miRNA-143对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响及机制研究

目的 探讨miRNA-143对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响及机制.方法 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测宫颈癌组织、癌旁组织及宫颈癌C-33A、HeLa、CaSki细胞中miRNA-143的表达水平.将miR-NA-143 mimics、miRNA-143 inhibitor及HIF-1α-siRNA转染至HeLa细胞中,未转染的作为对照组.Western blot检测转染48 h后miRNA-143 mimics组、miRNA-143 inhibitor组和对照组的HIF-1α蛋白表达水平.将miRNA-NC+miRNA-143 mimics、Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics、Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics转染HeLa细胞,检测荧光素酶活性;后续实验分为对照组、miRNA-143 mimics组及HIF-1α-siRNA组,各组细胞转染48 h后,CCK8试验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Ki-67、cleaved caspase 3、β-catenin、cyclin D1蛋白表达水平.结果 宫颈癌组织中miRNA-143的表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01),人宫颈癌CaSki细胞中的miR-NA-143表达水平高于人宫颈癌HeLa细胞和C-33A细胞(P<0.05).miRNA-143 mimics组的HIF-1α蛋白表达水平低于对照组,miRNA-143 inhibitor组的HIF-1α蛋白表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).Wt-HIF-1α+miRNA-143 mimics组的荧光素酶活性低于miRNA-NC+miRNA-143 mimics组和Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics组,差异均有统计学意义(P<0.05);而Mut-HIF-1α+miRNA-143 mimics组与miRNA-NC+miRNA-143 mim-ics组的荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05).miRNA-143 mimics和HIF-1α-siRNA组的细胞存活率及Ki-67、β-catenin、cyclin D1蛋白表达水平均低于对照组,细胞凋亡率及cleaved caspase 3蛋白表达水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 miRNA-143在宫颈癌中低表达,miRNA-143可通过下调HIF-1α的表达及抑制Wnt/β-catenin信号通路,抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖并促进其凋亡.     

生长抑制因子4对宫颈癌细胞CaSki增殖和凋亡的影响及作用机制研究

目的 探讨生长抑制因子4(ING4)对宫颈癌细胞CaSki增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 取50例宫颈癌患者的宫颈癌组织和癌旁组织,宫颈癌细胞系Hela、SiHa、CaSki和正常宫颈细胞系Ect1/E6E7,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测宫颈癌组织和细胞中ING4 mRNA的相对表达量,蛋白质印迹(Western blot)法检测组织和细胞中ING4蛋白的相对表达量.分别将转染ING4过表达慢病毒和稳定阴性对照慢病毒的宫颈癌细胞CaSki作为Lv-ING4组和Lv-NC组,将没有转染慢病毒的细胞作为对照组,CCK8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,Western blot法检测caspase 3、β-catenin、c-myc蛋白的相对表达量.采用WNT/β-catenin信号激活剂LiCl处理ING4表达上调的宫颈癌CaSki细胞,检测细胞增殖能力、凋亡能力,以及caspase 3、β-catenin、c-myc蛋白的相对表达量.结果 宫颈癌组织中ING4 mRNA的相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.01),宫颈癌细胞CaSki中ING4 mRNA和ING4蛋白的相对表达量均明显低于宫颈癌细胞Hela、SiHa和正常宫颈细胞Ect1/E6E7(P<0.01).慢病毒转染后,Lv-ING4组细胞中ING4 mRNA和ING4蛋白的相对表达量均明显高于对照组和Lv-NC组(P<0.01),光密度(OD)值明显低于对照组和Lv-NC组(P<0.01),细胞凋亡率明显高于对照组和Lv-NC组(P<0.01);Lv-ING4组宫颈癌细胞caspase 3蛋白的相对表达量明显高于对照组和Lv-NC组(P<0.01),β-catenin、c-myc蛋白的相对表达量均明显低于对照组和Lv-NC组(P<0.01).WNT/β-catenin信号激活剂LiCl处理ING4表达上调的宫颈癌细胞CaSki后,Lv-ING4+LiCl组细胞OD值明显高于Lv-ING4组(P<0.01),凋亡率明显低于Lv-ING4组(P<0.01),Lv-ING4+LiCl组细胞caspase 3蛋白相对表达量明显低于Lv-ING4组(P<0.01),β-catenin、c-myc蛋白相对表达量均明显高于Lv-ING4组(P<0.01).结论 ING4在宫颈癌中表达下调,其可能通过下调WNT/β-catenin信号激活通路抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

