16．67％,p53阳性率分别为25．81％和70．83％,两种基因在两型间的差异有显著性意义（P＜0．05）,c-erbB-2和p53基因表达与胃的组织分级有关（分别为P＜0．05及P＜0．01）c-erbB-2和p53基因表达与胃癌的浸润深度有相关性（分别为P＜0．01及＜0．05）,c-erbB-2;基因表达与胃癌的淋巴结内转移有显著性意义（P＜0．05）,结论：c-rebB-2和p53基因有助于确定胃癌的生物学行为。     

大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织谷氨酸转运体功能变化及地塞米松的影响

目的：探讨大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织谷氨酸转运体功能及超氧化物歧化酶（SOD）活性、脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量变化及地塞米松对其的影响。方法：采用大鼠三血管夹闭、松夹制作大鼠完全性脑缺血-再灌注损伤的模型。测定假手术对照组、脑缺血-再灌注损伤（l-R）组和I－R 地塞米松组的皮层、海马、纹状体的谷氨酸转运体功能及SOD活性、MDA含量的变化。结果：脑缺血-再灌注损伤时3个部位的谷氨酸转运体的功能均明显降低（P＜0.05．P＜0．01）、SOD活性显著降低（P＜0．05,P＜0．01）,MDA含量明显升高（P＜0．05,P＜0.01）,1－R 地塞米松组的3部位谷氨酸转运体功能与I-R组相比有明显恢复（P＜0.05,P＜0．01）,与对照组已无明显差异（P＞0.05）SOD活性回升（P＜0.05,P＜0．01）、MDA含量回降（P均＜0.05）。结论：大鼠脑缺血-再灌注损伤时脑组织三部位的谷氨酸转运体功能降低,且可能与自由基效应有关;而地塞米松则可能通过抗自由基效应使谷氨酸转运体功能恢复而发挥其抗损伤作用。     

去势对大鼠大脑皮质胆碱能纤维再生的影响

用Wistar2月龄雄性大鼠28只，其中去势大鼠12只，建立皮质损伤模型，用AchE阳性纤维染色法，研究皮质损伤切口两侧纤维密度的变化。结果：对照组在1和2周切口两侧AchE阳性纤维丢失较严重（与正常组比较P＜0．01orP＜0．05），4周时纤维再生较明显；去势组1周组，切口两侧纤维丢失较对照组少（P＜0．05），2周组切口两侧纤维再生较显著（P＜0．01orP＜0.05）、4周时切口头侧再生的纤维密度超过了正常组和对照组（P＜0．05）。表明去势鼠大脑皮质损伤的胆碱能纤维的再生能力增加。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白4A（HCV NS4A）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS4A蛋白反式激活相关基因。方法以HCV NS4A表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染Hep G2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行SSH分析。将富集的二次PCR产物与TIA载体连接，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑取克隆，聚合酶链反应（PCR）扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到36个阳性克隆，经菌落PCR分析显示200～1000bp插入片段。对其中的25个片段测序，并进行同源性分析，显示18种已知基因编码蛋白和2种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS4A反式激活靶基因。结论成功构建了HCV NS4A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS4A反式调节的靶基因等提供了相关的平台。     

IgA肾病肾阴虚证cDNA文库的构建

目的应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术构建汉族人IgA肾病肾阴虚证cDNA消减文库。方法选择IgA肾病且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol BD法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaⅠ酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建IgA肾病肾阴虚证消减文库。结果用SSH方法筛选出了IgA肾病肾阴虚证的差异cDNA片段,其中正向消减文库共获得325个阳性克隆．反向消减文库获得306个阳性克隆,从而成功地构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA消减文库。结论SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段,成功构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

Identification of the up-regulated expression genes in hemocytes of variously colored abalone (Haliotis diversicolor Reeve, 1846) challenged with bacteria

Variously colored abalone (Haliotis diversicolor Reeve, 1846), which is an important commercial aquatic species and has been widely cultured, frequently suffers from bacterial infection. Knowledge of the defense mechanism in this animal is still lacking and, so far few genes related to immune responses in abalones have been reported. In order to isolate differentially expressed genes in H. diversicolor challenged with bacteria, a forward suppression subtractive hybridization (SSH) cDNA library was constructed from their hemocytes and the up-regulated genes were identified. A total of 435 clones in the SSH library were sequenced and 111 genes were recognized based on BLAST searches in NCBI and were categorized in association with different biological processes using AmiGO against the Gene Ontology database. Of the 111 cDNAs, 86 genes were identified for the first time in H. diversicolor. The up-regulated cDNAs screened in the SSH library were validated using quantitative real-time PCR and 78 genes showed differential expression patterns. A total of 34 genes were confirmed to be distinctly up-regulated in abalones after bacterial challenge, encoding proteins involved in cellular metabolic processes; cellular component organization and biogenesis; signal transduction and biological regulation; immune defense and response to stimuli; other functions and unknown functions. This is the first report to unveil multiple up-regulated genes with differential expression patterns involving various cellular processes in bacterially challenged H. diversicolor. The data obtained from this study will provide new insights into the immune mechanism of H. diversicolor and facilitate future study of target genes involved in the response to invading microorganisms.     

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。     

致肾盂肾炎大肠杆菌132特异性基因的筛选

目的通过抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,比较致肾盂肾炎大肠杆菌132(UPEC132)与非致病性E.coli K-12 MG1655之间基因组的差异,筛选UPEC132特有的基因片段。方法应用SSH技术构建UPEC132(tester)与非致病性E.coli K-12 MG1655(driver)菌株差异DNA消减文库,经PCR和斑点印迹法筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及生物信息学分析。结果获得约1600个重组菌的UPEC132消减文库,随机挑取其中的300个克隆,有37个含有UPEC132特异的DNA序列。特异性片段测序后进行生物信息学分析,发现与其相关的37个基因为UPEC132所特有,其中1个为新发现的DNA片段,9个为与致病相关基因,7个为与代谢和物质转运相关基因,2个为与外膜蛋白相关基因,3个为与调节相关基因,10个为未知功能蛋白的基因,其他5个为功能未分类的基因。结论SSH技术是筛选病原菌特异基因的有效方法,已确定了37个UPEC132的特异基因,为进一步阐明其致病分子机制打下了基础。     

构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库

目的:构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库。方法:将不稳定型心绞痛病人(n=15)和稳定型心绞痛病人(n=15)的淋巴细胞的RNA进行抑制性消减杂交(SSH), 将获得的顺向和逆向消减产物分别与T/A载体连接, 采用1×TSS一步法转化大肠杆菌JM109, 获得消减cDNA文库, 采用蓝白斑筛选和菌落PCR筛选有插入片段的克隆。结果:各组cDNA文库各获得2000个阳性克隆, cDNA片段大部分分布于(200-600)bp之间。结论:本研究构建了不稳定型心绞痛淋巴细胞消减cDNA文库, 此cDNA文库有助于进一步筛选不稳定型心绞痛淋巴细胞中的差异表达基因。