c—erbB—2特异性核酶基因体外转录载体的构建与快速鉴定

构建ｃ－ｅｒｂＢ－２特异性的核酶基因及其靶基因的体外转录载体并探讨快速简便的筛选方法；在原设计的核酶ＲＺ１基因的３‘端加上新的限制性酶切位点ＥｃｐＲＶ，合成修饰后的ＲＺ１基因并将之定向克隆于载体ｐＧＥＭ３Ｚｆ，经用ＥｃｏＲＶ正筛选和ＸｂａＩ负筛选鉴定出重组子并测定鉴定。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

“分子搭桥术”基因治疗闭塞性血管病的实验研究

目的 应用血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因治疗实验性闭塞性外周血管病。方法构建重组ＶＥＧＦ１６５基因的真核表达载体，其上游含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子；通过基因缝线，向一侧髂外动脉结扎引起血管闭塞症大鼠的肌肉内转移ＶＥＧＦ基因（２００μｇ／只）；应用逆转录－聚合酶链反应，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ以及免疫组织化学方法观察ＶＥＧＦ基因的表达，并通过血管造影技术观察ＶＥＧＦ基因导入大鼠体内的生物效应。结果转ｐｃＤＮＡ３／ＶＥＧＦ基因７天后，肌肉组织内ＶＥＧＦｍＲＮＡ及其表达产物明显高于对照组单纯转ｐｃＤＮＡ３组；血管造影可见大量新生血管和侧支循环的形成，在１４天和３０天时更明显，转ＶＥＧＦ基因可以明显促进闭塞性下肢血流的恢复和改善组织坏死的程度。结论肌肉内转移ＶＥＧＦ基因，通过促进血管新生和侧支循环建立，促进血流恢复，为闭塞性血管病的治疗，提供一种新的可能性──分子搭桥术。     

人VEGFcDNA的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

利用ＰＣＲ技术从人胎肝扩增并克隆人ＶＥＧＦ（血管内皮生长因子）的ｃＤＮＡ，构建其天然蛋白高效表达载体ｐＫＰＬ－３ｂ－ＶＥＧＦ，利用这一载体在大肠杆菌中获得人ＶＥＧＦ蛋白的高效表达，表达产物占细菌总蛋白的３０％以上。     

抗人TGFα发夹状核酶基因逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

构建抗和ＴＧＦα核酶基因逆转录病毒表达载体。方法；用二异丙基亚磷酰胺法合成抗人ＴＧＦα核酶基因的两条互补单链，将其退火后克隆ｐＵＣ１８，用ＥｃｏＲＩ及ＢａｍＨＩ切下该基因，定向克隆人逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲ。结果；酶切后经琼脂糖凝主聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，所构建重组克隆载体ｐＵＣ１８ＴＲＺ及重组表达载体ｐＤＯＲＴＲＺ正确。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

抑癌基因MTS1真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系HO-8910中的表达

目的：构建多肿瘤抑制基因１（ＭＴＳ１）的真核表达载体,将其转入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中,并得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞的影响奠定实验基础．方法：利用ＢａｍＨⅠ与ＥｃｏＲⅠ从ｐＵＣ１９－ｐ１６质粒上切下ＭＴＳ１ｃＤＮＡ片段并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,构建成ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６;利用脂质体（Ｆｕ－ＧＥＮＥＴＭ６）介导的基因导入法将ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６导入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中;采用ＡＢＣ法对转染后的不同代数细胞进行免疫细胞化学检测,观察ｐ１６蛋白的表达．结果：成功构建了ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并进行酶切鉴定;转染后经Ｇ４１８筛选２ｗｋ出现阳性克隆８９１０－ｐ１６,并检测到其中有ｐ１６蛋白的稳定表达．结论：成功构建ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并可在人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中得到稳定表达．     

切割bcl—2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体，方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位上的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓ ａｎｇｅｒ以脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应，ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中，结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ     

