ataxin-3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选ataxin-3的相互作用蛋白并进行互作结构域分析，探讨ataxin-3的功能和脊髓小脑型共济失调Ⅲ型／马查多-约瑟夫病的发病机理。方法应用酵母双杂交系统3，从成人脑eDNA文库中筛选和鉴定突变型ataxin-3的互作蛋白，构建ataxin-3蛋白羧基端Bait质粒，进行互作结构域分析。应用激光共聚焦显微镜观察ataxin-3与所筛到的互作蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果分离获得5个新的ataxin-3互作蛋白，视紫红质-二磷酸鸟苷解离抑制因子α、苏素-1、氨氯吡嗪脒敏感性神经元阳离子通道2和2个未知新序列。结构域分析显示除1个未知蛋白与ataxin-3蛋白羧基端互作外，其余4个均与氨基端互作。在SH-SY5Y细胞的细胞核内，野生型ataxin-3与苏素-1共定位，突变型ataxin-3所形成的核内蛋白聚合体也与苏素-1共定位。结论 发现1个未知蛋白可能与ataxin-3蛋白羧基端互作，苏素1可能与ataxin-3蛋白氨基端互作，苏素化可能参与了ataxin-3蛋白的翻译后修饰和脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病的发病过程。     

siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的 构建人MEKK3基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株.方法 设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamH Ⅰ及Hind Ⅲ酶切位点分别克隆入pSilencer 4.1-CMV hygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染人A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制.结果 测序鉴定表明4个MEKK3 siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制率达84%;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2可稳定沉默MEKK3 mRNA的表达,有效率达83%.结论 成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株.     

HeLa细胞中miRNA-214靶基因Mek3的确定

目的 探索miRNA-214在HeLa细胞中的与其靶基因Mek3相互作用.方法 通过miRNA靶基因预测网站寻找可能与miRNA-214相互作用的靶基因,合成miRNA-214和对照序列,将miRNA-214、对照序列、Mek3的3'非翻译区(3' UTR)以及突变的Mek3 3'UTR分别克隆到表达载体上,转染HeLa细胞,转染48 h后提取蛋白,检测绿色荧光蛋白的表达水平; HeLa细胞转染miRNA-214后,Trizol抽提RNA,通过荧光定量PCR检测Mek3 mRNA的表达水平;Western印迹检测Mek3的蛋白表达水平.经过以上实验从mRNA和蛋白水平上验证了在HeLa细胞中miRNA-214对靶基因Mek3的作用效应.结果 生物信息学方法显示miRNA-214和Mek3存在可能的结合位点.经过实验验证了miRNA-214可以下调Mek3的mRNA和蛋白水平.结论 miRNA-214可以负调节靶基因Mek3的表达.     

人TRAF3IP3基因的克隆及真核表达

目的 构建人肿瘤坏死因子受体相关因子3相互作用蛋白3(TRAF3IP3)基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法 RT-PCR扩增获得TRAF3IP3开放读码框区基因,双酶切连入真核表达载体pIRES2-EGFP,双酶切和测序鉴定阳性克隆;重组质粒磷酸钙法转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot法鉴定TRAF3IP3基因的表达情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,成功构建了TRAF3IP3真核表达质粒,荧光显微镜观察可见转染了重组质粒的HEK293细胞有绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot结果证实TRAF3IP3蛋白高水平表达.结论 成功构建了pIRES-EGFP-TRAF3IP3真核表达质粒,为TRAF3IP3基因功能的研究奠定了基础.     

