APOBEC3G体外抗乙型肝炎病毒的研究

目的探讨载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide like3G,APOBEC3G）（也称为CEM15）体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用及其机制。方法脂质体转染pcDNA3.1 Human APOBEC3G-Myc-6Xhis、pcDAN3.1/His-C进入HepG2.2.15细胞,转染后,RT-PCR证实转染基因的表达,Western Blot证实蛋白的表达。通过ELISA方法检测细胞上清液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及乙型肝炎e抗原（HBeAg）,RT-PCR分析APOBEC3G对HBV mRNA转录的影响。结果APOBEC3G基因与蛋白在HepG2.2.15细胞都有表达,与空质粒转染组相比,pcDNA3.1 Human APOBEC3G-Myc-6Xhis转染组HBsAg含量下降70.38%,HBeAg含量下降62.88%,未转质粒细胞为空白对照组。结论APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗乙肝病毒感染。     

HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白的协同反式激活功能

目的 探讨HCV核心蛋白与截短型HBV表面抗原中蛋白的协同反式激活作用。方法 构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)-core和表达截短型HBV表面抗原中蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)-Mt；转染HepG2细胞，从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达；与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞，检测β－半乳糖苷酶（β-gal)表达活性，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子（增强子）功能的影响。结果 构建成HCV核心蛋白及截短型HBV表面抗原中蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)-core、pcDNA3.1(-)-Mt；在HepG2细胞均能瞬时表达相应的病毒蛋白；单独的共转染实验中pcDNA3.1(-)-core、pcDNA3.1(-)-Mt组的β-gal的表达分别是对照的4．6和3．2倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照组的8．4倍；表达质粒对β－gal表达的激活作用呈剂量依赖性。结论 HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和截短型HBV表面抗原中蛋白均具有反式激活SV40早期启动子（增强子）的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

携带GDNF基因转移的真核表达载体的构建及表达

目的 构建pcDNA3.1( )GDNF真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法 将GDNF逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物克隆至pcDNA3.1( )真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以Fu Gene 6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果 酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白。结论 以Fu Gene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒转染真核细胞为基因治疗帕金森氏病奠定了一定基础。     

Survivin启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的了解Survivin启动子在HepG2肝癌细胞与3T3细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并评价其驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的能力。方法以pGL3-surp340质粒为模板,扩增Survivin340启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail。将重组质粒分别转染HepG2肝癌细胞和3T3细胞,通过Western Blot检测两种细胞中Trail蛋白表达的差异。利用流式细胞术检测HepG2肝癌细胞及3T3细胞转染重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail后细胞凋亡的情况。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,转染HepG2和3T3两种细胞后,通过Western Blot检测,HepG2肝癌细胞Trail蛋白表达的相对灰度值为0.49±0.43,较3T3细胞Trail蛋白表达(0.15±0.37)明显增强(P0.05)。利用流式细胞术检测,HepG2肝癌细胞转染重组质粒组的凋亡率(%)为11.59±0.74,空白质粒组为3.45±0.52,未转染组为2.67±0.34;3T3细胞重组质粒组的凋亡率(%)为3.26±0.24,空白质粒组3.16±0.15,未转染组2.83±0.27。HepG2细胞转染重组质粒组凋亡率明显高于其他对照组(P0.05)。结论含Survivin基因启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒感染BALB/C小鼠动物模型建立的实验研究

[目的]建立小鼠急性乙型肝炎病毒(HBV)感染的动物模型,观察小干扰RNA(si RNA)在体内对HBV复制和表达的影响.[方法]通过尾静脉快速、高负荷注射含1.5倍的HBV真核表达质粒(pHBV1.5).注射后第6天,MEIA检测血清HBsAg、HBeAg的水平;RT-PCR检测肝组织HBV prec/c mRNA转录的水平.同时设立pcDNA3.1正常对照组和PBS空白对照组.[结果]pHBV1.5注射组小鼠血清HBsAg、HBeAg为阳性,且肝组织表达HBeAg;而pcDNA3.1和PBS对照组未能检测到HBsAg、HBeAg的表达.[结论]成功地建立了急性HBV感染的BALB/C小鼠动物模型,在一定程度上克服了由于HBV宿主范围极窄给人们研究带来的极大限制.     