表观遗传修饰介导抑制SOSTDC1表达促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为

目的：探究含硬化蛋白域蛋白1（SOSTDC1）对宫颈癌细胞恶性生物学行为的调控及其分子机制。方法：收集2020年8 月至2022 年5 月间在福建省肿瘤医院活检或手术切除的53 例宫颈癌组织和相应的癌旁组织标本,免疫组化法检测SOSTDC1 蛋白在宫颈癌组织及相应癌旁组织中的表达,qPCR 法检测正常宫颈细胞、宫颈癌细胞中SOSTDC1 mRNA 表达;将SOSTDC1 过表达慢病毒（OE-sostdc1）和对照空病毒（NC）感染宫颈癌细胞SiHa 及CaSki,将其分为SiHa-OE-sostdc1、SiHa-NC、CaSki-OE-sostdc1、CaSki-NC 组,采用WST-1法、细胞集落形成实验、Transwell 实验和WB法检测转染各组SiHa 及CaSki 细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力和BMP、Wnt/β-catenin 信号途径相关蛋白及上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的表达。用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂2''-脱氧胞苷（5''-Aza-CdR）处理宫颈癌细胞后采用qPCR和WB法检测SOSTDC1 mRNA及蛋白的表达变化,用甲基化特异性PCR（MSP）检测5 例配对宫颈癌组织与癌旁组织中SOSTDC1 基因启动子区甲基化水平,同时qPCR 检测其SOSTDC1 mRNA水平。结果：与癌旁组织比较,SOSTDC1蛋白在宫颈癌组织中呈低表达（P<0.01）,且与淋巴结转移与FIGO分期有关联（均P<0.05）;与正常宫颈HUCEC细胞比较,SOSTDC1 mRNA 在宫颈癌C33A、HeLa、SiHa、CaSki 细胞中均呈低表达（均P<0.01）。过表达SOSTDC1显著抑制SiHa 及CaSki 细胞的增殖、迁移和侵袭能力（均P<0.05）。WB法结果检测显示,过表达SOSTDC1 显著抑制 SiHa 及 CaSki 细胞中磷酸化 Smad、Dvl2/3、β -catenin、VIM、N-cadherin、Snail 蛋白的表达（均P<0.05）,5''-Aza-CdR 处理后的SiHa 及CaSki 细胞中SOSTDC1 mRNA和蛋白水平均显著增加（均P<0.05）,MSP检测结果显示,相较于癌旁组织,宫颈癌组织中SOSTDC1基因启动子区呈高度甲基化,且SOSTDC1 mRNA水平降低（P<0.01）。结论：SOSTDC1在宫颈癌组织中呈低表达且与肿瘤的恶性进展关联,其表达下调与其基因启动子区高度甲基化有关,过表达SOSTDC1 可能通过阻断BMP及Wnt/β-catenin信号通路从而抑制SiHa、CaSki细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

下调miR-221表达抑制子宫颈癌细胞恶性生物学行为及其作用机制

目的:探讨下调miR-221表达对子宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制.方法:运用脂质体2000转染法将miR-221抑制剂和阴性对照核苷酸片段(NC)转染子宫颈癌细胞HeLa、C33A、SiHa和Caski细胞,用Western blotting和Real-time PCR分别检测ARID1A(miR-221靶蛋白)、cleaved caspase 3、caspase 3、cleaved PARP、PARP、MMP-9、MMP-13、TIMP-3蛋白表达水平和miR-221、MMP-9、MMP-13、TIMP-3 mRNA的表达水平;用MTT法、克隆形成实验、AnnexinV-FITC/PI染色结合流式细胞术分别测定细胞增殖、克隆形成率和细胞凋亡率.结果:与阴性对照组比较,(1) miR-221抑制剂转染的HeLa、CC3A、SiHa和Caski细胞miR-221表达量均显著降低[(0.23±0.01)、(0.31±0.02)、(0.34±0.01)、(0.37±0.02),F=25.44,P＜0.05];(2)转染的细胞随着培养时间的增加细胞存活率逐渐下降,具有时间依赖效应,48 h之后细胞存活率显著低于阴性对照组(F=37.42,P＜0.05);细胞的克隆形成率显著降低(F=43.58,P＜0.05);培养72 h时细胞凋亡率分别为:HeLa(27.92±3.47)％、C33A(20.84±4.31)％、SiHa(18.81±2.18)％、Caski(19.86±3.82)％,均显著高于对照组(F =54.78,P＜0.05);(3)转染细胞下调miR-221表达后促进cleaved caspase 3、cleaved PARP、TIMP-3蛋白表达,抑制MMP-13蛋白表达;降低MMP-13 mRNA表达(=37.50,P＜0.05),增加TIMP-3 mRNA表达(t=46.30,P＜0.05).结论:下调miR-221表达能抑制子宫颈癌细胞的恶性生物学行为,其机制与激活caspase信号通路从而诱导细胞凋亡以及调控MMP-13和TIMP-3的表达有关.     

