结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用.方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化.结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P＜0.05).结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成.     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16．3蛋白的原核表达及功能检测北大核心CSCD

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

Mcl-1信号通路阻断剂对H37Rv感染小鼠巨噬细胞凋亡的影响

目的:探讨Mcl-1信号通路阻断剂在结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠模型中对Mcl-1表达、巨噬细胞凋亡情况及结核分枝杆菌的影响。方法:小鼠腹腔注射H37Rv菌悬液,建立感染小鼠模型,针对Mcl-1的信号通路选用JAK/STAT信号通路阻断剂AG490、MAPK信号通路阻断剂PD98059和PI3K信号通路阻断剂LY294002用腹腔注射方式作用于各组感染小鼠模型,分为H37Rv感染组、AG490处理组、PD98059处理组、LY294002处理组和对照组。通过细胞抗酸染色观察结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬细胞的动物模型是否建立成功;通过免疫细胞化学检测结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞的Mcl-1表达情况,使用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率,采用结核分枝杆菌菌落计数来判断巨噬细胞凋亡对结核分枝杆菌的清除效果。结果:细胞抗酸染色结果可见感染的巨噬细胞内散在排列的红色短小抗酸结核分枝杆菌。免疫细胞化学结果显示H37Rv感染组、AG490处理组和LY294002处理组中的Mcl-1蛋白为强阳性表达,PD98059处理组中Mcl-1蛋白为弱阳性表达,对照组Mcl-1蛋白为阴性表达。流式细胞术检测发现H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率较对照组高,PD98059处理组的凋亡率显著高于各组,差异显著(P0.05)。结核分枝杆菌菌落计数结果显示PD98059处理组对H37Rv菌株抑菌作用最明显。结论:Mcl-1信号通路阻断剂通过抑制JAK/STAT、MAPK和PI3K信号通路增加结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞的凋亡率,抑制结核分枝杆菌生长;其中,MAPK信号通路干扰Mcl-1的作用最明显,感染的巨噬细胞凋亡率最高,抑菌作用最强。     

不同毒力结核分枝杆菌感染对巨噬细胞铁蛋白及铁转运蛋白表达的影响

目的探讨结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株(简称H37Rv株)和卡介苗菌株(简称BCG菌株)分别感染巨噬细胞后,各感染组巨噬细胞内铁蛋白(Fn)和铁转运蛋白(FPN)表达量及其时相性变化。方法分别用结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、6、12、18、24 h,应用ELISA检测各组感染巨噬细胞培养上清液中Fn和FPN的含量;应用Western blot技术检测上述时间点各组感染巨噬细胞内Fn的表达量。结果不同菌株感染巨噬细胞后,巨噬细胞内Fn随处理时间延长表达逐渐增强;感染1 h,正常对照组Fn的表达高于H37Rv组和BCG组;感染6 h,感染组表达高于正常对照组,感染12 h,H37Rv组高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);感染18 h和24 h,H37Rv组>BCG组>正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。FPN的表达量随时间变化逐渐降低。与正常对照组相比,H37Rv组、BCG组FPN的表达均呈现较低水平,为H37Rv组相似文献   

微量铁元素在结核病发病机制中作用的研究进展

巨噬细胞的铁代谢与结核分枝杆菌的生长繁殖有密切的关系。结核分枝杆菌感染宿主后,主要在宿主巨噬细胞内生长繁殖,巨噬细胞为其生长提供所需要的铁元素,而未被机体免疫系统清除的结核分枝杆菌必须依靠巨噬细胞提供铁元素才能维持其活性和生存。巨噬细胞内转铁蛋白受体1(TfR1)不仅维持巨噬细胞内铁元素的动态平衡,影响胞内结核分枝杆菌生存,而且诱导巨噬细胞自身凋亡,最终杀伤结核分枝杆菌。近年来,有研究表明铁元素与结核分枝杆菌耐药相关。研究铁元素在结核病的发生、发展机制以及结核病耐药机制中的作用,对进一步明确结核病的发病机制,开创治疗结核病的新方法有重要意义。     

