兔口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法

目的 培养兔口腔黏膜上皮细胞,建立稳定的口腔黏膜上皮细胞体外培养体系. 方法 取兔口腔黏膜组织,用0.25%中性蛋白酶(DispaseⅡ)分离上皮与皮下组织,采用无血清及无3T3细胞培养体系,即角质细胞培养液(Defined K-SFM)培养兔口腔黏膜上皮细胞,并进行形态学观察及免疫细胞化学检测. 结果 用中性蛋白酶可成功分离上皮与皮下组织,原代培养11 d细胞可融合成片,呈铺路石样,鉴定为单一口腔黏膜上皮细胞. 结论 利用角质细胞培养液可成功培养出兔口腔黏膜上皮细胞.     

In-vitro cultivation of normal human oral keratinocytes

目的　建立一个稳定的人正常口腔粘膜角化细胞体外培养体系。方法　取正常口腔粘膜 ,经dispase及胰蛋白酶消化获取细胞 ,采用无血清培养液进行原代及传代培养 ,并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等一系列细胞定性研究。结果　获取的细胞为单一上皮细胞 ;细胞可连续传 4 - 5代 ,成活 30 - 5 0天 ;细胞呈铺路石状 ,为上皮细胞的典型形态 ;电镜下见细胞具有丰富的张力丝和桥粒等特征性超微结构 ;角蛋白免疫组化染色阳性。结论　应用dispase酶及无血清培养液 ,在无 3T3细胞的条件下可成功进行人正常口腔粘膜角化细胞连续传代培养。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的 :探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法 :采用美国DispaseⅡ试剂获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞 ,将其种植在PLGA膜上 ,通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果 :采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层 ,通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞 ,将其植入PLAG膜上 ,细胞获得很快生长 ,5d时细胞出现分化 ,8d时可以长到 5层左右。结论 :本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞 ,获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PLAG膜上可获得良好的生长。     

人口腔黏膜上皮细胞的培养及其在PLGA膜上生长的初步实验

目的：探讨人口腔黏膜上皮细胞的原代培养和体外生长方法。方法：采用美国DispaseⅡ试削获取人体正常口腔黏膜上皮的原代细胞，将其种植在PLGA膜上，通过光学显微镜形态学检查、扫描电镜和免疫组织化学进行细胞定性。结果：采用DispaseⅡ可成功地分离出口腔黏膜上皮层和上皮下层，通过进一步处理后可获取口腔黏膜上皮细胞的原代细胞，将其植入PLAG膜上，细胞获得很快生长，5d时细胞出现分化，8d时可以长到5层左右。结论：本方法可较好地获取口腔黏膜原代细胞，获取的口腔黏膜原代上皮细胞种植在PIAG膜上可获得良好的生长。     

藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响

目的 探讨藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响.方法 DispaseⅡ及胰酶消化法原代培养人口腔黏膜上皮细胞,传代后HE染色,光镜下进行形态学观察.免疫组织化学抗角蛋白抗体染色,进行来源鉴定.取第二代培养细胞,随机分为4个实验组和1个对照组.制备藓化饮药液,实验组分别加入经无血清培基稀释为104、105、5×105、106μg/L 4个浓度梯度的藓化饮液继续培养;对照组只加无血清培基继续培养.甲基噻唑基四唑法测定培养细胞的增殖活性.结果 原代培养的人口腔黏膜上皮细胞呈扁平椭圆形或多角形,胞核清晰.细胞抗角蛋白抗体染色阳性.藓化饮在105μg/L浓度下增殖活性吸光度值明显高于其他浓度组和对照组(P＜0.05).而在104μg/L、5×105μg/L、106μg/L浓度下增殖活性吸光度值虽高于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 使用无血清培养基可成功进行人口腔黏膜上皮细胞原代培养及传代培养.藓化饮在浓度为105μg/L下能明显增强体外培养的人口腔黏膜上皮细胞的增殖活性.     

人扁桃体隐窝上皮细胞的分离、原代培养与鉴定

目的：建立高效、稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代培养方法。方法：收集80例3~5岁儿童手术切除的扁桃体组织,分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法提取扁桃体隐窝上皮细胞并比较两种方法的提取效果;应用无血清角化细胞培养基进行细胞纯化及原代培养;用相差显微镜观察细胞形态和生长特点、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞来源。结果：Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法在分离扁桃体隐窝上皮细胞成功率、细胞密度以及细胞融合时间方面均高于组织块贴壁法（P < 0.05）,细胞接种后第2天开始贴壁,外观呈现多边形,岛状生长,培养12 d左右,细胞连成单层,呈现铺路石样生长。免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性,波形蛋白阴性;免疫荧光鉴定角蛋白8/18染色阳性。结论：应用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰蛋白酶?EDTA消化法以及无血清角化细胞培养基可建立高效稳定的人扁桃体隐窝上皮细胞原代分离方法和体外培养体系。     