靶向HBX基因小干扰RNA抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的探讨HBX特异性RNA小干扰抑制乙型肝炎病毒复制的作用。方法用脂质体转染法将干扰质粒pSilencer3.1-shHBX和通用阴性对照质粒分别转染HepG2.2.15细胞,并设立未转染的空白对照组。分别于转染后24、487、2 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA检测3组细胞上清中HBsAg和HBeAg表达情况。结果 Western blot检测显示,干扰质粒转染组HBx蛋白表达量逐渐降低,各时间点的表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);ELISA检测显示,各时间点干扰质粒转染组细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的表达均下调,表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均具有统计学意义(P0.01)。结论 HBX特异性小干扰RNA可抑制HBV复制,为siRNA作为抗乙肝病毒感染制剂提供了实验依据。     

1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

目的构建基于pBlueBac4．5质粒的1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒（HBV）重组体，并研究其在HepG2细胞中的表达和复制。方法以重组质粒pWT上的1．2倍基因组长度C基因型HBVDNA序列和pBB4．5HBV1．3（D基因型）上的pBlueBac4．5载体序列为模板，构建重组质粒pBB4．5HBV1．2（C基因型）。用FuGENEHD瞬时转染法，将pBB4．5HBV1．2导人HepG2细胞。用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法，分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBVDNA水平。此外，对转染时重组质粒用量进行优化。结果酶切和序列分析证实，pBB4．5HBV1．2重组质粒构建成功。初步转染实验证实，在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg。优化后转染条件为：使用60mm细胞培养皿，8～11tLgpBB4．5HBV1．2，质粒与转染试剂5：9（μg：μl）。在此条件下，5d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达（峰值一般出现在转染后第3天）、HBVDNA持续复制（10^6～10^8拷贝／ml）及HBVDNA复制中间体形成。结论在HepG2细胞中，建立了以杆状病毒转移载体pBlueBac4．5为基础的1．2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系，有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台。     

乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达

目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.     

乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的研究

目的 研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠及其病毒清除作用。方法 将小鼠随机分为8组,分别注射以下质粒:A组pcDNA3.1-S 100μg;B组:pcDNA3.1-GM-CSF-S 100μg;C组:pcDNA3.1-S-GM-CSF 100μg;D组:pcDNA3.1-S 50μg pcDNA3.1-GM-CSF 50μg;E组:pcDNA3.1-GM-CSF 100μg;F组:重组酵母乙型肝炎疫苗1μg;G组:pcDNA3.1 100μg;H组:磷酸盐缓冲液(PBS)100μl。于质粒注射前4d肌肉注射0.25％bupivacaine溶液100μl,诱导骨骼肌细胞变性。以HBsAg和GM-CSF的融合乙型肝炎表达质粒免疫HBV转基因小鼠,检测HBV转基因小鼠血清HBsAg表达水平及肝细胞HBsAg的表达,检测脾细胞白细胞介素(IL)-2、IL-4及γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平及淋巴细胞增殖情况,并进行肝组织学检查。结果 质粒加强免疫4周后血清HBsAg检测结果A组为28.28±15.32、B组为10.77±9.18、C组为44.16±8.30、D组为21.93±13.28、E组48.04±3.60、F组为38.3±11.66、G组为47.03±3.96、H组为51.46±4.70,F=11.262,P<0.01,其中B组血清HBsAg滴度显著低于其余各组。IL-2分泌水平(pg/ml)A组为25.5±7.5、B组为48.5±11.3、C组为4.0±2.5、D组为38.0±8.5、E组为3.7±2.1、F组为6.5±23.     