利用Hsp基因调控元件构建胞内表达的E.coli-BCG穿梭载体

目的 构建能够携带外源蛋白基因并能在胞内表达的E-coli-BCG(Baeille Calmette-Guerin)穿梭载体。方法 用多聚酶链式反应(PCR)从结核分枝杆菌毒株H37Rv基因中扩增出结核分枝杆菌热休克蛋白(Hsp)60N端6个氨基酸及其上游调控元件基因，克隆入E．coli-BCG穿梭载体pOLYG中，以屋尘螨抗原(Der p2)为外源蛋白，用间接免疫荧光染色法观察该载体介导的Der p2基因,在牡牛分枝杆菌(M.vaccae)宿主中的表达。结果 经测序证实所克隆的Hsp60ss基因序列正确，所构建的胞浆内表达E．coli．BCG穿梭载体(pIC)能完成在大肠杆菌和M．tvaccae细胞之间的穿梭，并介导抗生素抗性基因的表达，经免疫荧光检查外源基因Derp2可表达于M.vaccae宿主胞内，并受到培养温度的调节。结论 成功构建了在M．vaccae胞内表达外源蛋白的E．coli-BCG穿梭载体。     

不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠对肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化的影响

目的:探讨不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化。方法:不同毒力结核分枝杆菌悬液分别经小鼠尾静脉注射、复制及鉴定各组小鼠感染模型,各组小鼠感染模型复制成功后第1、3、5、7、9、11、13、15天,进行肺泡灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取感染小鼠肺泡巨噬细胞,以激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测上述各时间点、各组感染小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率,比较各组感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。结果:激光共聚焦显微镜检测结果显示,结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染小鼠模型组和卡介苗菌株(BCG)感染小鼠模型组,在小鼠感染模型复制成功后1～9天,小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率逐渐升高,9天时两组小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率均达最高,随着时间的延长,两组小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡率呈现逐渐降低趋势。结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染小鼠组,感染小鼠的肺泡巨噬细胞的凋亡率明显高于卡介苗菌株(BCG)感染小鼠组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:感染小鼠的肺泡巨噬细胞的凋亡率与结核分枝杆菌的毒力强弱呈正相关。     

结核分枝杆菌CYP143A1基因(Rv1785c)敲除菌株的构建

目的 为深入了解和探索结核分枝杆菌CYP143A1基因(Rv1785c)功能,构建针对该基因的敲除菌株.方法 采用噬菌体介导的基因敲除技术,设计并采用聚合酶链反应(PCR)扩增待敲除基因Rv1785c左、右臂,与p0004s质粒连接,构建同源重组质粒p0004s-△Rv1785c.再将p0004s-△Rv1785c质粒...     

结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用

目的对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法以PCR扩增Rv0901基因编码序列,定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒,将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌,构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌,其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染,重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO(一氧化氮)的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。     

结核分枝杆菌Rv3245 蛋白抗原免疫学特性的研究

目的:研究结核分枝杆菌Rv3425 蛋白免疫学特性,评估其诊断应用价值及在结核致病性中的作用。方法:将Rv3425 基因克隆至pET28a 载体中,诱导表达Rv3425 融合蛋白并进行纯化;利用ELISA、Western blot 分析其抗原性与特异性;流式检测该抗原对巨噬细胞凋亡的影响。结果:获得了可溶性原核表达融合蛋白Rv3425,Rv3425 蛋白能刺激灭活结核分枝杆菌免疫小鼠脾细胞产生高水平的特异性IFN鄄酌、纯化的Rv3425 蛋白能与结核感染小鼠血清特异性结合,其特异性血清抗体IgG 及IgM 在结核病人中的水平明显高于健康人,发现该蛋白能诱导巨噬细胞的凋亡。结论:本研究发现结核分枝杆菌Rv3425 蛋白具有较强的抗原性且能促进巨噬细胞的凋亡,这些发现对于结核病的诊断及致病机制的研究具有重要价值。     

不同基因型结核分枝杆菌脂聚糖对巨噬细胞的毒性作用研究

目的:研究不同基因型结核分枝杆菌脂聚糖在体外诱导巨噬细胞产生炎症反应的程度,探讨不同基因型结核分枝杆菌脂聚糖的毒力差异。方法:通过Triton X-114液相法提取北京基因型、T1基因型、MANU2基因型结核分枝杆菌和H37Rv脂聚糖成分,用粗提出的各脂聚糖抗原成分刺激RAW264.7巨噬细胞,检测24 h后细胞因子和...     

