阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡及其分子机制的研究

【目的】观察阿霉素诱导Tca8113细胞凋亡及其过程中某些凋亡相关分子表达的变化,探讨其诱导凋亡作用的分子机制。【方法】采用MTT法检测阿霉素对Tca8113细胞的增殖作用;以光镜、荧光纤维镜、流式细胞仪和Annexin V-FITC标记法检测细胞凋亡;以蛋白印迹法分析阿霉素对Bcl-2、Bax和Survivin蛋白表达的影响。【结果】阿霉素以剂量依赖方式抑制Tca8113细胞增殖;光镜及荧光显微镜下可见明显凋亡细胞;流式细胞仪检测显示细胞停滞于G1或S期,有明显凋亡峰出现;Annexin V-FITC标记法定量检测证实阿霉素可诱导细胞凋亡发生;蛋白印迹检测表明阿霉素可使Bax表达升高,Bcl-2和Survivin表达下降。【结论】阿霉素可显著抑制Tca8113细胞增殖,可通过调节Bcl-2、Bax和Survivin蛋白表达来实现致凋亡作用。     

浅蓝菌素在诱导骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡过程中对Bcl-2和Bax的影响

目的研究凋亡蛋白Bcl-2、Bax是否参与浅蓝菌素（Cerulenin）诱发骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡信号传导。方法采用Western—blotting检测Cerulenin作用前、后骨肉瘤细胞株U2—OS中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达变化情况,了解不同的Cerulenin剂量和作用时间骨肉瘤细胞株U2-OS中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达变化情况。结果骨肉瘤细胞株U2-OS中Bcl-2和Bax呈阳性表达,Cerulenin作用细胞株后Bcl-2表达量随着浓度增加和作用时间延长而递减,Bax表达量随着浓度增加和作用时间延长而递增。结论Cerulenin可能通过下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达而诱导骨肉瘤细胞凋亡。     

浅蓝菌素阻遏骨肉瘤细胞增及诱导凋亡的实验研究

目的 探讨脂肪酸合酶(FAS)抑制剂浅蓝菌素能否阻遏人骨肉瘤细胞增殖与诱发凋亡.方法 采用人骨肉瘤细胞系U2-OS,在体外实验中应用噻唑蓝法(MTT法)观察浅蓝菌素对人骨肉瘤细胞U2-OS生长的抑制作用,并通过流式细胞仪对细胞凋亡和细胞周期变化进行检测.结果 U2-OS细胞在浅蓝菌素作用下,细胞增殖被阻遏,并呈现剂量效应关系,2.5、5.0、10.0和20.0 mg/L浅蓝菌素作用24 h的抑制率分别为(18.58±2.49)%、(35.11±3.49)%、(56.60±3.53)%和(79.69±2.83)%,与对照组比较有显著性差异(P<0.05).流式细胞仪显示浅蓝菌素可诱发骨肉瘤细胞发生凋亡并且此作用呈剂量、时间依赖趋势;细胞周期分析浅蓝菌素能阻滞肿瘤细胞从S期进入G2/M期,并诱导其细胞凋亡.结论 浅蓝菌素抑制FAS可阻遏骨肉瘤细胞增殖,其机制可能是诱导细胞发生S期阻滞和细胞凋亡.     

浅蓝菌素阻遏骨肉瘤细胞增殖及诱导凋亡的实验研究

目的探讨脂肪酸合酶（FAS）抑制剂浅蓝菌素能否阻遏人骨肉瘤细胞增殖与诱发凋亡。方法采用人骨肉瘤细胞系U2-OS,在体外实验中应用噻唑蓝法（MTT法）观察浅蓝菌素对人骨肉瘤细胞U2-OS生长的抑制作用,并通过流式细胞仪对细胞凋亡和细胞周期变化进行检测。结果U2-OS细胞在浅蓝菌素作用下,细胞增殖被阻遏,并呈现剂量效应关系,2.5、5.0、10.0和20.0mg/L浅蓝菌素作用24h的抑制率分别为（18.58&#177;2.49）%、（35.11&#177;3.49）%、（56.60&#177;3.53）%和（79.69&#177;2.83）%,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）。流式细胞仪显示浅蓝菌素可诱发骨肉瘤细胞发生凋亡并且此作用呈剂量、时间依赖趋势;细胞周期分析浅蓝菌素能阻滞肿瘤细胞从S期进入G2/M期,并诱导其细胞凋亡。结论浅蓝菌素抑制FAS可阻遏骨肉瘤细胞增殖,其机制可能是诱导细胞发生S期阻滞和细胞凋亡。     

