甲型副伤寒杆菌nmpC基因原核表达及表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因nmpC的原核表达系统,确定其重组表达产物rNmpC免疫原性和保护作用,了解甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.方法 采用PCR和T-A克隆法从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中获得nmpC基因克隆并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rNmpC表达情况及其产量,采用免疫扩散法、Western blot和微量肥达试验鉴定其抗原性和免疫应答性.采用PCR和ELISA分别检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.采用小鼠感染模型了解rNmpC对甲型副伤寒杆菌致死性感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的nmpC基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rNmpC表达量约为细菌总蛋白的30%.rNmpC免疫家兔可产生抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号.所有甲型副伤寒杆菌菌株均携带nmpC基因并表达NmpC蛋白,但伤寒杆菌、乙型及丙型副伤寒杆菌未检出nmpC基因.100μg和200μgrNmpC对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和66.7%(8/12).rNmpC免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清仅对甲型副伤寒杆菌H抗原产生1∶5～1∶40的凝集效价.结论 NmpC是甲型副伤寒杆菌独有的序列保守、分布广泛且自然表达的外膜蛋白抗原,该外膜蛋白具有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为多价甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定

目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒沙门菌减毒株的构建与鉴定

目的构建甲型副伤寒沙门菌减毒株,测试其减毒效果,为制备减毒疫苗奠定基础。方法利用同源重组技术敲除甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株的ync D基因和aro C基因,构建出ync D单基因敲除株和ync D-aro C双基因敲除菌株;通过测定和比较野生株、ync D单基因敲除株及ync D-aro C双基因敲除株的生长曲线,评估基因敲除对细菌生长的影响;以猪胃黏蛋白增毒小鼠为模型,测定野生株和双基因敲除株对模型动物的半数致死量LD50,评价双基因敲除株的减毒效果。结果成功构建并筛选到ync D单基因及ync D-aro C双基因敲除的甲型副伤寒沙门菌突变菌株。生长曲线测定显示ync D基因和aro C基因敲除后,敲除株生长明显缓慢。野生株和双基因敲除株针对模型小鼠的LD50分别为7.90×101和3.33×106CFU,结果表明ync D-aro C双敲除菌株的毒力较野生株下降约42 202倍,具有显著的减毒效果。结论本研究所构建的甲型副伤寒沙门菌ync D-aro C双基因敲除突变株毒力明显降低,安全性好,为研制甲型副伤寒减毒活疫苗奠定了坚实基础。     

甲型副伤寒杆菌鞭毛蛋白H1a基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫原性和保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌（Salmonella paratyphi A）H1a基因原核表达系统，确定表达产物rH1a免疫原性和保护作用，检测甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达情况。方法 采用高保真PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增H1a基因，T-A克隆后测序，构建H1a基因原核表达系统pET32a-H1a-E．coli B121DE3。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检查rH1a表达情况，Ni-NTA亲和层析法收集rH1a。采用Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性。建立PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株H1a基因携带和表达频率。观察rH1a对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较，所克隆的H1a基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为99．59％。rH1a表达量为细菌总蛋白的60％左右。甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rH1a并与之结合。rH1a免疫家兔可产生抗体。100％（98／98）甲型副伤寒杆菌临床菌株均含有H1a基因并表达H1a。500μg rH1a灌喂或皮下注射免疫小鼠受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率均为50．0％，若加入5μg rLTB，存活率分别上升至75．0％和66．7％。结论 本研究成功地从甲型副伤寒杆菌临床菌株中构建了H1a基因高效原核表达系统。rH1a有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用。甲型副伤寒杆菌临床菌株广泛存在H1a基因并高频率表达。     

甲型副伤寒结合疫苗的制备及其免疫原性研究

目的 研制预防沙门菌属A组甲型副伤寒沙门菌感染的多糖蛋白结合疫苗。方法 通过对甲型副伤寒沙门菌尼泊尔株NTP-6的发酵培养，热酚水法提取脂多糖（LPS），酸水解脱毒，纯化出有效的型特异O-SP抗原；然后用CDAP对O-SP活化、ADH衍生后，在EDAC的缩合作用下，结合到破伤风类毒素TT上，制备出甲型副伤寒结合疫苗。用含2．5μg多糖甲型副伤寒结合疫苗免疫小鼠，以LPS为包被抗原，用间接ELISA法测定血清抗甲型副伤寒LPS IgG抗体；并测定血清多糖抗体的补体介导杀菌活性；在小鼠和豚鼠体内观察甲型副伤寒结合疫苗的安全性。结果甲型副伤寒结合疫苗第2次免疫NIH后，小鼠血清抗甲型副伤寒LPS IgG抗体平均几何滴度（GMT）均较第1次有4倍以上升高，第3次免疫后，有明显的加强效应；抗体的补体介导杀菌活性效价达1：1280以上；小鼠和豚鼠体内甲型副伤寒结合疫苗安全性良好。结论 成功建立了甲型副伤寒结合疫苗的制备工艺；制备的甲型副伤寒结合疫苗有良好的免疫原性，并具有明显的加强效应；刺激的血清多糖抗体有较高的补体介导杀菌活性效价；安全性达到人用生物制品相关要求。     