牙源性角化囊性瘤上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:建立牙源性角化囊性瘤上皮细胞体外培养体系并进行初步鉴定.方法:采用组织块及酶消化法原代培养牙源性角化囊性瘤上皮细胞,以无血清的角化上皮细胞培养基进行体外连续培养,并行细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定.结果:体外培养的牙源性角化囊性瘤上皮细胞为多角形,胞浆均匀,轮廓清晰,表现上皮细胞特有的铺路石样外观,体外可传2～4代,生长周期约30～50 d.经波形丝蛋白、广谱角蛋白及角蛋白10、角蛋白14免疫组化染色证实,分离培养的细胞为上皮来源,无间充质细胞混杂.结论:采用无血清的角化细胞培养基可在体外进行牙源性角化囊性瘤上皮细胞的连续培养.     

体外培养口腔粘膜白斑上皮细胞

目的：建立稳定的人口腔粘膜白宽上皮细胞体外培养体系。方法：用离解蛋白酶（DispaseⅡ）分离上皮及皮下组织。采用改良的无血清及无3T3细胞的培养体系培养口腔粘膜白斑上皮细胞。结果：用DispaseⅡ可成功分离上皮和皮下组织。细胞生长曲线显示改良无血清角化细胞培养液（Defined K-SFM）可明显促进口腔粘膜白斑上皮细胞的分裂增殖。此实验上皮细胞可传6～7代。结论：Defined K-SFM可显著促进口腔粘膜白斑上皮细胞的分裂和成熟,为癌前病变研究提供足够寿命的体外细胞。     

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。     

组织工程化口腔粘膜的构建技术初步研究

目的　探索组织工程化口腔粘膜的构建方法。方法　用 Dispase中性蛋白酶分离提取未长毛的 SD乳鼠硬腭口腔粘膜细胞 ,用角化细胞培养液对口腔粘膜细胞进行培养 ,以自制藻酸钠薄膜作为支架材料构建组织工程化的口腔粘膜。结果　 Dispase中性蛋白酶可较好地分离提纯口腔粘膜细胞 ,用 Dispase消化酶分离获取上皮后 ,再用胰蛋白酶消化上皮为单细胞的最佳时间为 10 m in,过低的细胞密度不易形成克隆 ,鼠口腔粘膜细胞培养的最适密度为 1.5× 10 5/ cm2 。角化细胞培养液能对鼠口腔粘膜细胞进行培养 ,且没有成纤维细胞污染 ;口腔粘膜细胞在藻酸钠薄膜上生长良好。结论　利用角化细胞培养液作为培养基 ,藻酸钠薄膜作为支架材料可成功构建组织工程化口腔粘膜     

Preliminary study on Herpes simplex virus type 1 infection of human oral epithelial cell in vitro

Objective： To explore the functions and mechanisms of herpes simplex virus type I（HSV-1） while infecting human oral epithelial cells in vitro（being similar to the infection in vivo）. Methods：An abundance of HSV-1 strains amplified in Vero cells were used to infect human oral epithelial cells. The culture supernatant was collected to infect Vero cells again. Morphology of HSV-1 was identified by inverted microscope and transmission electron microscope. Nucleic acid of the virus was detected by PCR. Results：The infected human oral epithelial cells didn＇ t display an obvious cytopathic effect（CPE） under inverted microscope（while Vero cells which were infected by the culture supernatant showed typical（CPE）. The virus particles were not observed in the cytoplasm nor in nucleus of human oral epithelial cells, however under transmission electron microscope in the cytoplasm of Vero cells, the nucleic acid of HSV-1 could be detected in infected human oral epithelial cells, by PCR. Conclusion-HSV-1 can successfully infect human oral epithelial cells. This model may provide a useful approach for studying the pathogenesis of herpes virus-associated periodontal disease.     

兔口腔黏膜细胞与灭活的3T3成纤维细胞的体外共培养

目的探讨口腔黏膜细胞的培养方法,为进一步以口腔黏膜细胞为种子细胞构建组织工程化尿道提供实验依据。方法体外分离口腔黏膜细胞,取部分细胞与经丝裂霉素灭活的3T3成纤维细胞进行共培养(共培养组),定期观察细胞形态变化及生长增殖情况。以非共培养的口腔黏膜细胞作为对照(非共培养组)。同时,对体外培养获得的口腔黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)和K19免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代共培养组细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比。结果共培养组口腔黏膜细胞,呈现典型的"铺路石"状,细胞形态均一,可传代至7~8代。非共培养组口腔黏膜细胞则形态多样,传至第2代时,即开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱。免疫荧光染色显示,体外培养获得的口腔黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性,40%细胞K19染色阳性。流式细胞仪检测结果表明,第2代共培养组口腔黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比>95%。结论口腔黏膜细胞在有灭活的3T3成纤维细胞存在时可成功培养和扩增,为进一步将其作为种子细胞构建组织工程化尿道奠定了良好的基础。     