乙型肝炎表面抗原主要亲水区Ⅱ的抗原性

目的研究HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异对HBsAg抗原性的影响。方法定点突变HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对应的s基因(P120T、C12lS、K1221和T123N),构建4个真核表达重组质粒。用重组质粒和表达G145R HBsAg质粒体外瞬时转染HepG2细胞。4种抗体和7种国产HBsAg ELISA诊断试剂盒检测转染细胞上清液和细胞裂解液中变异HBsAg的免疫反应性;免疫荧光检测单克隆抗体与转染细胞内变异HBsAg的免疫反应性。结果成功构建了表达HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异的重组质粒,P120T、C121S、K122I和T123N变异HBsAg的免疫反应性比野生HBsAg低,T123N变异导致HBsAg存在分泌障碍。结论HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对维持HBsAg的空间构象和抗原性具有重要作用。     

Inhibition of hepatitis B virus replication by pokeweed antiviral protein in vitro

AIM： To explore the inhibitory effects of pokeweed antiviral protein seed （PAP-S） and PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid on hepatitis B virus （HBV） replication in vitro. METHODS： HepG2 2.2.15 cells in cultured medium were treated with different concentrations of PAP-S. HBsAg, HBeAg and HBV DNA in supernatants were determined by ELISA and fluorescent quantitative PCR respectively. MTT method was used to assay for cytotoxicity. HepG2 were cotransfected with various amounts of PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid and replication competent wild-type HBV 1.3 fold overlength plasmid. On d 3 after transfection, HBsAg and HBeAg were determined by using ELISA. Levels of HBV core-associated DNA and RNA were detected by using Southern and Northern blot, respectively. RESULTS： The inhibitory effects of PAP-S on HBsAg, HBeAg and HBV DNA were gradually enhanced with the increase of PAP concentration. When the concentration of PAP-S was 10 μg/mL, the inhibition rates of HBsAg, HBeAg and HBV DNA were 20.9%, 30.2% and 50%, respectively. After transfection of 1.0 μg and 2.0 μg plasmid pXF3H-PAP, the levels of HBV nucleocapside- associated DNA were reduced by 38.0% and 74.0% respectively, the levels of HBsAg in the media by 76.8% and 99.7% respectively, and the levels of HBeAg by 72.7% and 99.3% respectively as compared with controls. Transfection with 2 μg plasmid pXF3H-PAP reduced the levels of HBV nucleocapside-associated RNA by 69.0%.CONCLUSION： Both PAP-S and PAP encoded by a eukaryotic expression plasmid could effectively inhibit HBV replication and antigen expression in vitro, and the inhibitory effects were dose-dependent.     

表达HBeAg和HBsAg对HepG2细胞系细胞因子分泌及ACE活性的影响

目的:观察HBeAg和HBsAg对人肝癌细胞系 HepG2细胞中血管紧张素转化酶(ACE)分泌的影响．方法:利用本所既往构建的表达乙肝病毒 (HBV)表面抗原和E抗原的真核表达载体 pcDNA3．1(-)-HBsAg、pcDNA3．1(-)-HBeAg 及空载体pcDNA3．1(-)转染HepG2细胞,观察转染24,48 h后细胞上清中ACE活性和炎性细胞因子IL-6、IL-8的变化．培养细胞上清液内 ACE活性采用底物裂解法检测;IL-6、IL-8浓度采用流式细胞仪检测．结果:转染48 h的HepG2细胞裂解液中检测到了HBsAg和HBeAg的表达,但二者细胞上清中的ACE与转染空载体对照pcDNA3．1(-)细胞上清中的ACE无显著差异;同样,炎性因子 IL-6和IL-8也没有显著差异．结论:HBV HBsAg和HBeAg对ACE活性、 IL-6和IL-8不具有显著的上调或下调作用; HBsAg和HBeAg在肝纤维化发生过程中的作用机制尚待进一步阐明．     

痉挛性截瘫蛋白21对乙型肝炎病毒复制的影响及其机制

目的 探讨人痉挛性截瘫蛋白21 (SPG21)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响,并探讨其调节机制.方法 将HBV感染性克隆pHBVl.3及其启动子pHBV-Luc分别转染HepG2细胞,加入不同浓度的SPG21蛋白,采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg含量;RTPCR和Western blot法检...     