Paclitaxel-induced apoptosis in osteosarcoma cell line U-2 OS

目的：研究紫杉醇对成骨肉瘤细胞系U2-OS的生长抑制及凋亡诱导作用。方法：将不同浓度的紫杉醇作用于成骨肉瘤细胞系U2-OS,应用形态学观察、台盼蓝染色、流式细胞术、电镜、原位末端标记（TUNEL）等方法,检测其诱导骨肉瘤细胞凋亡的时间效应和剂量效应,并与其他化疗药物进行对比。结果：紫杉醇对U2-OS细胞的生长抑制及凋亡诱导作用具有明显的时间依赖性和剂量依赖性。细胞周期分析出现G2/M期阻滞和明显的凋亡峰。形态学检查示核碎裂及染色体凝集的凋亡特征,出现大量多核细胞。经其他化疗药物诱导的U2-OS细胞未出现多核现象。免疫组织化学检测示紫杉醇诱导后细胞核中有广泛DNA断裂。结论：紫杉醇通过抑制骨肉瘤细胞有丝分裂发挥抑制细胞生长及促进细胞凋亡的作用,该作用具有时间依赖和剂量依赖性。     

Flavopiridol联合顺铂对人U2-OS细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨Flavopiridol（FP）联合顺铂（DDP）对人骨肉瘤细胞株（U2-OS）的增殖及凋亡的作用。方法将不同浓度的FP(0、50、100、200、400、1000nmol·L^-1)分别与人U2-OS细胞共同培养24、48h后,采用MTT法检测U2-OS细胞增殖,以确定FP作用48h的半数抑制浓度（IC50）;采用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态学改变;采用流式细胞术测定U2-OS细胞凋亡率。然后将培养后的U2-OS细胞分为4组:空白对照组、单用FP组、单用DDP组、联合用药组（FP+DDP组）,每组设5个复孔,分别加入0.1%DMSO、FP（IC50）、DDP、FP（IC50）+DDP处理,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。结果 FP对人U2-OS细胞的增殖抑制作用呈现浓度依赖性,作用48h的IC50值为340nmol·L^-1,Hoechst33258染色后细胞出现明显的核固缩、核浓聚等凋亡改变,随着FP浓度的增加,流式细胞术检测细胞凋亡率升高。FP+DDP联合作用于人U2-OS细胞,随着时间的增加抑制率逐渐增大（P<0.05）;与FP和DDP单独用药组比较,抑制率、凋亡率及周期阻滞差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 FP可明显抑制人U2-OS细胞增殖并诱导凋亡,联合顺铂对人U2-OS细胞的增殖抑制及凋亡促进具有协同作用。     

氯化锂对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖、凋亡及Fas、Caspase-3 mRNA表达的影响

目的:研究氯化锂(LiCl)对人骨肉瘤细胞U2-OS增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法:以40、80、150mmol/L的LiCl作用于U2-OS细胞24、48和72h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;作用48h后,流式细胞术法检测细胞凋亡率,并分析细胞周期;RT-PCR法检测凋亡相关基因Fas、Caspase-3mRNA的表达。结果:随LiCl作用剂量的增加,U2-OS细胞增殖抑制率增加,细胞凋亡率和Fas、Caspase-3mRNA表达量亦增加(F=61157.480,70.828和418.072,P<0.001);细胞周期分析显示细胞被阻滞于S期(P<0.001)。结论:LiCl可能通过促进凋亡基因Fas、Caspase-3的表达,抑制U2-OS细胞增殖并诱导凋亡。     

BET抑制剂JQ1协同组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA抗骨肉瘤的实验研究

目的探讨溴结构域及外端结构域(BET)抑制剂JQ1联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他(SAHA)抗骨肉瘤的作用及相关分子机制。方法 JQ1单用、SAHA单用及JQ1联合SAHA分别处理骨肉瘤细胞SJSA1和MNNG/HOS后,利用MTT法结合药物协同指数(CI)检测药物对细胞的生长抑制作用并评定协同效果,克隆形成检测生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测相关蛋白表达水平的改变。结果 JQ1联合SAHA协同抑制骨肉瘤细胞系SJSA1和MNNG/HOS生长,克隆形成及流式细胞仪检测证明JQ1联合SAHA能够协同抑制骨肉瘤生长并促进其凋亡,并明显上调Bax、下调Bcl-2蛋白的表达。结论 JQ1联合SAHA能够协同抑制骨肉瘤细胞生长、诱导其凋亡,其中Bax/Bcl-2可能是重要的靶点。     

