钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究

目的 了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rVapB和rVapC 表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC.检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP-1细胞DNA或RNA活性.分别采用实时荧光定量PCR和Western blot试验,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化.构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响.结果 所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能分别表达rVapB 和rVapC.rVapC可水解RNA,但不水解DNA.问号钩体赖株感染THP-1细胞后,vapB和vapC基因 转录及表达水平均显著上调,部分毒性蛋白VapC外分泌.转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡.结论 问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性.     

问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究

目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.     

问号钩端螺旋体MazF蛋白对巨噬细胞的毒性作用分析

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体） MazEF毒素-抗毒素系统中MazF蛋白对巨噬细胞的细胞毒性及其机制。方法采用原核表达系统表达问号钩体赖型赖株MazEF毒素-抗毒素系统中的MazE和MazF蛋白（ rMazE和rMazF ）。采用DNA和RNA降解试验确定rMazF的DNA或RNA酶活性以及rMazE抑制rMazF酶活性的作用。采用实时荧光定量RT-PCT、Western blot 和激光共聚焦显微镜法,分别检测问号钩体赖株感染THP-1单核细胞时mazE和mazF基因转录、表达及分泌情况。采用CCK-8法和流式细胞术检测mazF基因产物对THP-1细胞的细胞毒性及死亡方式。结果 rMazF能水解问号钩体赖株和 THP-1细胞的RNA,但无DNA酶活性, rMazE 能抑制rMazF的RNA酶活性。感染THP-1细胞后,mazE-mRNA和mazF-mRNA及MazE和MazF蛋白表达水平显著升高,但仅有MazF蛋白外分泌。 mazF 基因产物对 THP-1细胞有细胞毒性并引起细胞坏死。结论MazEF毒素-抗毒素系统中具有RNA酶活性的MazF蛋白是问号钩体的毒力因子,可引起感染的巨噬细胞坏死。     

细胞周期及其调控基因对问号钩端螺旋体诱导单核-巨噬细胞凋亡的影响

目的 了解不同细胞周期及其调控基因对问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导人或鼠单核-巨噬细胞凋亡的影响.方法 采用细胞周期染色试剂盒及流式细胞仪检测问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染前后小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和人单核细胞株THP-1的细胞周期及其变化.采用细胞周期阻滞剂及流式细胞仪建立细胞周期同步化的J774A.1和THP-1细胞并进行鉴定.采用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测问号钩体赖株感染后细胞周期同步化与非同步化J774A.1和THP-1细胞早期凋亡、晚期凋亡/坏死率.采用实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染前后J774A.1和THP-1细胞的细胞周期及凋亡基因p21、p27、p53、c-myc和cycA mRNAs水平变化.结果 未感染钩体的正常J774A.1和THP-1细胞均分别处于G1、S和G2/M期,感染后均以G1期细胞为主,但S期THP-1细胞有所增加,J774A.1细胞则否(P＜0.05).J774A.1和THP-1细胞可分别被不同细胞周期阻滞剂阻滞在G1、S、G2/M或M期.G1期J774A.1和THP-1细胞感染后均无明显的早期凋亡现象,M期细胞早期凋亡、晚期凋亡/坏死率均明显升高(P＜0.05),G1期THP-1细胞晚期凋亡/坏死率明显升高(P＜0.05),J774A.1细胞则否.J774A.1和THP-1细胞感染后,p21 mR-NA水平均明显高于未感染细胞(P＜0.05),J774A.1细胞c-myc和p27 mRNAs水平、THP-1细胞cycAmRNA水平也高于未感染细胞(P＜0.05).结论 不同细胞周期及其调控基因对问号钩体诱导人或鼠单核-巨噬细胞凋亡有明显影响,但存在细胞种类差异性.     

问号钩端螺旋体侵入单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性研究

目的 探讨问号钩端螺旋体(简称钩体)侵入人或鼠单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性.方法 采用透射电镜观察问号钩体黄疸出血群赖型赖株侵入小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1和佛波酯(PMA)激活的人单核细胞THP-1后吞噬泡形成情况.采用免疫荧光联合激光共聚焦显微镜及荧光分光光度仪等方法,观察细胞内吞抑制剂单丹磺酰尸胺(MDC)、氧化酚砷(PAO)阻断及内吞相关网格蛋白抗体封闭前后,J774A.1细胞和PMA激活的THP-1细胞内问号钩体赖株数量的变化.结果 J774A.1细胞内问号钩体存在于吞噬泡内,THP-1细胞内问号钩体无吞噬泡膜包绕.MDC和PAO能以剂量依赖方式抑制J774A.1和THP-1细胞内吞问号钩体,其中10 μmol/L以上MDC和1 μmol/L以上PAO阻断的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量明显少于未阻断细胞(P＜0.05).网格蛋白抗体封闭后,J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量也明显减少(P＜0.05).结论 问号钩体以网格蛋白依赖性内吞途径侵入人或鼠单核-巨噬细胞.人或鼠单核-巨噬细胞内问号钩体吞噬泡形成有明显差异,这可能是人或鼠感染问号钩体后发病情况不同的原因之一.     