口服甲型副伤寒沙门菌致病岛2缺失株对小鼠的免疫保护效力评估

目的评估甲型副伤寒沙门菌致病岛2缺失株(SPA017ΔSPI2)对小鼠的免疫保护效力,研制有效的甲型副伤寒沙门菌减毒口服疫苗。方法以1×10⁸菌落形成单位(CFU)的SPA017ΔSPI2对6周龄的雌性Balb/c小鼠进行口服免疫,7 d后以相同剂量进行二次免疫,测定小鼠体质量变化、SPA017ΔSPI2体内定植水平、血清抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖水平,并对SPA017ΔSPI2亲本株SPA017攻毒后的保护效力进行评价。结果 SPA017ΔSPI2免疫后不影响小鼠的生长性能,该缺失株在小鼠体内具有一定的定植能力,且SPA017ΔSPI2能够诱导小鼠产生显著的体液免疫应答和细胞免疫应答反应,攻毒后免疫组小鼠的发病率和死亡率均显著低于对照组。结论甲型副伤寒沙门菌致病岛2缺失株经口服免疫后可对小鼠提供良好的免疫保护,可以作为甲型副伤寒理想的疫苗候选株。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白的分离、纯化和鉴定

目的提纯甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白并鉴定。方法选用甲型副伤寒沙门菌,经自制的液体培养基扩大培养后,酸裂解法初步分离出鞭毛蛋白,用AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐,弱阴离子交换层析纯化。纯化的蛋白用SDS-PAGE、Westernblot和磷钨酸负染扫描电子显微镜(scanningelectronmicrocopy,SEM)观察并摄片鉴定。考马斯亮蓝法测定所获得鞭毛蛋白的产量。结果SDS-PAGE提示纯化的鞭毛蛋白为一条相对分子质量(Mr)为52×103蛋白带;免疫印迹试验亦提示条带在Mr52×103处;SEM观察发现该鞭毛蛋白呈丝状;三者均证实该蛋白为同一均质蛋白。蛋白定量测得每克湿重的细菌可提取(4.8±0.5)mg鞭毛蛋白。结论经酸裂解法可获得高产量的鞭毛蛋白,且易于纯化和鉴定。     

杭州地区伤寒及甲型副伤寒沙门菌流行菌株分子特征的研究

目的 了解并确定2002-2008年杭州地区伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌优势菌株的分子特征.方法 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点串联重复序列分析(MLVA)或多位点序列分型(MLST)对2002-2008年杭州地区分离的31株伤寒沙门菌、404株甲型副伤寒沙门菌进行分型并分析.结果 404株甲型副伤寒沙门菌可分为6个PFGE型,P1型和P2型属于同一个克隆系,99.0％ (400/404)菌株属于该克隆系,其中P1型菌株占该克隆系菌株的93.3％ (373/400).31株伤寒沙门菌株存在高度多样性,可分为14个PFGE型、28个MLVA型(分辨率90.3％)、3个MIST型.根据MLVA各型靶位点多态性差异,本地区流行的伤寒沙门菌株与东南亚地区菌株相近,但与欧洲菌株差距较大,呈高度多态性的可变串联重复序列(VNTR)位点TR1、TR2、Sal02可作为本地区伤寒沙门菌株的检测标志.伤寒沙门菌株MLST型别包括了目前国际上发现的所有3个型别,但以ST2型为主(23/31,74.2％).结论 近年杭州地区甲型副伤寒疫情由同一亚系菌株感染所致,但本地区流行的伤寒沙门菌株呈现高度多样性.     