索拉非尼对宫颈癌细胞的增殖抑制作用及对PCNA、Survivin表达的影响

目的 探讨索拉非尼对宫颈癌细胞株增殖和凋亡的影响。方法体外培养宫颈癌HeLa、SiHa细胞株,实验分为空白对照组、阴性对照组（DMSO）和索拉非尼（0、25、5、10、20 μmol／L）处理组。光学显微镜观察各组细胞形态学改变;Hoechst荧光染色观察凋亡细胞核的形态学变化;采用MTS法检测索拉非尼对HeLa和SiHa细胞的增殖抑制作用;免疫细胞化学法检测索拉非尼（10 μmol／L）处理HeLa、SiHa细胞48 h后Survivin蛋白的表达;Western blotting检测索拉非尼对宫颈癌HeLa、SiHa细胞PCNA、Survivin蛋白表达的影响。结果不同浓度索拉非尼作用48 h后,HeLa、SiHa细胞出现了凋亡形态学改变;Hoechst染色显示,HeLa、SiHa细胞的胞核变小、固缩,荧光明显增强。MTS检测显示,索拉非尼可抑制宫颈癌HeLa、SiHa细胞增殖,并呈浓度依赖性（P＜0.05）。免疫细胞化学法检测显示,阴性对照组Survivin在HeLa和SiHa细胞中的平均光密度值分别为0.19±0.05和0.17±0.07,与索拉非尼处理组的0.13±0.01和0.13±0.03比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western blotting检测显示,索拉非尼在蛋白水平上能够降低PCNA、Survivin表达,且这种下调作用具有浓度依赖性。结论索拉非尼能诱导HeLa、SiHa细胞凋亡,抑制其增殖且呈浓度依赖性,其机制可能与下调癌基因 PCNA、Survivin表达有关。     

miR-224对宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的:探讨miR-224对宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖、凋亡及迁移的影响。方法:对宫颈癌细胞株SiHa和HeLa中miR-224进行过表达或沉默,采用qRT-PCR法检测miR-224的转染效果,转染成功后采用CCK-8法、FCM检验、Transwell试验检测各组细胞增殖、凋亡及迁移情况。结果:与正常293T细胞相比,宫颈癌细胞SiHa、HeLa中miR-224表达量均升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;转染成功后CCK-8法检测SiHa和HeLa细胞增殖情况,与阴性对照组和空白组比较,miR-224 mimic组细胞增殖能力增强,miR-224 inhibitor组细胞增殖能力减弱,差异具有统计学意义（P<0.01）;流式细胞仪检测SiHa和HeLa细胞凋亡情况,miR-224 mimic组细胞凋亡百分比明显低于阴性对照组（P<0.01）,miR-224 inhibitor组细胞凋亡百分比明显高于阴性对照组（P<0.01）;划痕试验检测SiHa和HeLa细胞迁移能力,48 h时miR-224 mimic组细胞愈合速率明显较阴性对照组和空白组快,差异有统计学意义（P<0.01）,miR-224 inhibitor组细胞愈合速率明显较阴性对照组慢,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:宫颈癌细胞中miR-224过表达可促进细胞增殖和迁移并抑制凋亡,沉默miR-224可抑制细胞增殖和迁移并促进凋亡。     