激活素受体相互作用蛋白3的基因克隆及其免疫学特性研究

目的：研究新克隆的激活素受体相互作用蛋白3（ActRIP3）的免疫学特性和其介导Ser／Thr激酶型受体胞内信号传导的作用。方法：以酵母双杂交法发现的ActRIP基因片段作为探针，从小鼠脑cDNA文库中克隆ActRIP3基因。EIA法分析其与激活素ⅡA型受体（ActRⅡA）结合能力，Westernblot杂交检测成熟蛋白在组织中的表达，免疫组化染色分析其在脑组织中的分布，采用pcDNA-AetRIP3与CAGA-1ux报告基因质粒共转染HEK293细胞分析信号传导作用。结果：克隆的ActRIP3基因全长1197bp，编码101个氨基酸残基，EIA分析显示ActRIP3与ActRⅡA具有特异性结合作用，这种作用与ActRIP3的N末端氨基酸序列有关。Westernblot杂交显示天然ActRIP3相对分子质量约为14000，在多种组织表达，免疫组化染色显示其在脑组织中的分布以海马及下丘脑为主。通过表达ActRIP3可促进激活索诱导的特异性基因转录活性。结论：ActRIP3属于ActRIP家族新成员，具有特异结合ActRⅡA的能力，并具有促进激活素信号传导的作用。     

脊髓小脑共济失调3型致病蛋白ataxin-3毒性损伤机制

脊髓小脑共济失调3型是我国常见的三核苷酸序列异常扩增导致的常染色体显性遗传疾病。其致病蛋白ataxin-3具有泛素结合蛋白功能，调节细胞蛋白质稳态；同时ataxin-3蛋白功能可能还与细胞骨架等相关。异常扩展突变的ataxin-3有聚集倾向，在细胞内募集多种蛋白成分形成蛋白聚集体或包涵体，导致基因转录异常、蛋白稳态失衡、能量代谢障碍、运输障碍等多种细胞功能损伤以致细胞凋亡，进而影响细胞功能而致病。结合目前对多聚谷氨酸异常扩展突变疾病的研究现状，此文就现有的脊髓小脑共济失调3型致病机制进行综述。     

ErbB-3结合蛋白Ebp1对NIH3T3细胞生长增殖的影响

目的：探讨erbB-3结合蛋白Ebp1对NIH3T3细胞生长增殖的影响。方法：将真核表达质粒pEGFP—C1和Ebpl基因经双酶切后用T4连接酶连接，并经鉴定序列正确后，用脂质体转染剂Lipofectin Reagent稳定转染NIH3T3细胞，免疫细胞化学显色，在激光共聚焦扫描显微镜下观察Ebp1蛋白的表达和定位；通过平板集落形成率观察细胞生长增殖能力的改变。结果：重组质粒鉴定正确，成功构建Ebp1稳定表达的NIH3T3细胞系，并存显微镜下可见绿色荧光，免疫细胞化学显色可见Ebp1蛋白表达；转染目的基因的细胞克隆形成率明显升高。结论：成功构建Ebp1稳定表达细胞系，Ebp1融合蛋白表达于胞质，呈不均匀颗粒状、环状分布；Ebp1在体外能增强NIH3T3细胞生长增殖。     

人NKX3.1基因启动子的克隆及在不同肿瘤细胞系中启动子活性的测定(英)

目的：克隆NKX3.1基因启动子并检测其启动子活性，为研究NKX3.1 基因转录调控的基本机制奠定基础。 方法： 采用PCR方法从人基因组中扩增NKX3.1基因上游 1.04 kb 启动子片段并分别克隆到报道基因载体pGL3-basic和 pEGFP-1中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测其启动子活性。 结果： DNA测序结果证实克隆的 1.04 kb 启动子片段序列正确；pGL3-1.04 kb 启动子转染LNCaP细胞后，双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7, 为pGL3-control 活性的1.5倍，为pGL3-basic活性的50倍。表明克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性。为检测此 1.04 kb 启动子在不同组织细胞中的活性，分别将pGL3-1.04 kb 启动子和pEGFP-1.04 kb启动子转染入不同的肿瘤细胞系，检测荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达。结果显示 1.04 kb 启动子在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。采用TRANSFAC数据库分析，发现在 1 040 bp 片段内含有多种顺式作用元件，它们的功能性将需要进一步实验证明。 结论： 克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性，并且在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。     