PARP-1抑制剂对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨PARP-1抑制剂3-aminobenzamide（3-AB）对骨肉瘤U2OS细胞增殖及凋亡的影响。方法常规培养骨肉瘤U2OS细胞,采用CCK-8法检测U2OS细胞的增殖和流式细胞术检测细胞凋亡,并用caspase-3活性测定试剂盒检测caspase-3活性和Western-blot技术检测Bcl-2、Bax的表达。结果 3-AB能抑制骨肉瘤细胞的增殖,且与剂量和时间呈相关性,流式细胞术检测结果显示3-AB能促进骨肉瘤细胞的凋亡,且呈时间相关性,3-AB刺激早期caspase-3活性增高,Western-blot显示3-AB刺激后随时间延长Bax的表达量逐渐升高,而Bcl-2的表达量则轻度升高后降低。结论 PARP-1抑制剂3-AB能抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进其凋亡,这为PARP-1作为骨肉瘤治疗的新靶点提供了初步实验依据。     

hsa-miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及其对细胞凋亡的影响

目的:研究miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS中的过表达对其凋亡的影响。方法:构建pEZX-MR04-pre-miR-30a真核表达载体,瞬时转染人骨肉瘤细胞株U2-OS,荧光显微镜及荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测miRNA-30a在U2-OS中的表达,并采用流式细胞仪检测稳转株细胞的凋亡情况。结果:荧光显微镜下观察真核表达载体pEZX-MR04-pre-miR-30a转染后的U2-OS细胞,可见大量绿色荧光;qRT-PCR检测U2-OS中miR-30a的表达明显提高;流式细胞检测转染后的U2-OS细胞的凋亡明显增加。结论:miR-30a在人骨肉瘤细胞U2-OS过表达能促进其凋亡,miR-30a可能是U2-OS细胞潜在的抑癌基因。     

蛇接骨草提取物对U2-OS细胞增殖及细胞周期的影响

目的 研究蛇接骨草提取物对U2-OS细胞的增殖抑制作用及对U2-OS细胞周期的影响.方法 以 95％乙醇进行提取(提取物简称GPE).MTT法检测GPE对U2-OS细胞的增殖抑制作用,Annexin VFITC凋亡检测试剂盒分析GPE对U2-OS细胞的凋亡诱导作用,流式细胞术分析GPE对U2-OS细胞周期的影响.结果 ...     

抑制miR-30a/HMGA2介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗诱导的细胞凋亡的作用

目的：探讨微小RNA(microRNA,miR)-30a/高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)介导的骨肉瘤细胞自噬对化学药物治疗(以下简称化疗)药物诱导的细胞凋亡的影响。方法：随机选取30例经化疗药物治疗后表现为化疗敏感和化疗抵抗的骨肉瘤患者组织,分为化疗敏感组(n=15)和化疗抵抗组(n=15),采用real-time PCR检测两组中miR-30a和HMGA2的mRNA表达水平,以及骨肉瘤细胞U2-OS经不同浓度的化疗药物(顺铂、阿霉素、氨甲蝶呤)处理后miR-30a的mRNA表达水平;采用蛋白质印迹法检测细胞内自噬相关因子Beclin 1,自噬微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)、自噬抑制因子P62的表达情况。在骨肉瘤细胞U2-OS中转染miR-30a模拟物和抑制剂,构建miR-30a高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况;采用单丹磺酰尸胺(monodansylcada,MDC)染色法检测细胞内自噬水平,ROS荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)检测细胞内ROS水平,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡程度,线粒体膜电位荧光探针JC-1检测细胞线粒体氧化损伤程度;采用双荧光素酶法检测miR-30a与HMGA2的相互作用,同时通过转染HMGA2模拟物和HMGA2-shRNA干扰质粒载体,构建HMGA2高表达组、低表达组和对照组,采用蛋白质印迹法检测经过顺铂和阿霉素处理后上述3组细胞内Beclin 1,LC3B和P62的表达情况。结果：化疗抵抗组中miR-30a的mRNA水平显著低于化疗敏感组(P<0.05),HMGA2的表达与miR-30a相反(均P<0.05)。在相对低浓度(5 μml/L)的化疗药物刺激下,骨肉瘤细胞U2-OS内的miR-30a mRNA表达下调,Beclin 1和LC3B均显著上调(均P<0.01),P62显著下调(P<0.01)。在miR-30a高表达组中,与对照组相比,Beclin 1和LC3B的表达水平与miR-30a明显下降(P<0.05),P62的表达水平明显升高(P<0.05),在miR-30a低表达组中则相反;在经过化疗药物处理后的miR-30a高表达组中,细胞自噬水平更低,细胞存活率更低,ROS水平更高,线粒体氧化损伤程度更高,细胞凋亡水平更高(均P<0.05),miR-30a低表达组则相反(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测验证了miR-30a与HMGA2的靶向互补配对关系;与对照组相比,HMGA2高表达组中Beclin 1和LC3B的表达水平与HMGA2明显升高(P<0.05),P62的表达水平明显下降(P<0.05),在HMGA2低表达组中则相反。结论：积极发挥miR-30a/HMGA2抑制骨肉瘤细胞自噬的功能,能够破坏细胞应对ROS介导的自噬与凋亡的平衡,增强化疗药物对细胞的杀伤作用。     