长片段RNA抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达和复制

目的 评估长的反义RNA干扰片段在培养细胞株中对HBV复制的抑制效应.方法将HBV基因组S区的全部核苷酸序列插入至pTARGETTM载体中,并将重组载体转染入HepG2.2.15细胞中.用酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg水平,用荧光定量PCR法检测HBVDNA水平.对数据采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验与两两比较的Mann-Whitney U检验.结果 经过处理后,HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg表达量(A值)在HBS2组(携带长片段反义RNA)为0.621±0.027,在HBS4组(携带正义RNA)为3.399±0.018,对照组为2.232±0.187;HBeAg表达量(A值)在HBS2组、HBS4组和对照组分别为0.749±0.019、1.548±0.025和1.570±0.044; HBV DNA水平(×104拷贝/ml)在HBS2组、HBS4组、对照组分别为1.597±0.082、3.381±0.297和3.610±0.063.与对照组相比,HBS2组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达量均降低,统计量Z值均为-2.309,P值均＜0.05; HBS4组HBsAg表达量增高(Z=-2.309,P＜0.05),而HBeAg和HBV DNA表达量无明显差异,统计量Z值分别为-0.866、-1.155,P值均＞0.05.结论 长片段反义RNA能抑制HBV基因的表达和病毒复制.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of long antisense RNA on HBV replication in HepG2.2.15 cells. Methods The coding region of HBV S gene was cloned into pTARGET vector in sense and antisense orientations and the recombinant plasmids were transfected into HepG2.2.15 cells which were divided into HBS2 (antisense RNA) group, HBS4 (sense RNA) group and control group. HBsAg and HBeAg in the culture supernant were detected by ELISA. The HBV DNA in the supernant was quantified by real-time PCR. Results After treatment, the levels of HBsAg in HepG2.2.15 cell supernatants of three groups were 0.621 ± 0.027, 3.399 ± 0.018 and 2.232 ± 0.187 respectively; the levels of HBeAg were 0.749 ± 0.019,1.548 ± 0.025 and 1.570 ± 0.044 respectively and the levels of HBV DNA were 1.597 ± 0.082, 3.381 ± 0.297 and 3.610 ± 0.063 respectively. The expressions of HBsAg and HBeAg and the HBV DNA level in HBS2 group were remarkably reduced as compared to the control (Z = -2.309, P ＜ 0.05); whereas the sense plasmid transfection (HBS4) did not affect HBeAg (Z= -0.866) and HBV DNA (Z = -1.155) levels in the culture supernant but slightly increased the HBsAg level (Z = -2.309). Conclusion Antisense RNA might be a useful tool to repress HBV replication.     

Construction and expression of eukaryotic plasmids containing lamivudine-resistant or wild-type strains of Hepatitis B Virus genotype C

AIM： To construct eukaryotic expression plasmids of full-length Hepatitis B Virus （HBV） genotype C genome, which contain lamivudine-resistant mutants （YIDD, YVDD） or wild-type strain （YMDD）, and to observe the expression of HBV DNA and antigens [hepatitis B surface antigen （HBsAg） and hepatitis B e antigen （HBeAg）] of the recombinant plasmids in HepG2 cells. METHODS： Three HBV full-length genomes were amplified from the plasmids pMD18T-HBV/YIDD, pMD18T-HBV/YVDD and pMD18T-HBV/YMDD, using PCR. Three recombinant plasmids were generated by inserting each of the PCR products into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 （＋）, between the EcoRI and HindⅢ sites. After being characterized by restriction endonuclease digestion, and DNA sequence analysis, the recombinant plasmids were transfected into HepG2 cells. At 48 and 72 h post-transfection, the levels of intracellular viral DNA replication were detected by real-time PCR, and the expression of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant was determined by ELISA.
RESULTS： Restriction endonuclease digestion and DNA sequence analysis confirmed that the three recombinant plasmids were correctly constructed. After transfecting the plasmids into HepG2 cells, high levels of intracellular viral DNA replication were observed, and HBsAg and HBeAg were secreted into the cell culture supernatant.
CONCLUSION： Eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1 （＋）-HBV/YIDD, pcDNA3.1 （＋）-HBV/YVDD or pcDNA3.1 （＋）-HBV/YMDD, which contained HBV genotype C full-length genome, were successfully constructed. After transfection into HepG2 cells, the recombinant plasmids efficiently expressed HBV DNA, HBsAg and HBeAg. Our results provide an experimental basis for the further study of HBV lamivudine-resistant mutants.     