HK2通过Akt1/p-Akt1上调Cdc42表达促进宫颈癌细胞迁移和侵袭

目的:探究己糖激酶2（HK2）通过Akt1/p-Akt1/Cdc42促进宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用机制。方法:G418压力筛选并获取稳定表达HK2蛋白的HeLa和SiHa细胞系;Western blot和细胞免疫化学鉴定HK2蛋白在HeLa和SiHa细胞系中的表达水平;细胞划痕实验检测HK2对HeLa和SiHa体外划痕愈合能力的影响;Transwell迁移、侵袭实验检测HK2对HeLa和SiHa细胞体外迁移和侵袭能力的影响;GEPIA数据库分别分析宫颈癌中HK2的表达与Akt1、Cdc42表达的相关性;Western blot检测Akt1、p-Akt1、Cdc42蛋白在HK2过表达的HeLa细胞和SiHa细胞中的表达情况;在HK2过表达的HeLa、SiHa细胞中应用Akt1/p-Akt1抑制剂MK2206观察Cdc42的表达及细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:成功构建HK2稳定表达的HeLa、SiHa细胞系;过表达HK2促进了HeLa、SiHa细胞的划痕愈合能力,促进了HeLa、SiHa细胞的体外迁移和侵袭;GEPIA在线数据库结果显示在宫颈癌中HK2表达与Akt1、Cdc42表达均呈正相关;过表达HK2上调了Akt1、p-Akt1、Cdc42蛋白在HeLa、SiHa细胞中的表达;在HK2过表达HeLa、SiHa细胞中,MK2206的使用抑制了HK2对Cdc42表达上调及细胞迁移和侵袭的促进作用。结论:HK2可能通过Akt1/p-Akt1途径上调Cdc42蛋白的表达促进HeLa和SiHa细胞的迁移和侵袭。     

Wnt10a及Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞增殖及其机制研究

目的:探讨Wnt10a及其Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌中的作用及其机制。方法:qPCR检测Wnt10a在正常宫颈细胞和不同宫颈癌细胞系中的表达,选取Wnt10a高表达细胞进行后续实验。构建Wnt10a过表达质粒,将细胞分为对照组、Wnt10a过表达组、LGK-974(Wnt抑制剂)组和Wnt10a过表达+LGK-974组。qPCR和Western blot检测细胞中Wnt10a mRNA和蛋白的表达,CCK-8检测细胞增殖能力,Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin、Cyclin D1、c-Myc的表达。结果:Wnt10a在C-33 A、Ca Ski、HeLa、HeLa 229宫颈癌细胞中的表达均显著高于正常宫颈细胞(P<0.05),且在C-33 A细胞中的表达水平最高。与对照组相比,Wnt10a过表达组细胞增殖能力、细胞中Wnt10a mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.01),Bcl-2、Wnt1、β-catenin、Cyclin D1、c...     

GRP78在不同亚型宫颈癌细胞株中表达情况及对顺铂敏感性影响

目的：研究不同亚型宫颈癌细胞株中葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78,GRP78）表达情况，以及GRP78表达水平对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响。方法：采用免疫组织化学法检测人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16（+）SiHa、HPV18（+）HeLa以及HPV（-）C33a宫颈癌细胞中的GRP78表达，MMT、Western blot法检测以上3种细胞在不同浓度顺铂、衣霉素+顺铂处理后的细胞抑制率及GRP78表达水平，采用单因素方差分析，分析相同浓度下单用顺铂、衣霉素+顺铂联合处理后3种细胞的细胞抑制率及GRP78蛋白表达的差异。结果：SiHa、HeLa细胞GRP78阳性表达水平明显高于C33a细胞，SiHa细胞GRP78阳性表达水平最高（P＜0.01）。随着顺铂浓度增加，3种宫颈癌细胞抑制率增加呈浓度依赖性，且HeLa细胞抑制率最高（P＜0.05）。与单独顺铂组相比，衣霉素联合顺铂药物处理组中HeLa及SiHa细胞抑制率显著升高（P＜0.05），并且GRP78表达水平也明显升高（P＜0.01），且各细胞株中GRP78表达水平均随顺铂浓度增加而增加。结论：GRP78表达水平与宫颈癌细胞亚型有关，SiHa、HeLa细胞对顺铂敏感性高于C33a细胞。衣霉素导致GRP78明显高表达，增加了SiHa、HeLa细胞对顺铂的敏感性。     