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

构建ＨＢＶ核心抗原ＤＮＡ疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法：采用ＰＣＲ法从ＨＢＶ全基因ＤＮＡ中获得核心抗原ＤＮＡ片段,并将其重组到ｐｃＤＮＡ３载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ｊｕ,并检测其抗ＨＢｃＩｇＧ。结果：构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＢｃ。免疫接种该疫苗后第２周抗ＨＢｃＩｇＧ水平开始升高,小鼠至第９周,树Ｊｕ至第７周升至峰值。结论：构建ｐｃＤＮＡ３－ＨＢＣｄ     

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体，为细胞内合成ＲＺ提供了手段     

Bcr—abl特异性系列核酶体外切割活性比较及诱导K562细胞凋亡？…

构建单、双及三单位核酶、鉴定其体外切割活性及对Ｋ５６２生物学特性的影响,探讨核酶用于基因治疗的前景。方法首先针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点设计并合成３个单核酶,耐后通过基因重组构建单、双及三核酶载体,以体外切试验鉴定并比较其活性。     

Construction and identification of a retroviral vector of bcl-2 mRNA-cleaving ribozyme gene

Ribozyme(RZ)isanRNAwithenzymeactivity.ThediscoveryofRZprovidedanotherspecificmethodforgenetherapy.VariousspecificRZsweredesignedtoblocktheexpressionofharmufulgenes,basedonthetrans--cleavingactivityofRZ.hcf--2isoneoftheapoptosisrelatedoncogenesL'],whichrenderthecellresistanttoX--ray['jandchemotherapyL',#j.hcf--2cansuppresstheprogrammedcelldeathorapoptosisofcentralnervoussystemandplaysacertainroleinimmunogenesisandneurogenesis['].AccordingtoHaseloff'smodelofribozyme,ageneofhammarheadRZ,wh…     

针对bcl─2RNA核酶体外切割反应的琼脂糖凝胶电泳

目的：用琼脂糖凝胶电泳检测体外ｂｃｌ┐２ｃＤＮＡ和ＲＺＤＮＡ转录物与鉴定核酸的体外切割活性．方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳．结果：琼脂糖凝胶电泳可见核酶和ｂｃｌ－２ＲＮＡ转录物及其切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ后的产物．结论：琼脂糖凝胶电泳是一种可用于外转录物与初步鉴定核酸切割活性的简便方法     

c-myc基因核酶对靶mRNA的切割作用

目的：构建c—myc基因核酶及其靶mRNA的体外转录载体，探讨核酶对靶mRNA的体外切割作用。方法：通过计算机分析c—myc基因mRNA的二级结构，设计核酶基因序列，采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf( )体外转录载体，将大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段克隆入pGEM7Zf(-)体外转录载体，分别进行体外转录获得核酶及靶mRNA。在含有Mg^2 的反应体系中，进行核酶对靶mRNA的体外切割反应。结果：经限制性内切酶酶切鉴定，核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，经DNA自动序列分析仪测序分析，大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段准确克隆入pGEM7Zf(-)载体。核酶对靶mRNA的体外切割活性约为64．5％。结论：该核酶具有切割靶mRNA的活性，可进一步用于细胞内和体内研究。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

利用核酶技术下调人胆管癌细胞bcl-2表达水平

目的 研究切割bcl-2mRNA核酶降低人胆管癌细胞bcl-2表达水平的作用。方法 将合成的切割bcl-2 mR—NA核酶基因与真核细胞表达载体重组，并用重组后的载体转染人胆管癌细胞，通过免疫细胞化学、流式细胞仪等手段，观察转染后的胆管癌细胞bcl-2的表达水平。结果 转染切割bcl-2mRNA核酶基因的胆管癌细胞内bcl-2的表达水平较对照组明显下降；部分细胞出现自发性凋亡现象。结论 切割bcl—2mRNA核酶可明显降低胆管癌细胞内bcl-2的表达水平，并能够诱导其出现自发性凋亡。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.