低密度cDNA Macroarray对干扰素α抗病毒蛋白的筛选

目的 基于低密度cDNA Macoarray技术筛选出差异表达的干扰素(IFN)α抗病毒基因,以探讨IFN α抗病毒蛋白的表达与HBV复制的关系. 方法 以一定浓度的IFN α处理肝胚瘤细胞株HepG2和HepG2.2.15细胞6h,用cDNA Macroarray分析比较两细胞株IFN α抗病毒基因表达谱,并筛选出差异表达的IFNα抗病毒基因.将表达HBV核心蛋白(HBc)的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,RT-PCR法分析HBc对IFN α抗病毒基因表达的影响.将表达抗黏病毒A蛋白(MxA)的表达质粒pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2.2.15,以酶联免疫吸附试验、Dot blot、Southern blot等方法分别检测HepG2.2.15细胞表达释放的HBsAg与HBeAg、细胞外HBV DNA和细胞内HBV DNA复制中间体(松弛环状DNA、双股线性DNA),以判断HBV复制情况.两组间数据比较采用t检验,组间不同时间点数据比较采用单因素方差分析.结果 cDNA Macroarray分析显示HepG2和HepG2.2.15细胞的抗病毒基因表达谱具有差异性:IFNa抗病毒基因中干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)1、IFITM2、IFITM3、RING4等在HepG2.2.15细胞的表达被部分抑制,而重要的抗病毒蛋白MxA表达被完全抑制.HBc转染组细胞中MxA mRNA表达的相对水平为0.31±0.05,低于空白对照组的0.74±0.04,差异有统计学意义,P＜0.05.MxA蛋白转染HepG2.2.15细胞48、72 h后,MxA转染组细胞上清液中HBsAg的S/CO值分别为1.42+0.21和1.58±0.18,HBeAg的S/CO值为1.44±0.14和2.28±0.24,而空白对照组细胞上清液中HBsAg的S/CO值为1.92±0.19和2.79±0.25,HBeAg的S/CO值为2.31±0.46和3.37±0.29,两组细胞上清液中HBV抗原的S/CO值差异均有统计学意义,P值均＜0.05.细胞外HBV DNA、胞内HBV复制中间体DNA均无明显变化.结论 HBV及其抗原成分的复制和表达影响着IFNα抗病毒蛋白的表达;HBV通过抑制IFN α抗病毒蛋白的表达而发挥拮抗IFNα的抗病毒活性.     

反义锁核酸与拉米夫定在HepG2.2.15细胞中抗HBV作用的比较

目的:应用反义锁核酸与拉米夫定作用HepG2.2.15细胞,对他们抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)效果进行比较.方法:设计针对HBV翻译起始区S基因mRNA的反义寡核苷酸,并进行锁核酸修饰,以阳离子脂质体介导反义锁核酸转染HepG2.2.15细胞;拉米夫定组直接作用HepG2.2.15细胞;分别于用药后第2、4、6、8、10天收集细胞培养上清液.用ELISA法和FQ-PCR法检测收集上清液HBsAg、HBeAg和HBVDNA的含量.MTT法分别检测反义锁核酸与拉米夫定对细胞存活率的影响.结果:拉米夫定对HBVDNA具有明显抑制作用,最高可达46.52%,但对HBsAg、HBeAg影响较小;反义锁核酸对HBsAg、HBeAg及HBVDNA均有较强抑制作用,对HBsAg、HBeAg和HBVDNA的最高抑制率分别达67.69%、59.71%和62.96%(P<0.05),且抑制随时间呈增高趋势.反义锁核酸与拉米夫定对细胞代谢均无明显影响.结论:反义锁核酸抗HBV作用机制与拉米夫定不同,反义锁核酸抗HBV作用明显优于拉米夫定.     

乙型肝炎病毒/P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。