Survivin短发夹状RNA对宫颈癌细胞系HeLa增殖和凋亡的影响

目的:观察survivin基因短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对宫颈癌细胞系HeLa增殖和凋亡的影响。方法:通过脂质体介导的细胞转染技术将含人survivin基因shRNA的重组真核表达质粒pSilenc-er2.1-s2转染宫颈癌细胞系HeLa,G418筛选阳性克隆,半定量PCR、Western blot分别检测survivin mRNA和蛋白表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期变化,流式细胞仪、Hoechst染色观察细胞凋亡情况。结果:G418筛选34天后出现阳性克隆,与转染阴性对照质粒(HeLa-NC)、空载质粒(HeLa-U6 neo)及未转染(HeLa)细胞比较,转染pSilencer2.1-s2质粒者survivin mRNA和蛋白表达明显下降,表达抑制率分别为:62.8%和60.1%;细胞增殖受到抑制,最高细胞生长抑制率为:(57.8±2.1)%(P<0.05);细胞周期发生显著变化,细胞被阻滞于G0/G1期,占(72.7±3.1)%(P<0.05),G2/M期明显减少,占(5.1±2.9)%(P<0.05);细胞凋亡率为:(29.2±1.4)%,明显升高(P<0.05)。结论:Survivin基因shRNA可通过下调HeLa细胞中survivin的表达,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

沉默GRP94抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移

目的:探究GRP94在不同宫颈癌细胞株中的表达情况,及GRP94对细胞侵袭和迁移能力的影响。方法:采用Western blot和qRT-PCR检测不同类型的宫颈癌细胞株中GRP94的表达水平。选择高表达GRP94的细胞株,应用RNA干扰技术下调GRP94的表达,采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞侵袭和迁移能力的改变。结果:与正常的宫颈细胞相比,GRP94在不同的宫颈癌细胞株(C33A、CaSki、HeLa、HeLa 229、MS751、ME-180、SiHa和HCC 94)中表达均升高,且GRP94在CaSki和MS751中表达量高,在ME-180、SiHa和HCC 94中表达量中等,在C33A、HeLa和HeLa 229中表达量低。选用GRP94高表达的CaSki细胞,下调GRP94的表达后,划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示细胞的侵袭和迁移能力显著下降。结论:GRP94在宫颈癌细胞中高表达,沉默GRP94的表达能抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。     

OCT-4在宫颈癌内表达情况及沉默表达后对宫颈癌Siha细胞放射敏感性影响

目的 研究OCT-4在宫颈癌组织中表达情况及沉默表达后对人鳞状宫颈癌Siha细胞放射敏感性的影响和机制。方法 利用RT-PCR和蛋白印迹法检测 20例宫颈癌患者癌组织中OCT-4基因mRNA和蛋白表达水平。OCT-4-SiRNA转染构建OCT-4沉默表达Siha细胞系并进行检测(OCT-4 SiRNA组),并设置未转染对照组和NC转染对照组。MTT和克隆实验检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡和细胞周期情况,蛋白印迹法检测各组细胞中cleaved-caspase-3和p-Akt水平。多组间比较行单因素方差分析,两组间比较行成组t检验。结果 随着宫颈癌患者放疗敏感性降低OCT-4基因mRNA (P=0.011、0.009、0.003、0.001)和蛋白表达水平(P=0.008、0.005、0.002、0.001)逐渐升高。与未转染对照组和NC转染对照组相比,OCT-4-SiRNA沉默表达组Siha细胞经不同剂量X射线照射后的细胞增殖抑制率上升(P=0.009、0.003、0.001、0.001);克隆形成能力显著降低(P=0.008、0.005、0.001、0.001),细胞凋亡上升并阻滞细胞在G₁期,细胞中cleaved-caspase-3水平上升而p-Akt水平下降。结论 OCT-4表达水平与宫颈癌患者放疗敏感性相关,而沉默OCT-4表达能提高Siha细胞放射敏感性,并通过促进cleaved-caspase-3而抑制p-Akt水平发挥作用。     

miR-21靶向抑制RECK对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和放射敏感性作用

目的:探究miR-21对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭以及放射敏感性的影响和潜在作用机制。方法:利用RT-qPCR方法检测宫颈癌组织和相邻非肿瘤组织、正常宫颈上皮细胞(H8)以及宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、ME180)中miR-21表达水平。通过CCK-8检测、Caspase3/7活细胞凋亡检测、伤口愈合试验...     