问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化

目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1～sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1～spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1～sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1～rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1～rSpM.采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1～sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1～rSph4.rSph1～rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性最强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1～sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1～sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.     

问号钩端螺旋体在体外诱导细胞凋亡及相关信号通路的研究

目的 了解问号钩端螺旋体诱导不同宿主细胞凋亡的作用及相关胞内信号传导通路.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖型赖株小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1、人脐静脉内皮细胞EVC304和人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549感染模型.采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况.分别采用荧光比色法和Western blot检测感染的J774A.1细胞caspase-3,-8,-9活性和凋亡相关蛋白FADD(Fas-associated death domain)表达水平.结果 问号钩体赖株感染1～6 h后,36.70%～63.70%的J774A.1细胞可H{现明显的早期凋亡,感染12 h时转变为晚期凋亡或坏死为主(53.68%).78.52%问号钩体赖株感染的A549细胞仪出现晚期凋亡或坏死.问号钩体赖株感染的EVC304细胞无细胞凋亡或坏死现象.感染的J774A.1细胞caspase-3和-8最大活性分别为(1453.41±36.07)和(1402.15±59.09)Fu,是未感染细胞的16.38和29.99倍.感染的J774A.1细胞caspase-9虽略有升高为(89.42±5.08)Fu,但明显低于caspase-3和-8(P<0.001).随着感染时间的延长,感染的J774A.1细胞FADD蛋白表达量逐步增加.结论 问号钩体诱导宿主细胞凋亡的效应町因细胞种类不同而有明显差异,FADD→caspase-8→caspase-3是介导问号钩体感染J774A.1细胞凋亡的主要信号通路.     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析

目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列，构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性，了解lipL21基因自然表达状况。方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Paloc型PalocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段，T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性，显微镜凝集试验（MAT）检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体，该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21，双曲钩体则否。结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜，双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性，有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。     

钩端螺旋体vwA1和vwA2基因原核表达产物功能的初步研究

目的 构建致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株vwA1和vwA2基因原核表达系统,初步了解目的重组表达产物rVwA1和rVwA2与血小板性出血相关性.方法 采用高保真PCR扩增问号钩体赖株vwA1和vwA2基因并测序,常规方法构建vwA1和vwA2基因原核表达系统.采用SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图像分析系统检查rVwA1和rVwA2表达情况及其可溶性,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVwA1和rVwA2.采用实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞株HUVEC前后vwAl-mRNA和vwA2-mRNA水平变化.采用流式细胞术检测rVwA1与人血小板膜糖蛋白结合能力.采用酶切试验及SDS-PAGE观察人血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13水解rVwA2的情况.结果 所克隆的钩体vwA1和vwA2基因与报道的相应基因比较,其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的vwA1和vwA2基因原核表达系统能分别表达可溶性rVwA1和rVwA2.问号钩体赖株感染HUVEC 8 h后,钩体vwAl-mRNA和vwA2-mRNA水平均显著上调(P＜0.05).流式细胞术检测结果显示,钩体rVwA1与人血小板结合率为60.8％.人ADAMTS13可水解重组人vWF-A2( rhvWF-A2),但不能水解钩体rVwA2.结论 vwA1和vwA2基因可能在钩体感染中发挥作用,其中vwA1基因产物功能与钩体病出血密切相关.     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

局部注射辛伐他汀对骨质疏松大鼠股骨髁骨小梁的改建效应

背景：局部注射具有成骨作用的辛伐他汀,可显著增加骨质疏松大鼠股骨颈及股骨髁部的骨密度及力学强度,分析局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。 目的：进一步研究骨质疏松大鼠股骨内局部注射辛伐他汀对股骨髁骨小梁的影响。为将辛伐他汀应用于临床骨质疏松局部治疗提供实验基础。 方法：18只雌性SD大鼠双侧卵巢切除后3个月,制备大鼠骨质疏松模型。实验大鼠随机数字表法均分为3组,分别在实验大鼠的右侧股骨髓腔内单次注射辛伐他汀溶液5 mg、10 mg,对照组单纯注射空白载体。分别在注射后1个月处死大鼠并取材。Micro-CT扫描并定量分析骨组织形态变化。 结果与结论：给药后1个月,Micro-CT扫描结果显示,辛伐他汀治疗组的骨微结构参数如骨皮质厚度、骨小梁密度及连接率明显优于对照组。说明疏松骨骼单次注射小剂量辛伐他汀可显著促进股骨髁部骨小梁改建,改善骨骼微结构,可为强化局部、防治骨质疏松骨折的新选择进一步提供实验基础。     