Influence of β-catenin small interfering RNA on human osteosarcoma cells

This study examined the effect of small interfering RNA-mediated β-catenin knockdown on the survival,invasion and chemosensitivity of human osteosarcoma cells(U2-OS cells).The siRNA against β-catenin was constructed and transfected into U2-OS cells.The expression of β-catenin was detected by qRT-PCR and Western blotting.Cell growth and apoptosis was detected in the presence or absence of doxorubicin by MTT and flow cytometry,respectively.Cell invasion ability was measured by transwell assay.The results showed that the transfection of β-catenin siRNA resulted in decreased expression of β-catenin,suppression of invasion and motility of U2-OS cells,reduced chemosensitivity to doxorubicin in vitro,and little change in cell growth and apoptosis.Additionally,down-regulated MT1-MMP expression was found after transfection.It was concluded that knockdown of β-catenin gene may decrease the invasive ability of human osteosarcoma cells through down-regulated MT1-MMP expression,and the chemosensitivity of osteosarcoma cells against doxorubicin.     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?     

槲皮素联合顺铂对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨槲皮素单独及联合顺铂对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法选取对数生长期的卵巢癌SKOV-3细胞作为研究对象,实验分6组:阴性对照组(生理盐水),槲皮素低(25μmol/L)、中(50μmol/L)、高剂量组(100μmol/L),顺铂组(10μmol/L),联合组(槲皮素50μmol/L+顺铂10μmol/L)。采用MTT法检测不同浓度槲皮素单独及联合顺铂对SKOV-3细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率;免疫细胞化学法检测槲皮素作用于SKOV-3细胞Bcl-2及MtP53蛋白表达水平的变化。结果与阴性对照组相比,槲皮素可明显抑制SKOV-3细胞的增殖,并具有显著的时间和剂量依赖关系,槲皮素高剂量组在72 h的抑制率可达63.49%(P<0.05);流式细胞仪分析发现槲皮素可使G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少(P<0.05),提示其将细胞周期阻滞于G1期;槲皮素还可明显诱导SKOV-3细胞凋亡,高剂量组的凋亡率可达29.51%;槲皮素作用后,Bcl-2及MtP53表达则明显降低(P<0.05)。结论槲皮素在体外可抑制SKOV-3细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,其机制可能与降低凋亡相关蛋白MtP53和Bcl-2的蛋白表达水平有关;槲皮素与顺铂联用有协同作用。     

小剂量氨甲蝶呤联合GM-CSF对U973细胞的诱导分化作用

目的 通过体外诱导分化相关的研究，探讨氨甲蝶呤(MTX)对急性单个核细胞性白血病的疗效。方法 以U937细胞株为实验模型，以细胞形态学、NBT还原试验及流式细胞CD14检测为评价U937细胞分化的指标，采用TRAP-ELISA试剂盒检测端粒酶活性。结果 经20nmol／L MTX作用24、48、72h后，U937细胞体积明显增大，核／浆比例逐渐减少；NBT还原试验逐渐呈现阳性；培养72h后，CD14阳性细胞从3％上升到20％，提示出现部分分化。单用100u／mL粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并未使u937细胞产生诱导分化作用，但当此剂量的GM-CSF与20nmol／LMTX同时作用于U937细胞72h后，63％的细胞出现诱导分化现象。MTX和GM-CSF同时作用24、48、72h后，端粒酶活性从2．11(未用药前)下降到1．48、0．77和0．24。结论 小剂量MTx与GM-CSF联合应用对U937细胞系有明显诱导分化作用，有望为急性单个核细胞性白血病的治疗提供新途径。