放射诱导的EGFR核转位阻断可增加人宫颈癌细胞放射敏感度

目的 探讨抑制EGFR核转位是否会降低人宫颈癌细胞的放射抵抗。方法 Western blot测定pEGFR-T654多肽、pEGFR-T654对照多肽、西妥昔单抗或吉非替尼预处理后X线照射的人宫颈鳞癌CaSki和腺癌HeLa细胞pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609的表达;克隆形成法测定存活分数（SF2）,单击多靶模型拟合剂量-存活曲线,计算放射增敏比（SER）。结果 4 Gy照射后, CaSki和HeLa细胞核EGFR表达呈时间依赖性增加;与对照多肽比较,pEGFR-T654多肽显著降低了CaSki和HeLa细胞核内pEGFR-T654、DNA-PK和pDNA-PK-T2609的表达;与单独放射比较,西妥昔单抗联合放射明显降低了CaSki细胞核EGFR、pEGFR-T654和pDNA-PK-T2609的表达以及克隆形成率和存活分数（SF2=31.030）,增加CaSki细胞的放射敏感度（SER=2.34）。结论 放射诱导pEGFR-T654核转位介导pDNAPK-T2609的活化,西妥昔单抗抑制pEGFR-T654核转运,降低了DNAPK介导的宫颈鳞癌放射抵抗。     

肼苯哒嗪对宫颈癌细胞系侵袭力的影响

目的探讨肼苯哒嗪去甲基化作用对人宫颈癌细胞系HeLa（HPV18型）、CaSki和SiHa（HPV16型）细胞侵袭力的抑制影响。方法Transwell侵袭小室法检测肼苯哒嗪处理前后人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa的侵袭力。甲基化特异性PCR（MSP）法检测肼苯哒嗪处理前后各细胞系中APC基因和CDH1基因5′端启动子区CpG岛甲基化状态。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测肼苯哒嗪处理前后,上述三种细胞系中APC和CDH1 mRNA表达情况。结果与未处理组比较,10 μmol/L肼苯哒嗪对人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa的侵袭力抑制作用差异无统计学意义,20 μmol/L与40 μmol/L肼苯哒嗪对人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa的侵袭力抑制作用差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);且不同浓度之间有差异,以40 μmol/L肼苯哒嗪抑制作用最强。40 μmol/L肼苯哒嗪处理后,上述三种细胞系中APC和CDH1基因呈现不同程度的去甲基化现象。经40 μmol/L肼苯哒嗪处理后,上述三种细胞系中APC mRNA表达分别是处理前的5.89倍、8.46倍及0.97倍,CHD1mRNA表达分别是处理前的4.82倍、5.90倍及8.46倍。结论一定浓度的肼苯哒嗪能明显抑制宫颈癌细胞系HeLa、CasKi和SiHa的侵袭力,其作用机制之一是通过去甲基化作用影响APC和CHD1的表达。     

下调Rab11基因对宫颈癌HeLa/SiHa 细胞侵袭迁移的影响及机制探讨

背景与目的：Rab11基因在宫颈癌细胞中高表达,可能与细胞恶性转化相关。本研究采用RNA干扰技术下调Rab11基因表达,并探讨其对宫颈癌HeLa/SiHa细胞侵袭迁移的影响及可能的相关机制。方法：将HeLa/SiHa细胞分为2组：阴性对照组(转染阴性对照的小干扰RNA)和Rab11 siRNA干扰组(转染小干扰Rab11siR-NA)。蛋白[质]印迹法(Western blot)检测Rab11干扰效果,检测转染Rab11 siRNA后,侵袭相关蛋白Rac1、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和MMP9表达的变化;细胞划痕损伤实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭;细胞免疫荧光实验从形态学角度探索在小干扰Rab11后Rac1蛋白在细胞膜上聚集位置的变化。结果：转染小干扰Rab11siRNA到HeLa/SiHa细胞后,Rab11蛋白表达受到高效抑制(P<0.01);细胞迁移、侵袭能力受到抑制(P<0.05),Rac1蛋白表达明显下调(P<0.01),MMP2、MMP9蛋白表达下调(P<0.05), Rab11 siRNA处理组细胞运动前端细胞膜下Rac1蛋白聚集量减少。结论：Rab11基因表达下调可以抑制HeLa/SiHa细胞的迁移和侵袭,其机制可能与Rac1、MMP2和MMP9蛋白表达量下降及Rac1定位的改变有关。     