石斛属民族药用植物的分类及生药学研究

中药石斛早在《神农本草经》中就被列为上品,其应用历史悠久,具有养阴生津、补肾益气、润喉护嗓、活血明目、抗癌防老等功效。本文对国内外石斛属民族药用植物的分类及生药学研究进行了综述。     

膝关节骨性关节炎的关节镜治疗体会

目的我科自2001～2005年4月对59例67膝的骨性关节炎（0A），进行关节镜检查及镜下清理术。方法镜检：膝关节骨性关节炎伴不同程度滑膜炎，滑膜皱壁粘连纤维片，关节软骨不同程度破坏。镜下清除增生滑膜，松解粘连，去除剥脱软骨、修复关节面。结果随访2月～4年，平均1.5年，术后综合评估2月～1年，优良率94％；1～2年，优良率79.2％；2年以上优良率54.8％。结论关节镜对膝关节骨性关节炎诊断能提供了比较全面的资料，并对骨性关节炎早期有良好疗效，具有创伤小、恢复快、并发症少和重复治疗等优点。     

Anatomical study of distribution of valves of the cutaneous veins of adult''s limbs

Since the cutaneous veins of the four limbs have been used as autogenous grafts in the treatment of cardiovascular disorders, knowledge of distribution of the valves is increasingly required depending upon the use. In the gross anatomical study of distribution of valves of the trunci venae, there has been argument about locational relationships between the venous roots and the valves in the vicinity of the roots and the inter-valvular distance. However, there have been only few reports discussing detailed information about valves of the cutaneous veins of the four limbs. The authors observed patterns of distribution of the cutaneous venous valves of the four limbs of cadavers prepared for practice in anatomy. The following parts were excised from each cadaver: the cephalic, basilic, and the great saphenous veins, which originate from the acral venous network and flow into the proximal deep veins, and the venous roots communicating with these veins. An incision was made on each excised vein in the direction of the long axis under observation with a stereoscopic microscope, and the inter-valvular distance and the distance between the valve and the orifice of venous root in the vicinity of the valve were measured. The inter-valvular distance varied with type of the truncus venae, and it varied according to area even in the same truncus venae.     

Pathways of the realization of immunomodulating effects of neurotransmitters

Translated fromByulleten' Eksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 115, N ^o 4, pp. 401–404, April, 1993     

Characterization of sterols of three digenetic trematodes of buffalo

Sterols of three digenetic trematodes were isolated and characterized by infrared and 1H nuclear magnetic resonance spectroscopies, and gas-liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry. Sterols identified were cholesterol, cholestanol, 24-methylcholesterol, 24-methylcholestanol, 24-ethyl-22-dehydrocholesterol, 24-ethyl-22-dehydrocholestanol, 24-ethylcholesterol and 24-ethylcholestanol.     

Mechanisms of generation of slow components of bioelectric activity in diagnostics of functional state of the gastrointestinal tract

New electrophysiologic devices were used for the diagnostics of the state of excitable structures in the gastrointestinal tract and correction of their motor functions. Bioelectrical and biomechanical activities form the basis of functioning of internal organs. The mechanisms of generation of slow bioelectrical activity that are important for clinical and physiological studies are described. One of these mechanisms is a capacitance parametric transducer converting the energy of contractions into specific electric signals reflecting muscle functions. Another mechanism results from slow oscillations of resting potentials of interrelated excitable cells in large neuromuscular structures of internal organs. The elaborated procedure is efficient for preventing early postoperative paresis of the gastrointestinal tract. Translated fromByulleten' Eksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 128, No. 10, pp. 448–452, October, 1999     

胃小弯侧血管弓的MDCT解剖

目的：研究正常胃小弯侧血管弓及其属支血管的多排螺旋CT表现。方法：回顾性分析51例正常成人的上腹部CT资料,观察胃小弯侧血管弓及其属支血管的显示情况、血管弓形态及其与胃壁的关系。结果：51例均显示胃小弯侧血管弓,血管弓贲门部属支、胃体部属支和幽门部属支分别显示46例、15例和10例;血管弓与胃壁紧邻41例。结论：MDCT检查可良好显示正常胃小弯侧血管弓及其属支血管。     

Assessment of the efficacy of treatment of hemangiomas

Assessment of the aftereffects of cryoexposure and ultrahigh-frequency cryoexposure on hemangioma tissue of various types, cavernous and squamous, showed a higher cryogenic effect in hemangiomatous tissue preexposed to ultrahigh-frequency waves. A quantitative criterion is proposed for assessing the efficacy of the studied methods of exposure. Translated fromByulleten' Eksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 119, N ^o 6, pp. 669–672, June, 1995