体外培养的牛角膜内皮细胞氯离子通道-3分子的检测

目的检测氯离子通道蛋白3(chloride channel 3,ClC-3)在体外培养的牛角膜内皮细胞(bovine corneal endothelial cell,BCECs)k中的表达和定位。方法应用免疫荧光法测定ClC-3在体外培养BCECs的所在部位,RT-PCR和Wester印迹法检测ClC-3mRNA和蛋白的表达。结果在体外培养的BCECs,RT-PCR可以扩增出长度为602bp的ClC-3的cDNA产物。Western印迹可见到约85ku的发光条带,细胞膜和部分细胞浆可见到ClC-3的表达。结论体外培养的BCECs在转录和翻译水平均有内源性ClC-3基因表达,表达产物存在定位于细胞膜和内质网部分细胞浆。     

6q25区域内一个新基因MTLC的克隆及特性分析

目的：克隆6q25区域内喉癌相关新基因。方法：以表达序列标签为电子探针，在人类基因组数据库中进行电子杂交，钓出相就基因组DNA克隆后进行基因预测。根据获得的基因序列设计引物，逆转录－聚合酶链反应扩增新基因cDNA。结果：克隆了1个6q25区域内的新基因。该基因全长约21kb，含两个外显子，其cDNA序列长1006bp，编码蛋白包括235个氨基酸。其5’侧翼序列存在癌蛋白c-Myc的结合位点，将其命名为MTLC（c-Myc target from laryngeal cancer cells）基因。同源性分析表明该基因编码蛋白与小鼠MT－MC1蛋白同源性达78％。MTLC蛋白一级结构含有一个核定位信号结构域，亚细胞定位实验证实该基因主要在细胞核表达，Northern印迹分析表明MTLC基因在心肌、肝、肾、脑等多个组织有表达。结论：成功克隆了1个新基因MTLC，该基因可能作为c-Myc的靶基因以转录因子形式参与维持细胞正常生理功能。     

14－3－3蛋白的新认识

14-3-3蛋白是一个在真核生物中广泛表达的高度保守的酸性蛋白家族,主要以同源/异源二聚体形式存在,在哺乳动物中由7种亚型组成。7种不同亚型的14-3-3蛋白在人类细胞中发挥着重要作用。本文就14-3-3蛋白的序列保守性和独特性、结构特征、结合靶点、调控机制以及作为潜在药物治疗靶点的相关研究进展做一综述。     

蛋白14-3-3蛋白亚型与癌症

14-3-3蛋白家族在真核细胞中广泛表达且高度保守,据报道其与心血管疾病、神经元损伤、帕金森病以及支气管哮喘等疾病有关联,近年来研究发现14-3-3蛋白与癌症的发生和发展也密切相关,而涉及的癌症包括胆管癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、口腔癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、卡波济肉瘤、脑膜癌、直肠癌、星形细胞瘤等几乎所有常见癌症。14-3-3蛋白对癌症增殖、转移、凋亡以及耐药等影响作用已经得到证实,其调控机制也得到部分揭示,并且已合成了影响14-3-3蛋白与其他蛋白相互作用的特异小分子阻断药物。人体内的14-3-3蛋白家族包含β,ε,γ,η,θ(τ),ζ和σ7种亚型,不同亚型有不同的组织定位和功能。阐明各亚型在不同肿瘤中的分布、作用及其调控机制,对我们进一步认识和治疗癌症均有一定的指导意义。     

14-3-3ζ Facilitates GSK3β-catalyzed tau phosphorylation in HEK-293 cells by a mechanism that requires phosphorylation of GSK3β on Ser