宫颈癌组织中miRNA-34c 的表达水平分析及其靶基因PLK4 的鉴定

目的:分析miRNA-34c 在宫颈癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法:利用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测甘肃省妇幼保健医院34例宫颈癌和癌旁正常组织中miRNA-34c 表达水平。利用miRNA 靶基因预测数据库预测miRNA-34c 新的靶基因Polo 样激酶4（PLK 4）。 将含有PLK 4 的3‘UTR 片段荧光素酶载体分别与miRNA-34c 模拟物或阴性对照共转染HEK 293T 细胞,并检测其荧光素酶活性。在人宫颈癌细胞SiHa 细胞中分别转染miRNA-34c 模拟物或阴性对照,利用qRT-PCR法和Westernblot法分别检测靶基因的mRNA 和蛋白质的表达水平。结果:与癌旁正常组织相比,miRNA-34c 在宫颈癌组织中表达下调。在HEK 293T 细胞中,miRNA-34c 模拟物显著抑制荧光素酶的活性（P < 0.01）。 miRNA-34c 模拟物显著下调SiHa 细胞中PLK 4 的mRNA 和蛋白质的表达（P < 0.01）。 结论:miRNA-34c 在人宫颈癌组织中表达下调,且能与PLK 4 的3’UTR 结合并下调其mRNA 和蛋白质的表达。      

重组RA538,反义c—myc腺病毒对bcl—2高表达细胞系的作用及分子 …

目的 研究重组ＲＡ５３８（Ａｄ－ＲＡ５３８）、反义ｃ－ｍｙｃ腺病毒（Ａｄ－ＡＳｃ－ｍｙｃ）在ｂｃｌ－２高表达细胞系中的作用及其分析机制。方法 采用细胞形态学观察、ＭＴＴ、ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等方法,研究ＲＡ５３８,反义ｃ０ｍｙｃ重组腺病毒在ｂｃｌ－２高表达的人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ－ｂｃｌ２和ＳｉＨａ－ｂｃｌ２以及在其亲本细胞中的生物学作用及其分子机制。结果 以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ     

DNA-PKcs、Ku80及ATM备选宫颈癌放疗增敏靶点的体外研究

背景与目的:DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)是细胞受辐射后最致命的损伤,而DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、Ku80和ATM(ataxia-telangiectasia mutated)为DSB的主要修复蛋白.宫颈癌是以放疗为主要治疗手段的肿瘤.但其肿瘤细胞对放射线的敏感性不同.本实验拟研究3种DSB修复蛋白的表达与宫颈癌细胞放射敏感性的关系.并探讨DSB修复蛋白成为宫颈癌放疗增敏靶点的可能性.方法:免疫组化法检测41例宫颈癌患者组织中DNA-PKcs、Ku80和ATM蛋白的表达情况;Western blot检测8株肿瘤细胞(包括4株宫颈癌细胞)中3种蛋白的表达,克隆形成实验检测SF2 (suivival fraction at 2 Gv)、α值,分析蛋白表达水平和SF2、α值的关系;利用靶向抑制DNA-PKcs的shRNA表达质粒和小分子抑制剂LY294002,分别抑制HeLa细胞DNA-PKcs蛋白表达和活性后,克隆形成实验和流式细胞仪检测HeLa细胞受6 MVX线照射后的SF2、α值和凋亡率变化.结果:在41例宫颈癌组织中,Ku80、DNA-PKcs和ATM的阳性率分别为70.73%、68.29%和19.51%:8株肿瘤细胞中Ku80、DNA.PKcs和ATM蛋白的相对表达量与各细胞SF2、α值各不相同,作Pearson线性相关分析后得出DNA-PKcs的表达水平与SF2之间有明显的正相关关系(r=0.72,P=0.04);靶向抑制DNA-PKcs的shRNA可以促进HeLa细胞的放射敏感性,其SF2值为0.37,显著低于对照HeLa细胞的0.53(P＜0.05);单独接受50 μmol/L LY294002作用1 h HeIa细胞的凋亡率未见明显增加,但先经LY294002处理再照射6 Gy的HeLa细胞在48 h和72 h的凋亡率比单独照射6 Gy的HeLa细胞凋亡率显著增加(48 h点:t=3.25,P=0.03;72h点:t=3.01,P=0.04).结论:DNA-PKcs在宫颈癌组织中表达较高,且其表达水平可以预示肿瘤细胞的放射敏感性:抑制DNA-PKcs的表达或活性可以促进HeLa细胞的放射敏感性.