伤寒沙门菌外膜蛋白YncD的重组表达、纯化及其免疫保护作用观察

目的通过基因重组表达方法制备伤寒沙门菌外膜蛋白YncD,观察其免疫保护效果。方法通过PCR方法扩增伤寒沙门菌Ty2野生株的外膜蛋白YncD编码基因,构建原核表达载体pET28a-yncD,并测序鉴定。表达载体转入大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,并通过亲和层析和离子交换柱进行纯化。获得的重组蛋白免疫接种小鼠,以Ty2株进行攻击,观察重组蛋白的免疫保护效果。结果经DNA测序鉴定,p ET28a-yncD原核表达重组载体构建成功,其在原核表达系统中表达量高,产物蛋白相对分子质量约为79 000,与预期相符。表达产物经亲和层析和离子交换柱纯化后,得到高纯度重组YncD蛋白。小鼠经重组YncD免疫接种后,可抵抗致死剂量的毒株攻击。结论成功构建伤寒沙门菌外膜蛋白YncD基因重组原核表达系统,并获得高纯度重组YncD蛋白,动物实验初步显示重组蛋白具有良好的免疫保护作用,为进一步的免疫保护效能评价奠定基础。     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体的研制及初步应用

本文采用杂交瘤技术,制备了７ 株抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体（ｍ Ａｂ） 的杂交瘤细胞株。对３ 株ｍＡｂ（２Ｃ８、２Ｅ６ 和５Ｄ７） 进行了鉴定,ｍＡｂ ２Ｃ８ 和５Ｄ７ 为ＩｇＭ,２Ｅ６ 为ＩｇＧ１（κ）亚类,可分别识别不同的抗原表位,均具有很强的特异性,即只与甲型副伤寒沙门氏菌及其鞭毛抗原起反应,而与相关肠道细菌：尼亚里木沙门氏菌、达卡沙门氏菌及伤寒沙门氏菌、乙型和丙型副伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等均无交叉反应。免疫印迹显示,３ 株ｍＡｂ 只能与甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原Ｍｒ 为５２ ０００ 的蛋白结合。用ｍＡｂ ２Ｅ６ 和５Ｄ７ 建立的双ｍＡｂ 夹心ＥＬＩＳＡ 法,检测了１３ 例血培养阳性的副伤寒患者血清中的甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原,１２ 例呈阳性,阳性符合率为９２－３％ 。     

甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因功能的初步研究

目的 利用λRed重组系统敲除甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因构建突变株,并且制备相应的回复株,进而初步研究该基因的功能.方法 PCR扩增得到上、下游同源臂,与卡那霉素抗性基因片段共同构建打靶片段,将其浓缩后转化含λRed重组系统的甲型副伤寒沙门氏菌(50973株),经PCR鉴定后得到突变株;将重组酶表达质粒pACU184与ompW基因的调控区和编码区序列连接后电转入突变株中,双酶切鉴定得到相应的回复株;SDS-PAGE及Western blot鉴定野生株、突变株与回复株中OmpW蛋白的表达情况;生化鉴定野生株、突变株与回复株,并观察野生株与突变株生长曲线的差异;测定野生株、突变株与回复株活菌半数致死量( LD50),以此来观察ompW基因与细菌毒力的相关性.结果 在甲型副伤寒沙门氏菌50973株中成功敲除了ompW基因,并构建了相应回复株;野生株与回复株均可表达出OmpW蛋白,突变株没有出现该蛋白的表达;野生株、突变株与回复株生化鉴定结果均为甲型副伤寒沙门氏菌,且野生株和突变株生长无明显差异;三者LD50均不存在显著差异.结论 甲型副伤寒沙门氏菌的ompW基因与该菌致病毒力无相关性,但突变株的构建为后续研究该基因具体功能提供了基础.     

幽门螺杆菌GroEL蛋白重组表达及表达产物小鼠免疫保护作用

目的 检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异,确定重组表达的GroEL蛋白(r-GroEL)抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性.方法 采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列.构建幽门螺杆菌groEL基因pET42a-E.coli BL21DE3原核表达系统,采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统确定rGroEL表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用ELISA和Western blot检测rGroEL的抗原性和免疫反应性,采用幽门螺杆菌全菌为包被抗原的ELISA确定GroEL膜定位.采用幽门螺杆菌小鼠感染模型了解rGroEL免疫保护作用.结果 35株幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列相似性高达99.4％～ 100％.rGroEL表达量可达细菌总蛋白的56％,SDS-PAGE后提纯的rGroEL在凝胶中显示为单一的条带.rGroEL可诱导家兔和小鼠产生高效价IgG抗体,同时也能被幽门螺杆菌全菌抗体(Hp-IgG)或rGroEL-IgG识别并与之结合.GroEL是幽门螺杆菌表面蛋白抗原.50、100或200 μg rGroEL免疫可分别使50.0％ (6/12)、75.0％ (9/12)和91.7％ (11/12)小鼠免于幽门 螺杆菌SS1株的感染,200 μg rGroEL免疫保护率(91.7％)显著高于50μg rGroEL(50.0％)( P＜0.05).结论 幽门螺杆菌GroEL蛋白是序列保守、具有良好免疫原性和免疫保护性的表面抗原,可作为基因工程疫苗候选抗原.