Hyperphosphorylated tau is the prominent component of paired helical filaments, which are the major component of neurofibrillary tangles associated with Alzheimer's disease (AD). Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) is implicated to phosphorylate tau in normal and AD brain. Previously, we isolated a large multiprotein complex containing tau, Ser⁹-phosphorylated GSK3β and 14-3-3ζ from bovine brain microtubules. We showed that within the complex, 14-3-3ζ binds to tau and GSK3β and mediates GSK3β-catalyzed tau phosphorylation. A recent report however indicated that 14-3-3ζ does not bind to tau or GSK3β and does not increase tau phosphorylation by GSK3β in cell models [T.A. Matthews, G.V.W. Johnson, Neurosci. Lett. 384 (2005) 211–216]. In the current study we have thoroughly analyzed the binding of 14-3-3ζ with tau and GSK3β and evaluated the effect of 14-3-3ζ on tau phosphorylation by GSK3β in HEK-293 cells. We found that 14-3-3ζ binds to tau and Ser⁹-phosphorylated GSK3β. Nonphosphorylated GSK3β phosphorylates tau without being influenced by 14-3-3ζ. Ser⁹-phosphorylated GSK3β on the other hand phosphorylates tau significantly only in the presence of 14-3-3ζ. Our data demonstrate that 14-3-3ζ mediates tau phosphorylation by Ser⁹-phosphorylated GSK3β in HEK-293 cells.     

小鼠脑14-3-3蛋白ζ亚型cDNA克隆及其原核表达分析

14-3-3是一类脑中丰富存在的蛋白质。在许多神经疾病患者的脑脊液中含量升高。最近的研究显示该蛋白相关于Parkinson病的病理过程。本研究采用RT-PCR法从小鼠脑中分离出编码14-3-3ζ亚型的cDNA片段,构建了基因重组质粒,分析了14-3-3ζ亚型cDNA在原核细胞中的表达并制备了基因重组蛋白。结果显示,RT-PCR扩增产物为738bp,编码245个氨基酸。重组质粒在原核细胞中的表达受IPTG诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量为32kD,在Su-perdexS-200HR中的表观分子量为96kD。每升菌液可收获目的蛋白4.0mg。研究结果提示,14-3-3ζ亚型cDNA在原核细胞中高水平表达,基因重组蛋白易纯化可用于制备抗体和研究其生理功能。     

氢氧化钠对红细胞膜带Ⅲ蛋白作用的研究

本实验以红细胞膜带Ⅲ蛋白Ｃ１（Ａｌａ Ｓ９３－Ｖａｌ ９１１）及ＫＳ－２（Ｓｅｒ ７３１－Ｋｙｓ ７４３）／肽链的释放量为指标，研究了不同浓度的氢氧化钠对带Ⅲ蛋白的影响。结果证明随着氢氧化钠浓度的升高多肽的释放量明显增多，用１００ｍＭ ＮａＯＨ预处理红细胞膜，再用胰蛋白酶消化，对从红细胞膜释放的多肽进行了氨基酸测序分析。     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在大肠杆菌中的表达

目的　获取具备免疫反应原性的庚型肝炎病毒ＮＳ３ 抗原。方法　从重组质粒Ｉｗｑ２利用ＰＣＲ 反应扩增出ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段,克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸ ＨＴａ 后进行核苷酸序列测定,待鉴定正确后经ＩＰＴＧ 诱导重组工程菌,用ＳＤＳＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 对重组蛋白进行鉴定。结果　酶切鉴定和核苷酸序列测定结果表明成功地构建了重组工程菌ｐＨＴＮＳ３／ ＤＨ５α且克隆的基因片段为ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析诱导表达产物发现在相对分子质量约４３ ８１０处有一条明显的蛋白表达带,占菌体总量的１７ ．７ ％ 。用ＮｉＮＴＡ 亲和层析柱快捷地获得了纯化的重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定发现重组蛋白可与ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＲＮＡ 阳性病人血清发生抗原抗体反应。结论　获得了具备免疫反应原性的ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 抗原,该重组蛋白可用于ＧＢＶＣ／ＨＧＶ 感染的检测。     