靶向沉默Mcl-1基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响

 目的: 通过RNA干扰技术特异性沉默 Mcl-1 基因,探讨下调 Mcl-1 基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响。方法: 分别用制备好的新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株(简称强毒株)、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv(简称H37Rv)、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra(简称H37Ra)和卡介苗(BCG)菌悬液感染BALB/c小鼠,再以筛选并构建好的Mcl-1-shRNA作用于感染的小鼠模型,同时设立相应对照组,于作用后1 d、3 d、5 d和7 d提取小鼠腹腔巨噬细胞,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测各组巨噬细胞的凋亡水平。结果: 小鼠被不同毒力的结核杆菌感染后其腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平均有不同程度的升高,其中以感染了强毒株和H37Rv的腹腔巨噬细胞升高最为明显(P<0.05);应用RNA干扰技术沉默 Mcl-1 基因后,Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组(P<0.05);流式细胞术分析显示,下调 Mcl-1 基因的表达可诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。结论: 应用Mcl-1-shRNA可有效沉默 Mcl-1 在感染了不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞中的表达,并能上调巨噬细胞的凋亡水平。     

自噬基因多态性与机体对结核病的敏感性

结核分枝杆菌是胞内病原体,主要感染巨噬细胞.最近的研究显示,自噬参与了胞内杀死结核分枝杆菌的过程.胞内结核分枝杆菌的存活与自噬的抑制有关,而自噬和自噬相关基因缺失鼠更容易受结核分枝杆菌感染.据报道,在一些地区,自噬基因IRGM的高多态性与保护人们抵抗结核分枝杆菌的感染有关.此外,R2RX7也与结核病相关.     

巨噬细胞凋亡抗结核分枝杆菌感染的研究进展

结核分枝杆菌(MTB)是结核病病原体,长期协同进化使得MTB制定出专门的免疫逃逸机制。巨噬细胞凋亡作为机体抗感染固有免疫应答之一,能有效清除胞内MTB。我们主要总结了MTB与巨噬细胞凋亡相互作用:巨噬细胞主要通过内在途径及宿主蛋白核小体蛋白110(SP110)、磷酸化的信号转导子和转录激活子(STAT)、非编码RNA(ncRNA)介导细胞凋亡从而控制MTB感染; MTB脯-谷氨酸/脯-脯-谷氨酸(PE/PPE)家族蛋白、毒力因子Rv3033等菌体成分通过多种分子机制调控宿主细胞凋亡,促进自身存活。关于巨噬细胞凋亡抗MTB感染机制的深入研究,将为基于巨噬细胞凋亡的结核病免疫治疗带来新的策略。     

人蛋白质组芯片筛选宿主中与结核分枝杆菌Rv1705c相互作用的蛋白质

目的:探究人体中与结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis, Mtb)Rv1705c蛋白相互作用的蛋白质。 方法:原核表达Rv1705c蛋白基因,收集包涵体,裂解后透析纯化Rv1705c并测定其浓度,ELISA法检测细菌Rv1705c刺激巨噬细胞后细胞因子I...     

结核分枝杆菌融合蛋白和分泌蛋白对人肝癌细胞HepG-2影响和作用

目的探讨结核分枝杆菌融合蛋白对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法构建含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,纯化后复性。分别作用于肝癌细胞HepG-2,MTT法检测细胞生长情况。结果成功纯化并复性三种蛋白。MTT实验结果显示,三种蛋白均对HepG-2细胞的生长具有抑制作用,抑制强度与蛋白终浓度和作用时间相关,但各蛋白的抑制作用无明显差异。结论结核分枝杆菌的部分分泌蛋白对肝癌细胞HepG-2具有抑制作用。     

寡核苷酸表达谱芯片揭示的抗结核分枝杆菌感染免疫特征

目的 研究临床分离的结核分枝杆菌菌株感染人巨噬细胞所引起的表达变化，寻找与其它细菌在诱导细胞表达方面的共性和特性。方法 用19200个基因的寡核苷酸芯片比较临床分离细菌感染U937前后细胞基因的表达变化，以生物信息学统计分析其它细菌引起宿主细胞的基因表达变化。结果 结核分枝杆菌感染导致1395个基因(7．26％)差异表达，特别显著的是细胞因子、锌指蛋白、转录因子和凋亡有关因子。与沙门菌、铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌、单孢李斯特菌、百日咳菌等细菌感染引起的免疫反应具有相似之处。结论 结核分枝杆菌感染与其它细菌感染引起的免疫反应在转录水平具有共性，也富有特性。锌指蛋白和fibronectin受体等因子在抗结核分枝杆菌感染免疫中的作用值得深入研究。     

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。     

NOD2基因在巨噬细胞抗结核分枝杆菌中的作用

为探究核苷酸结合寡聚化结构域2(nucleotide binding oligomerization domain 2,NOD2)基因在巨噬细胞抗结核分枝杆菌免疫反应中的作用,应用siRNA干扰人巨噬细胞U937中NOD2的表达后用结核分枝杆菌感染U937细胞,采用菌落计数法检测U937细胞对结核分枝杆菌的吞噬及杀伤能...