温肾中药对原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖的影响

目的观察温肾中药对雌二醇和孕酮所致的原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖的影响。方法采用消化法进行正常人乳腺上皮细胞分离及原代培养。在相差倒置显微镜和透射电镜下对细胞进行形态学鉴定。应用雌二醇和孕酮干预以促使正常人乳腺上皮细胞增殖,给予不同浓度温肾中药及他莫昔芬进行药物干预。采用MTT法检测不同浓度、不同药物干预下乳腺上皮细胞的增殖情况。结果原代培养正常人乳腺上皮细胞经形态学鉴定符合正常人乳腺上皮细胞的形态学特征。浓度均为1×10-5g/L的雌二醇和孕酮混合培养液可以明显促进正常人乳腺上皮细胞增殖。高浓度温肾中药能明显促进原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖,而低浓度温肾中药则可抑制其增殖。他莫昔芬对原代培养正常人乳腺上皮细胞增殖无明显影响。结论雌二醇和孕酮可以促进正常人乳腺上皮细胞增殖。温肾中药调节正常人乳腺上皮细胞增殖的作用与药物浓度相关。     

含AB型血清培养体系人角质形成细胞培养

目的：探讨人体角质形成细胞的培养技术，观察人角质形成细胞生长的过程，为培养角质形成细胞膜片提供新的方法。方法：采用改良后的含胎牛和人AB型血清培养体系进行人角质形成细胞的培养。结果：含人AB型血清培养体系培养的角质形成细胞5d融合达70％，9d达90％，11d完全融合，细胞分裂指数高峰在9d左右，可达1．1％，而不合AB型血清组培养的细胞5d后即出现退化样生长，不形成细胞膜片。进一步对含A13型血清的不同培养系统进行培养，将增殖高峰期培养的角质形成细胞应用MTT比色法测细胞增殖活性，进行比较，P〉0．05，表明添加F12、TC199、1640后对培养的角质形成细胞增殖作用无差异。结论：人AB型血清能够对体外培养的角质形成细胞生长起到刺激作用。     

人角质形成细胞体外分离与无血清培养的实验研究

目的探讨一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法,为角质细胞的多方面研究提供细胞来源。方法采取两步消化法对皮肤进行消化以获取角质形成细胞,采用无血清培养技术进行角质细胞的体外培养,进行细胞形态学观察以及生长曲线的绘制与分析。结果分离酶和胰蛋白酶联合两步消化法能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,培养后细胞融合时间短,同时又能够避免成纤维细胞的污染,可获取较多高纯度的角质形成细胞。角质细胞无血清培养可以在体外快速稳定增殖,并在多次传代后保持了正常形态。结论两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

组织工程化皮瓣的构建

目的应用脂肪组织来源干细胞(ASCs)在体外构建组织工程脂肪并与已构建的复合皮组装培育,试构建出含脂肪层的组织工程化皮瓣。方法(1)构建组织工程脂肪从脂肪组织中分离培养ASCs并进行三系分化诱导鉴定。ASCs与胶原凝胶混合并进行体外成脂诱导,诱导15 d后分别进行倒置显微镜、油红O染色及HE染色观察。(2)构建复合皮从包皮组织中分离培养表皮细胞(Kc)和成纤维细胞(Fb)。Fb与胶原凝胶混合后培养5 d,将Kc接种到含有Fb的凝胶表面,在液面下培养4 d后移至气-液界面继续培养10 d形成复合皮。(3)构建含皮下脂肪组织的3层结构的皮肤复合组织将培养的复合皮与脂肪组织按正常皮肤结构顺序组装后继续培养3 d并行HE染色观察。结果(1)ASCs具有成脂、成软骨和成骨分化能力。ASCs凝胶复合物体外成脂诱导15 d后,可见细胞内充满圆形脂滴,呈单房或多房形,油红O染色及HE染色均显示为成熟脂滴。(2)经过气-液界面培养后,Kc成层分化,形成基底上层。(3)组装培育后的皮肤复合组织分3层,表层Kc成层分化并形成基底上层;中层和底层连接处细胞聚集;成脂分化的ASCs位于底层。结论分别应用Kc、Fb和ASCs三种细胞,在体外构建出组织工程化脂肪和复合皮,且按序组装培育,可构建出组织工程化皮瓣。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的 :建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法 :采用两步消化法对皮肤进行消化 ,获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养 ,进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果 :该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞 ,且在体外可快速稳定增殖。结论 :两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法