CTRP3下调炎症因子表达改善胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性

 目的:观察脂肪因子C1q/TNF相关蛋白3（CTRP3）对胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的效应及机制。方法:通过软脂酸培养构建3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型,以不同浓度重组CTRP3蛋白（10、50、250、1 250 μg/L）干预12 h,以及250 μg/L CTRP3干预不同时间（2、6、12、24 h）,以葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖消耗量,以2-脱氧-［3H］-葡萄糖摄入法检测葡萄糖转运率,以酶联免疫吸附（ELISA）法检测上清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）及白细胞介素6（IL-6）的含量,以荧光实时定量PCR（real-time PCR）检测TNF-α、IL-6及葡萄糖转运子4（GLUT-4）的mRNA表达水平,以Western blotting检测GLUT-4蛋白表达水平。结果:与正常对照组（NC）相比,胰岛素抵抗组（IR）葡萄糖摄取率及葡萄糖消耗量分别降低了50.6%及57.9%（均P<0.01）;与IR组相比,干预组随CTRP3浓度增加,葡萄糖消耗量分别增加22.1%、42.9%、76.6%及80.5%（均P<0.01）,葡萄糖摄取率分别增加39.0%、68.0%、108.0%及111.0%（均P<0.01）;250 μg/L CTRP3干预时间增加,葡萄糖摄取率分别增加23.0%、79.0%、 109.0%及114.0%（均P<0.01）;250 μg/L CTRP3干预12 h,上清中的TNF-α及IL-6浓度分别降低了17.4%及17.1%（均P<0.01）,其mRNA相对表达量分别下降了26.0%及18.9%（均P<0.01）,而GLUT-4 mRNA及蛋白相对表达量分别增加了61.5%及55.6%（均P<0.01）。结论: CTRP3具有改善胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的作用,其机制可能与下调炎症因子表达、改善胰岛素信号转导和增加葡萄糖转运子表达等有关。     

3-硝基丙酸预处理对脑缺血耐受模型GLUT1和GLUT3表达的影响

目的: 探讨3-硝基丙酸(3-NPA)预处理对大鼠局灶性脑缺血半暗带区不同再灌注时点GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白水平表达的影响。方法: 雄性SD大鼠40只,随机分为假手术组(sham组,n=4)、预处理对照组(3-NPA组,n=4)、大脑中动脉缺血组(M组,n=16)、3-NPA 预处理组(IPC组,n=16)。M组和IPC组按再灌注时间(4 h、12 h、24 h及48 h)不同又分为4个亚组,每组动物4只。将大鼠在相应时点断头取脑,取缺血侧(左侧)冠状面中间1/3皮质,分别采用RT-PCR和Western blotting方法检测GLUT1、GLUT3 mRNA和蛋白水平表达情况。结果: IPC组GLUT1 mRNA表达在缺血再灌注后4 h开始升高,48 h最大,显著高于sham组和M组相应时点。IPC组GLUT3 mRNA表达在24 h增高,48 h最高,与M组相应时点24 h、48 h及sham组比较显著增高。IPC组比M组的GLUT1蛋白、GLUT3蛋白表达增高,有显著差异(F=5.848,P<0.05;F=6.295,P<0.05),尤以缺血再灌注后48 h两者差异最明显。结论: 3-NPA预处理能诱导脑缺血耐受,其机制可能是上调GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白表达水平,维持脑组织的能量供给。     

腺病毒3型诱导MxA蛋白产生及其抗病毒作用的研究

目的:观察腺病毒3型对MxA蛋白的诱导作用以及MxA蛋白的体外抗病毒作用。方法:采用流式细胞仪分析不同浓度的腺病毒3型（Ad3）诱导健康人外周血单个核细胞（PBMC）胞浆MxA蛋白的产生;采用微量细胞病变抑制法观察重组MxA蛋白对Hela细胞内腺病毒3型的抗病毒作用。结果:不同浓度的腺病毒诱异PBMC产生MxA蛋白的含量均显著高于对照组。10 ng/ml MxA蛋白质抗Hela细胞内腺病毒3型感染的效价为20TCID20。结论:腺病毒3型体外可诱导PBMC产生MxA蛋白;重组MxA蛋白具有抗腺病毒3型作用。